常见免疫方法分析及三项

常见免疫方法分析及三项（丙 肝、艾滋、梅毒）检测 1 总述 第一节 免疫学简介 第二节 免疫学检测方法 第三节 艾滋病及检测 第四节 丙型肝炎及检测 第五节 梅毒及检测 2 一、免疫（ Immune）的定义 n 免疫的最初概念： 免除瘟疫 n 免疫的传统概念：抗感染免疫 n 现代免疫的概念： 是机体识别 “自身 ”与 “非己 ”抗原 ， 对 “非己 ”抗原产生排斥作用 ，对自身抗原形成天 然耐受的一种生理功能。 第一节 免疫的基本概念 3 浆细胞粒细胞 单核细胞 巨噬细胞 T细胞 B细胞 免疫球蛋白 补体 细胞因子 4 二、免 疫 的 功 能 免疫功能是免疫系统在识别和清除 “非己 ”抗原的过 程中所产生的各种生物学作用的总称。主要包括： 1.免疫防御（ Immunologic defence)： 是机体针对外来病原体的抗感染功能。正常时 可防御病原体的感染；防御功能过强可产生超敏反 应，过弱则表现为免疫缺陷。 5 2.免疫自稳 (immunologic homeostasis)： 是免疫系统维持机体内环境相对稳定的生理功能 。 正常：可及时清除体内损伤、衰老、变性的血 细胞和抗原抗体复合物，而对自身成 份保持免疫耐受； 异常：可发生生理功能紊乱、自身免疫病等。 6 3.免疫监视 (immunologic surveillance)： 是机体免疫系统识别、清除体内突变、畸 变细胞以及被病毒感染细胞的生理性保护作用 。 丧失：机体突变细胞失控，可能导致肿瘤 发生或出现病毒的持续感染。 7 8 第二节 免疫学检测技术 免疫检验可分为两部分： 一部分为利用免疫检测原理与技术检 测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细 胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质； 另一部分是利用免疫检测原理与技术 检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微 量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。 9 发展进程的主要阶段 自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应） 加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术） 标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性 半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程 标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合 10 免疫球蛋白 11 12 凝集反应 13 目前常用的目前常用的 ELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免疫吸附试验） 14 15 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 待测样品待测样品 标记抗体或抗原标记抗体或抗原 洗涤去除未结合的反应物洗涤去除未结合的反应物 发光底物发光底物 仪器检测仪器检测 包被抗体或抗原的反应管包被抗体或抗原的反应管 反应反应 30-60分钟分钟 反应反应 0-5分钟分钟 16 固相 抗原 待测 抗体 金标记 抗原 针对金标 记抗原的 抗体 快速检测（层析法）原理 T C T C 阳性 阴性 17 18 放射免疫技术 化学发光免疫技术 荧光免疫技术 流式细胞免疫技术 酶联免疫技术 免疫印迹技术 速率散射免疫技术 单克隆抗体技术 电化学发光免疫技术 免疫检验涉及的主要技术 19 20 第三节 艾滋病 1.HIV病毒体呈球形，直径 约 100120nm。 2.电镜下成熟的 HIV-1呈现 一致密的圆柱状核心和一个 病毒包膜。 3.病毒核心由病毒 RNA、核 心结构蛋白和病毒复制所必 须的酶类组成。 4.HIV的 RNA为两条相同拷 贝（完全同源）的正股 RNA 链 。 21 一 . HIV病原学基础 病毒分类与分型： v HIV分为 HIV-1和 HIV-2二个型别。 v HIV-1 分 M组（主要亚型组）、 O亚型组（外亚型） 和 N亚型组。 v M组又分为 A、 B、 C、 D、 F1、 F2、 G、 H、 J、 K共 10 个非重组亚型，另外还有 14个流行重组亚型（ circulating recombinant form,CRFs） ，包括 CRF01- CRF14。 v HIV-2型至少有 A-G7个亚型 。 （一）形态与结构 22 v HIV基因组 :两条正股 RNA链 ,在 5端通过部分碱基互 补配对而成双聚体。 v 病毒基因全长约 9.7kb，含有 gag、 pol、 env3个结构 基因和 6个调节基因，分别称为 tat(反式激活因子 )、 rev(毒粒蛋白表达调节子 )、 nef(负调控因子 )、 vpr(病 毒 r蛋白 )、 vpu(病毒 u蛋白，仅存在于 HIV-1，在 HIV- 2为 vpx)和 vif(毒粒感染性因子 )。 v 由于 HIV基因结构复杂而被称为复杂逆转录病毒。 基因结构 23 HIV-1的基因结构 . 24 HIV的结构蛋白 v gag基因：先编码一个 55KD的前体蛋白（ P55），在蛋白 酶作用下裂解形成内膜蛋白（ P17）衣壳蛋白（ P24）和 P15蛋白。 P15蛋白再进一步裂解成与病毒结合的核壳蛋白 P9和 P7 。 v env基因：编码包膜糖蛋白，先编码一个 88KD的蛋白， 经糖基化后分子量增至 160KD，即包膜糖蛋白的前体 gp160。在蛋白酶作用下，切割成 gp120 和 gp41。 v pol基因：编码酶蛋白，包括逆转录酶（ p66/p51）、蛋 白水解酶（ p10）和整合酶 (p32)，与病毒复制有密切的 关系。 25 gp120暴露于病毒包膜之外，称外膜糖蛋白，感 染细胞时是病毒与宿主细胞表面的 CD4受体结合 的部位。 gp41是跨膜糖蛋白，具有介导病毒包膜与宿主 细胞膜融合的作用。 当 gp120与受体结合后即与 gp41分离，暴露出 gp41，在辅助受体协同作用下通过膜融合使病 毒核心导入细胞。 26 （二）病毒在体内的动态分期 v病毒进入体内在 2天内到达局部淋巴结， 5天 内进入血液循环。 v其结果是导致全身性播散，到达脑部和淋巴 组织。 1、 体内播散期 27 v从暴露于 HIV到出现急性症状的时间一般是 2- 4周（ 1个月） ，少数病例可长达 10个月。 v在急性感染的数天内，淋巴结内被激活的淋 巴细胞中出现高水平的病毒复制，在很短的 几天内出现 P24抗原血症和高滴度病毒血症， 病毒 快速高水平复制， 血浆中可检出 107 /ml 个病毒 RNA分子。 CD8+细胞数上升，伴有短 暂的 CD4+细胞计数下降。 2、 HIV感染急性期 28 v特异性体液免疫应答出现后，血浆中 HIV RNA 的滴度下降到 病毒载量定点（ set point）水 平 ，急性 HIV感染的症状消失 . v病毒载量定点水平和预后有很大关系。 早期治 疗的目标之一是重新设定 定点水平 ，使其保持 较低水平。 v急性期 HIV传播的效率最高， 56-92% 的 HIV感 染是由处在这个时期的 HIV感染者传播的。 v从 HIV感染到产生抗体（或血清抗体阳转）称 为 “窗口期 ”，一般为 2-3 月，最长 6个月。 29 v病人无临床症状，体检时无异常，少数可查到 “持续性全身性淋巴腺病 ”（ PGL），定义为肿 大的淋巴结至少发生在两处且不是腹股沟淋巴 结。 v由于细胞外的病毒被滤泡树突状细胞（ FDC） 扑捉而进入生发中心，细胞内的病毒大部分处 于潜伏状态，所以淋巴结中病毒浓度很高。 v淋巴组织是病毒的主要藏身处，外周血中的病 毒载量相对不高。随着疾病的进程，淋巴结结 构被破坏，更多的病毒被释放。 3、 无症状感染期 30 艾滋病前期症状包括鹅口疮、口腔毛状 黏膜白斑病、发热、体重减轻等，但还不是 艾滋病的典型症状。 4、艾滋病前期、艾滋病前期 5、艾滋病期 当患者出现典型症状 (ARC)时， CD4+ 细胞计数通常降至 200/ul以下，血和淋巴结 中的 HIV又上升到相当高的水平，同时细胞 免疫水平降低。 31 v指 CD4计数 2个月 2 重组或多肽 间接 3-4 周 3 重组 +多肽 夹心 4-7 天 4 抗原 +抗体 夹心 抗原 5pg 43 HIV抗体筛查实验流程图 样本 阳性反应 一阴一阳 阴性反应 筛查检测 均阳性反应 重复检测 均阴性反应 送确认实验室进行确认 阴性报告 筛查试剂 原有试剂加另外一种筛查试剂 44 筛查检测要点筛查检测要点 - 严格按照说明书操作严格按照说明书操作 -严格遵守实验室操作规程严格遵守实验室操作规程 - 严格防止交叉污染，吸管、枪头单独使严格防止交叉污染，吸管、枪头单独使 用用 - 严格执行实验室生物安全制度严格执行实验室生物安全制度 45 筛查结果及复检筛查结果及复检 - 筛查（筛查（ -） 出具出具 “ HIV抗体非反应性抗体非反应性 ” 报告报告 筛查（筛查（ +） 出具出具 “ HIV抗体待复查抗体待复查 ” ， 不能出阳性报告不能出阳性报告 - 复检：原有试剂另外一种不同原理或不同厂家试剂复检：原有试剂另外一种不同原理或不同厂家试剂 （进口试剂：生物酶里埃（进口试剂：生物酶里埃（ AKZO），可只用），可只用 原试剂复检）原试剂复检） 两种均阴性：报告两种均阴性：报告 “ HIV抗体阴性抗体阴性 ” 一阴一阳或两种均阳性：出具一阴一阳或两种均阳性：出具 “ HIV抗体待复查抗体待复查 ” ，送确，送确 证实验室。证实验室。 - 复检可在筛查中心实验室；也可在本实验室复检可在筛查中心实验室；也可在本实验室 46 （二）（二） HIV抗体检测：确认抗体检测：确认 免疫印迹实验（免疫印迹实验（ Western Blot ）的原理）的原理 47 HIV抗体确认实验检测程序 筛查阳性样本 免疫印迹法 1/2混合型 阴性反应 HIV1阳性反应 可疑反应 阴性报告 HIV1阳性报告 每三个月随访一次，共 2次 出现 HIV2指示带 阳性反应 阴性反应 HIV2鉴定、报告 可疑反应 阴性报告 免疫印迹法 HIV2型 48 结果判断（一） vHIV-1阳性 v技术规范： 至少有 2条 env带：（ gp41+gp160） /（ gp41+gp120） 至少有 1个 env（ gp41、 gp160、 gp120） p24 v试剂盒提供的阳性判定标准 49 结果判断（二） vHIV抗体阴性（ -）：无 HIV抗体特异带出现， 或仅有 p17。 vHIV抗体不确定（ ）：出现 HIV特异性抗体带 ，但带型不足以确认阳性者。 50 图 2 11例窗口期感染者样本的 WB 条带带型。 51 造成 WB假阳性或不确定的原因 v 1. 18个月以内的抗体阳性婴幼儿 v 2. HIV感染急性期 v 3. 晚期 AIDS病人 v 4. HIV疫苗接种 v 5. 自身免疫病 v 6. 肾衰竭和血透析 v 7. 遗传性胰腺囊肿 v 8. 多次怀孕或输血 v 9. 肝病 v 10. 注射用药 v 11. 乙肝、狂犬等疫苗注射 12. 其他人类逆转录病毒 13. 线粒体核酸和 T细胞白细胞抗原引起的抗体 14. 高丙种球蛋白血症（全身性红斑狼疮） 15. 正常人类核糖核蛋白 52 假阴性结果 v 指 EIA+WB的假阴性 v 原因 急性感染后的抗体迟反应 不同 HIV毒株型 发病晚期抗体消失 窗口期：几周到 6个月，与当地 HIV流行率有关 HIV亚型 实验室操作 53 v有研究证明：即使在无高危行为的普通人 群中， WB不确定率 10-15%，甚至高达 32 . P24条带最常见。 v统计学分析表明：在 S/CO比值 6时，抗 体筛查实验阳性样本中，确认 “可疑 ”和 “阴 性 ”的两组样本之间无显著性差异。 参考文献：黑发欣，张启云，孙伟东，等 . HIV抗体筛查实验阳性 -确认实验 “可 疑 ”和 “阴性 ”样本的对比分析 . 中国艾滋病性病 , 2006, 12 (1) : 4-6. 54 不确定标本的处理 v 按照 全国艾滋病检测技术规范（ 2004年版） 的 要求，只能作 “ 3个月后复检 ” 的处理，三个月后复 检 1次，连续 2次，共 6个月。 v 其转归有两种可能：仍呈现不确定或阴性，则诊断 为 HIV抗体阴性；带型发生进展，符合 HIV抗体阳性 判断标准，则诊断为 HIV抗体阳性。后者是真正的 窗 口期感染者 （一般为 2-3个月，最长 6个月） ，只占 很小的比例；大多数为非感染者，但由于 WB反应的 敏感性而出现条带。 参考文献：黑发欣 , 张启云，孙伟东，等 . 病毒载量检测有助于排除人免 疫缺陷病毒抗体可疑结果中的非感染者 . 中华预防医学杂志， 2008， 42（ 1）： 43 46. 55 18个月内 HIV抗体呈阳性的婴幼儿，因可 能携带母亲的抗体，不能确定是否感染，应于出 生后 18个月复查。不可轻易放弃婴幼儿的生命！ 56 第四节 丙型肝炎 HCV的生物学性状 v 40 60nm球形 v有包膜 v+ssRNA 57 HCV的基因结构： +ss RNA、 9.5 kb，有 9个基因区组成 HCV的基因型有 6种： 型：欧美流行 ：亚洲，中国 - 型 HCV.swf 58 丙型肝炎的特点 v我国丙肝病毒携带者的比例在 2%5% v随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高 v易感人群感染 HCV后，慢性化的比例高达 50% 以上 v乙肝患者容易重叠 HCV感染 59 HCV的致病性与免疫性 v传播途径似 HBV v是引起输血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因 v潜伏期： 48周 v无症状 HCV携带者和慢性丙肝者多见 v肝外损伤：肾小球肾炎 v免疫力不牢固 60 20 位患者 20% 痊愈 HCV 感染的预后 100 位 HCV 急性感染 80 位患者 80% 持续感染 24 位患者 30% 稳定，慢性，无进展 Adapted from Alter HF, Seeff LB. Semin Liver Dis. 2000;20:17-35. 28 位患者28 位患者 56 位患者接受抗 病毒治疗 持久性应答 (50%) 肝脏疾病终末期，肝细胞 癌，肝脏移植，死亡 治疗失败 (50%) 30% 呈严重进展40% 有不同程 度的进展 32 位患者 24 位患者 61 检测程序 62 63 第五节 梅毒螺旋体 又称苍白密螺旋体 梅毒的病原体（ STD之一） 生物学性状 菌体细长，两端尖直， 8-14个 螺旋，镀银染色呈褐色，运动 活泼（暗视野） 人工培氧不成功 抵抗力极弱（温度、干燥）， 抗生素敏感 64 65 66 v 先天性梅毒 流产、死胎 梅毒儿（皮肤病变、锯齿形牙、角膜炎、 先天耳聋） v 后天性 梅毒分三期（潜伏期 3W） 一期梅毒：外生殖器 无痛性硬下疳 （丘疹 硬结 溃疡），病灶及渗出物中大量螺旋体 传染性级强 二期梅毒：全身皮肤、黏膜 梅毒疹，周身淋 巴结肿大 （内有大量螺旋体）， 传染性强 三期梅毒（晚期梅毒）：皮肤黏膜溃疡性坏 死，侵犯内脏（心血管、神经系统），病灶 中无螺旋体， 传染性小，破坏性大 67 梅毒疹 68 梅毒的免疫性 v 感染梅毒后，首先产生 IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染 2周后 即可测出，早期梅毒抗梅治疗 3 9个月后或晚期梅毒治疗 2 年后，大部分病人 IgM可转阴性，再感染时又出现阳性，故 IgM型抗体的存在是活动性梅毒的表现 v 另一种具有抗体性质的物质叫反应素（ reagin），是梅毒螺 旋体破坏人体组织过程中释放出的一种抗原性心磷脂刺激机 体所产生的抗体。反应素一般在感染后 5 7周（或下疳出现 后 2 3周）产生经正规治疗后可逐渐消失。 v 感染梅毒四周左右产生 IgG型抗梅毒螺旋体抗体，即使经足 量抗梅治疗，梅毒螺旋体抗原消失后很长时间， IgG抗体仍 可通过记忆细胞的作用继续产生，甚至终生在血清中可测出 69 梅毒检测技术 v梅毒的病原学检测 v非特异性梅毒血清学试验 v特异性梅毒血清学试验 70 暗视野显微镜检查法 ：目前国内主要的梅毒病原学诊断方法。 是最特异的一期梅毒检测方法。取材部位以硬下疳为主，亦可 从宫颈、阴道、淋巴结等处取材。阳性可确诊，阴性不能排除 梅毒（阴性结果须在不同的 3天采样检测才能做出）。暗视野 显微镜法诊断的准确性受操作者的经验、病灶中活螺旋体的数 量及口腔、肛门破损处存在的非致病性螺旋体等因素影响 镀银染色法 ：与暗视野检查法的临床意义基本相同。利用梅毒 螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，再通过普通高倍 显微镜进行观察 直接免疫荧光法（ DFA)：是目前国外采用较多的方法，其特异 性及敏感性均优于暗视野检查法。将特异性的抗梅毒螺旋体单 克隆抗体用荧光素标记，如标本中存在梅毒螺旋体，则通过抗 原抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒 螺旋体 梅毒的病原学检测 71 非梅毒螺旋体抗原血清试验 ： 是以心磷脂、卵磷脂及胆 固醇作为抗原检查血清中的反应素，用于初筛试验及疗 效观察。可以分为以下四种 试验 ，原理基本相同： 1、性病研究实验室玻片试验（ VDRL) ： 由于试剂需现配 现用，故而国内实验室很少采用。但 VDRL是诊断神经 性梅毒在最特异的血清学方法 2、快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)： 在特制的纸片 上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现 凝集，用肉眼可观察结果。 3、甲苯胺红试验（ TRUST)： 在试剂中加入甲苯胺红代替 炭粉 颗粒，使结果更易于观察。 4、不加热血清反应素试验（ USR) 非特异性梅毒血清学试验 72 非梅毒螺旋体抗原血清试验 的缺陷 1、特异性：由于在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾 病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕妇女中均可出现反应素 ，所以此类试验有时会出现假阳性反应 2、敏感性：非梅毒螺旋体抗原血清试验有时出现弱阳性或阴性结 果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试 验，如出现阳性结果，则为抗体过量引起的前带现象。 12的 二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒假阴性反应。此外，由 于感染梅毒后反应素的出现时间晚于特异性梅毒螺旋体抗体， 晚期梅毒反应素又可能转阴，再加上这类试验对隐性梅毒也不 敏感，因此用此类试验进行梅毒筛查时，存在着相当数量的漏 检 非梅毒螺旋体抗原血清试验 的 优点 1、 非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性的患者往往是梅毒现症感染者 ，临床上即可开展治疗 2、 非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随成功的治疗而逐渐下 降，故可以作为疗效观察的指标 3、此类方法价格低廉 非特异性梅毒血清学试验（一） 73 用定量非梅毒螺旋体抗原血清试验 进行疗效观察 1、 治疗成功：早期梅毒患者在治疗后 6个月内症状消失且非 梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少 4倍的下降。晚期梅 毒或隐性梅毒患者在治疗后 1224个月内非梅毒螺旋体抗 原血清试验滴度有至少 4倍的下降 2、治疗失败：治疗后症状持续或重新出现；治疗后非梅毒螺 旋体抗原血清试验滴度反而上升了 4倍或以上；非梅毒螺 旋体抗原血清试验初始滴度较高（ 1:32或以上）但在六个 月内没有达到 4倍的下降。抗梅毒治疗失败的病人应考虑 合并 HIV感染及神经梅毒的可能性 3、血清固定：经正规治疗后，梅毒患者 非梅毒螺旋体抗原血 清试验一般都会转为阴性，但有 13% 的 病人即使经足量 抗梅治疗，非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度仍持续呈低滴 度阳性，这种现象称为血清固定，其原因尚不明了。血清 固定患者的滴度重又上升则提示再次感染梅毒 非特异性梅毒血清学试验（二） 74 梅毒螺旋体抗原血清试验 ： 用梅毒螺旋体作为抗 原检测血清中的抗螺旋体 IgM和 /或 IgG抗体，其敏 感性和特异性均高于非梅毒螺旋体抗原血清试验 ，但不能用作疗效观察的指标。常用的有以下五 种方法： 1、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试