肠道微生物研究进展

研究方向：动物营养与饲料科学 消化道微生物 The discovery of microorganisms The first person to Antony van Leeuwenhock (1632-1723)吕文 虎克 Accurately observe and describe microorganisms The history of Microbiology Louis Pasteur working in his laboratory Louis Pasteur (1822 1895) Pasteur (1857) demonstrated that lactic acid fermentation is due to the activity of micro-organisms Pasteur (1861) conflict over spontaneous generation birth of microbiology as a science Pasteur (1881) developed anthrax （炭疽） vaccine Pasteurization 发现并证实发酵是由微 生物引起的 彻底否定了 “ 自然发生 ” 学说： 曲颈瓶试验 免疫学 预防接种： 狂犬疫苗 巴斯德消毒法： 60- 65 作短时间加热处理 ，杀死有害微生物 Robert Koch in his laboratory The recognition of microbial role in disease Robert Koch (1843 1910) The discovery of microbial effects on organic and inorganic matter The Russian microbiologist Winograsky discovered that soil bacteria could oxidize iron, sulfur and ammonia to obtain energy, and also isolated nitrogenfixing bacteria. Beijerinck made fundamental contributions to microbial ecology. He isolated Azotobacter（固氮菌） and Rhizobium（根瘤菌） . Alexander Fleming (1881-1955) Alexander Fleming discovered the antibiotic penicillin. He had the insight to recognize the significance of the inhibition of bacterial growth in the vicinity of a fungal contaminant. 抑菌试验 Our world is populated by invisible creatures too small to be seen with the unaided eye. These life forms, the microbes or microorganisms, may be seen only by magnifying their image with a microscope. Branches of Microbiology Bacteriology Protozoology Parasitology Microbial Morphology Mycology Virology Phycology or Algology Microbial physiology Microbial taxonomy Microbial genetics Molecular biology Microbial ecology 微生物参与一些有机物和无机物的变化（如自然界中 发生的发酵，碳、氮和硫的循环）； 微生物的研究：显微镜，分离和纯培养；分子生物学 ； 微生物对其他生物和人类健康产生影响。 微生物是一类繁殖快、分布广、体形微小、结构简 单、肉眼看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜 放大数百倍、几千倍甚至几万倍才能看清的微小生物。 第一节 微生物概述 1非细胞型微生物：病毒属此类 ， 最小，无细胞结构 ，须在活细胞内增殖。 2原核细胞型微生物：细菌、放线菌、螺旋体、支原 体、立克次氏体和衣原体属 。 此类仅有核质，无核膜 和核仁，缺乏完整的细胞器。 3真核细胞型微生物：真菌 和原虫 属此类 。 细胞核有 核膜、核仁和染色体，胞浆内有完整的细胞器。 原核生物界（ Procaryotae） （ 1）光能营养原核生物门 （ 2）化能营养原核生物门 真核微生物（ Eucaryotic microbes） 真菌 (Fungus) 原虫 (Protozoa) 病毒（ Virus） 艾滋病毒 SARS 病毒 传染性软疣病 水痘病毒 蘑菇 孢子囊 灰指甲 瘤胃原虫 Ophryoscolex 细菌 人体细菌 划线分离 细菌感染 广泛分布于自然界中，无论是高山平原、江河湖海 、动植物体内外，乃至一般生物无法生存的臭氧层、海 洋底和岩芯中，都有微生物存在 。 一、概述： 肠道微生物：超过 99%是细菌，数量约为 1011个 ， 500 1000个种类。包括 97%严格厌氧菌和 3%需氧菌 。 肠道微生物数量（ 1012-1014） 体表面积微生 物数量 =10*人体细胞数目（ 1011个） 微生物基因数量 =100*人体基因数量（ 3.5万个 ） 主要包括细菌，真菌和原生动物，此外还有少数的噬菌 体 瘤胃中的细菌：占瘤胃生物量的 50% 80%， 1011-1012 个 /ml 真菌： 103 105个游动孢子 /mL。生活周期约 24 32小 时 原虫： 105 106个 /mL，大小 40 200 m 螺杆菌 消化链球菌属 肠细菌 放线菌 牛棒杆菌 可培养微生物可培养微生物 不可培养微生物不可培养微生物 (16S rRNA gene diversity) 1.维持肠道微生态平衡 平衡失调：生产性能下降和发病。 正常情况下：厌氧菌为优势种群，占 99%以上。主要包括 拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、优杆菌等；需氧菌及兼性厌 氧菌只占 1%。 2.生物夺氧 需氧微生物，特别是芽胞杆菌消耗肠道内的氧气，形成厌 氧环境，有利于乳酸杆菌等有益微生物生长，抑制有害需氧 菌和兼性厌氧菌的增殖，防止发病。 3.生物颉颃作用 有益微生物与病原微生物产生颉颃作用。抑制病原微 生物粘附到肠粘膜上皮细胞上，随粪便排出体外。 4.增强机体免疫功能 提高抗体水平和巨嗜细胞的活性，刺激免疫、激发机 体体液免疫和细胞免疫，增强机体的免疫力和抗病力。 5.产生营养物质 有益微生物可产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素 酶等，降解饲料中蛋白质、脂肪和复杂的碳水化合物。 有益微生物能产生各种营养物质，如维生素、氨基酸、 未知促生长因子等，参与机体新陈代谢，可促进动物生 长和提高生长性能。 三大类：有益菌、有害菌和中性菌。 机体健康与肠道内益生菌群结构息息相关。肠道 菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主 与环境之间始终处于动态平衡状态，宿主表现为不致 病。 研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到 70%，普通人则是 25%，便秘人群减少到 15%，而癌症病 人肠道内的益生菌的比例只有 10%。 四个方面： 1）机体因素（肠道的酸碱性，胆汁及消化酶的分泌， 肠道的蠕动，肠道黏液的分泌，肠道表皮的脱离等）及 环境因素（压力，出差等）。 2）食物（可消化的食物与不可消化的纤维，药物等） 。 3）细菌自身因素（细菌的黏附能力，繁殖能力，营养 需求量，抗消化酶能力等）。 4）细菌之间的相互作用（营养竞争，相互抑制作用， 协同作用等）。 放线菌 Herbivores 70% of dietary energy can be from microbial fermentation cf. Humans 10% 可培养微生物可培养微生物 不可培养微生物不可培养微生物 (16S rRNA gene diversity) 核酸探针检测技术 荧光原位杂交 ( FI SH )技术 限制性片段长度多态性标记 RFLP 随机扩增多态性标记 RAPD 聚合酶链式反应及相关技术 反转录 PCR技术 (RT -PCR) 竞争 PCR (c-PCR) AFLP标记 RAP- PCR 电泳分离及其显示方法 溴乙锭 (EB)染色方法 聚丙烯酰氨凝胶电泳 (PAGE分离 )银染方法 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 基因重组技术 基因芯片技术 16S rDNA PCR 1 kb 16S rRNA 5S rRNA23S rRNA tRNA-Glu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DNA V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 Extraction of nucleic acid and amplification of 16S rRNA genes Lysis, DNA/RNA extraction DNA/RNA purification PCR/RT-PCR amplification of 16S rRNA or functional genes DGGE, TGGE, RFLP, t-RFLP, SSCP Cloning Sequencing Identification Phylogenetic analysis Fingerprinting: M 1 7 16 28 67 118 Limed Limed 1 7 16 28 67 118 1 7 16 28 67 118 Unlimed 1 7 16 28 67 118 M Unlimed Rangel-Castro et al. 2005 Env Micro 7, 544-552. saf1_201 TM29Acidobacterium capsulatum env.MC103 saf1_112 sl1_220 sl2_715 env.MC101 sl1_221 env.MC27 sl1_214 sl3_811 sl2_703 saf1_109 SBR1078 saf1_208 saf3_004 SBR1020 sl3_614 saf2_419 2 Clones saf1_312 sl1_009 SBR2086 saf2_414 sl2_706 clone DA008 2 Clones saf2_112 saf2_210 sl2_710 sl1_207 Holophaga foetida saf1_111 clone DA052 saf1_118 sl3_809 sl3_806 saf3_223 sl1_018 saf2_415 sl3_602 saf3_020 sl1_211 env.MC18clone DA101 sl3_802 Verrucomicrobium spinosum saf3_022 Deinococcus radiodurans saf3_110 Thermus aquaticus 2 Clones sl2_717 sl1_224 Chlorobium vibrioforme saf3_018 Stigmatella aurantiaca sl1_105 sl3_601 Flexibacter canadensis sl1_215 Flexibacter flexilis Runella slithyformis sl1_222 sl1_021 saf2_118Cytophaga johnsonae sl1_218 sl1_005 sl1_201 Flavobacterium ferrugineum sl1_212 SBR2061 sl3_619 Sphingomonas Sporocytophaga Verrucomicrobium Acidobacterium Sourhope 1 Sourhope 2 Holophaga Sourhope 3 Sourhope 4 Deinococcus/Thermus Sourhope 5Green sulphur bacteria Cytophagas-Flexibacteria -Bacteroides McCaig et al., 1999 AEM 65, 1721- 1730 Strain able to degrade dewaxed cotton (007C)* Strain defective in cotton- degradation (007S)* * Stewart CS et al (1990) J. Appl Bacteriol; FEMS ML 一、肠道微生物与寄主的共生关系类型 互利共生（ Symbiosis），同食共生（ Commensal）和 致病（ Pathogenic） 宏基因组表明：肠道微生物整体丢失或过度繁殖会导 致炎性肠病 肠道微生物对肠道免疫反应的影响 动物肠道黏膜免疫系统与高密度的肠道微生物长期对 抗、合作的结果。 肠道微生物对免疫系统发育的影响 无肠道微生物时， CD4T淋巴细胞（ CD4+T细胞）少 。 肠道微生物对寄主治疗肠炎的影响 如双歧菌、乳酸菌和链球菌都有治疗肠炎的作用 肠道微生物对寄主治疗代谢紊乱的影响 肠道微生物对寄主肠道发育的影响 无菌饲养的动物肠组织的发育不健全；易受病原菌 侵袭。 肠道微生物对寄主能量平衡的影响 肠道微生物与肥胖之间的关系。 微生物区系可以直接导致宿主肝脏甘油三酯产量增加 抑制肠道表达的脂蛋白脂酶 (LPL)抑制剂的表达促进 脂肪细胞中甘油三酯储存 微生物