基因组序列的功能解析

基因组序列的功能解析 1 第一节 在基因组中识别基因 一、识别候选基因 1. 生物信息分析基因的序列特征 双链 DNA有 6个 ORFs阅读方式 （ 1） 开放阅读框架 (ORF， open reading frame) 从起始密码至终止密码 2 （ 2） ORF的平均长度 大肠杆菌： 317 个密码 , 酵母菌： 483个密码 , 人：约 450个密码 . 在原核生物中直接寻找 ORF有效。 在真核生物中不能直接寻找 ORF。 3 在真核生物中不能直接寻找 ORF的原因： 62% 的人类基因被间隔开 有内含子， 断裂基因 许多外显子短于 100 个密码，甚至有些少 于 50个密码 4 （ 3）对 ORF扫描软件的修正 1）密码偏爱 在某种生物中并不是所有密码都被均等使用。 2）外显子 -内含子边界 3）上游调控序列 : CpG 岛 : 4050% 的人类基因和脊椎动物基因 中， 5上游的 GC含量高 5 4）寻找同源序列 到其他模式生物中寻找同源序列。 如果模式生物的同源序列已经被鉴定为某个功 能基因的话 主要用途是对新序列进行功能分析 . 6 2. 通过实验技术识别基因 检测是否转录 RNA分子 . 起始密码上游的数 10个碱基，终止密码 下游的上百个碱基 . 包括： 7 （ 1）核酸杂交实验 1） Northern blotting 选择性剪接或者多基因 家族都能产生多个 RNA转录物 mRNA 一般都是从一个 组织或器官中得到的 8 2） zoo-blot (garden blot） 用 Southern blot 把一个物种的 DNA片断与相关 的其他物种的 编码 基因 DNA杂交 Probe sample 9 （ 2） cDNA 测序 （ 3） PCR技术 从 cDNA文库（ cDNA library）中筛选。 1） RT-PCR (reverse transcriptase PCR) 2） RACE (rapid amplification of cDNA ends ) 10 RACE 11 （ 3） 寻找外显子 -内含子边界 . 1） mRNA-DNA杂交 2）外显子捕获 需要特殊的载体 12 二、确定某个基因的功能 1. 生物信息学分析预测基因功能 通过生物信息学分析和实验研究 . 同源性查询 : 原理： 功能相似的基因具有相似的序列 （ 1）序列同源性反映了共同祖先的进化关系 直系同源体 （ Orthologous） : 来自不同的物种的同源基因 旁系同源体（ Paraloguos） : 来自同一个生物的同源基因 13 （ 2） 同源性分析揭示基因或片断的功能 可以分析 DNA序列，但一般需要把 DNA转化成 氨基酸序列 进行分析。 核酸序列 76% 相同 (偶然事件 ) 氨基酸序列只有 28% 相同！ 1）完整序列比对 14 2）部分序列分析 寻找共同拥有的 结构域 （ domain） . 如 tudor domain 结构域是序列功能的核心。 15 （ 3）同源性分析在酵母基因组计划中的应用 30% 是通过同源性 分析预测的 酵母基因组含有约 6000 个基因 , 其中 30% 是 通过常规的遗传实验确定的 . 16 2. 用实验确定基因功能 （ 1） 通过基因失活分析基因功能 将基因突变，观察由此引起的表型变化。 1）同源重组失活 “Loss of function” 17 酵母的删除盒 用抗生素抗性基 因替换酵母的某 一处基因组序列 18 基因敲除（ knock out）小鼠 胚胎干细胞（ ES cells） 注射到小鼠胚胎 嵌合体 互相交配 纯合体敲除小鼠 有些基因是至死基因，只 能得到杂合体 19 2）非同源重组的基因失活 1）转座子标签： 把转座序列插入到基因中，使基因失活。 让转座子带上应答元件，在外界的诱导下 转座。 缺点： 不能准确失活一个基因，因为转座是个随 机事件。 20 人工诱导转座： 给 Ty1 的上游加上半乳糖诱导的启动子 21 2） RNA干涉（ RNA interference ） 与目标基因序列互补的短双链 RNA能降解目标基 因的 mRNA. 在线虫 1号染色体上 ， 2769 个预测的基 因中的 2500 分别被 进行了 RNA干涉 22 缺点：在哺乳动物中只能对单细胞进行处理，因 为 RNA在体内的存在时间有限。 23 （ 2） 通过基因超表达分析基因功能 “Gain of function” 24 3. 未知基因编码的蛋白质功能的精细研究 （ 1）定向突变 删除或改变基因序列中的一部分 Site-directed mutagenesis(体外定点突变 ): 删除一段 插入一段 突变个别碱基 25 1）寡核苷酸定点突变 26 2）同源重组导入突变基因 两步取代： 第一步 : 用标记 基因取代原基因 第二步 :用突变基 因取代标记基因 失去标记 获得标记 27 （ 2）报告基因（ Reporter genes）和免疫组织化学 reporter genes 举例 确定基因表达的部位和时空特征 . 基因 基因产物 方法 lacZ -半乳糖苷酶 组织化学 test uidA -葡糖苷酸酶 组织化学 test lux 荧光素酶 生物发光 GFP 绿色荧光蛋白 荧光 28 1）报告基因）报告基因 2）免疫组织化学 测定待测基因的启动子 确定基因产物在细 胞内的位置 29 研究不同组织的不同发育阶段、不同疾病的转录 物和翻译产物 三、 研究基因组的整体活性 30 1. 研究转录物组 （ 1）基因表达系列分析（ SAGE） 鉴定细胞中的全部 mRNA 的相对丰度。 把 cDNA序列与基因组序列比较 把 mRNA 转为 cDNA 把 cDNA 文库中的每个克隆都测序 转录物组学 (transcriptomics )： 是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情 况及转录调控规律的学科 . 31 基因表达系列分析基因表达系列分析 (SAGE) 12-bp 短序列足够特异 412 = 16 777 216 bp Bsm FI切割 1014 bp的下游 . 5-AGCT-3 从每个 cDNA末端释放平均长 度 12 bp 32 （ 2） 基因芯片 cDNA DNA 33 2. 研究蛋白质组 研究一个细胞中全部蛋白质的技术。 （ 1）蛋白质组学 蛋白质电泳 第一向 : 区分分子量的标准电泳 第二向 : 区分电荷的标准电泳 双向凝胶电泳 : 34 质谱 鉴定蛋白质点的性质 . 基质辅助激光解吸飞行时间质谱 (MALDI- TOF): 质荷比 （ Mass-to-charge ratio）分析分子量， 然后推导氨基酸组成 35 36 （ 2）鉴定蛋白质的相互作用 如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的话 ，就能推测其功能。 噬菌体展示 噬菌体展示文库 : 将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表 达到噬菌体表面 37 38 酵母双杂交系统 39 （ 3）蛋白质相互作用图 画出蛋白质组中所有组分的相互作用图。 细菌 Helicobacter pylori: 画出了 1200 个相互作用 (占蛋白质组的一半） 酵母 1870 个蛋白之间的 2240个相互作用 40 The yeast protein interaction map. Red dots are essential proteins orange lead to slow growth yellow dots are not known green dots are non-lethal 41 四、比较基因组学 1. 通过比较基因组学作图 对一个物种的基因组的了解，可以帮助了解其 他物种的基因组 . 亲缘关系近的生物的基因组相似 . 同线型 （ Synteny） 不同生物的基因顺序的部分或者完全保守 42 小麦 : 16 000 Mb 水稻 : 430 Mb 禾本科基因组 河豚鱼 : 400Mb 基因数目相同 人 : 3500Mb 可以根据小基因组中的基因顺序来寻找和 发现大基因组的基因 43 2. 比较基因组学研究人类疾病 人疾病基因 酵母同 源物 酵母基因的功能 肌萎缩性脊髓侧索硬化