产耐热木聚糖酶的芽胞杆菌的分离鉴定 毕业论文.doc

产耐热木聚糖酶的芽胞杆菌的分离鉴定 摘要：从地热水中分离到1株产木聚糖酶的菌株。酶学试验表明分离得到的菌株产生的木聚糖酶最适反应条件为60 ，ph 78，在80 的条件下，孵育120 min仍具有70的活力，表明该酶具有较强的热耐受性。通过菌落形态分析和革兰氏染色鉴定确定该菌株为芽孢杆菌。关键词： 耐热木聚糖酶，芽孢杆菌， 革兰氏染色半纤维素是重要的植物多糖成分，是世界上数量仅次于纤维素的可再生资源。在自然界，分解半纤维多糖的微生物在半纤维素的循环再生利用中扮演着重要的角色（1-3）。木聚糖是半纤维素多聚糖家族的重要成员。木聚糖由呋喃木糖残基通过-1，4糖苷键聚合成线性的多聚骨架（4-5） 。微生物产生的木糖酶能将木聚糖水解成寡聚木糖和木糖（6）。由于木聚糖酶在半纤维多聚糖资源的利用以及工业应用方面的巨大潜力使其成为研究和应用领域的一个热点。耐热木聚糖酶在饲料工业，造纸业和印染工业中都有重要用途（7-11）。因而从自然界筛选产耐热木聚糖酶的微生物是耐热木聚糖酶的一个重要来源（12-13）。本试验采集地热水样品，采用营养体灭活的方法，筛选到产木聚糖酶的芽孢杆菌。对筛选的菌株的产酶特性进行了研究，并且结合菌落形态分析和革兰氏染色鉴定方法，确定筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株为短小芽孢杆菌。1 材料与方法11 材料桦木木聚糖购于sigma公司，其余生化试剂均为国产。12 方法121 菌株筛选参考文献报道方法（14）取杨凌地热水样品, 8o孵育30 min，涂布于含1木聚糖的固体培养基，45培养48 h用 01刚果红溶液染色1 h，用1 moll naci脱色1 h。选取有透明圈的菌落保存备用。122 木聚糖酶活力的测定木聚糖酶活力采用dns法测定（15）：准确配制1 moll木糖标准溶液，分别量取o、o1、02、03、o4、o5 ml木糖标准溶液，置于10 ml带塞玻璃管中，用蒸馏水补齐至2 ml，再加入2 ml dns试剂，沸水浴5 min，流水冷却，加蒸馏水至10 ml，反转混匀。得到木糖的终浓度0，0o1，oo2，o03，o04，o05 mgml。在波长540 nm进行比色。以光密度值为纵坐标。木糖浓度为横坐标，绘制木糖标准曲线。发酵液经8 000 g离心10 min，得到的上清即为粗酶液。取o2 ml稀释酶液到加塞玻璃管中，再加入18 ml 05 木聚糖溶液(05木聚糖溶液由木聚糖、ph 70的磷酸盐缓冲液、蒸馏水以8：1：1的比例配制)，60反应10 min，快速加入2 ml dna试剂中止反应，沸水浴5min，用蒸馏水定容至10 ml，在540 nm波长下比色，读数。02 ml稀释酶液、18ml 05木聚糖溶液、2 ml dns试剂一起加入，沸水浴5min，蒸馏水定容至10 ml，作为测试对照。酶活定义：每分钟生成1 umol木糖所需酶量为一个酶活单位（u）。123 菌株鉴定产酶菌株采用革兰氏染色，对其细胞形态、大小、产芽孢情况显微镜观察。124 最适反应温度和耐受性试验设置40，45，50，55，60,65和70的温度条件，对粗酶液进行测定。2 结果与讨论21 菌种筛选采集地热水样品，用8o灭活营养体后涂布于含木聚糖的固体lb培养基培养。采用刚果红染色法筛选得到有透明圈的菌株。22 最适反应温度将得到菌株在含木聚糖的液体的lb培养基中培养，得到粗酶液，在不同反应温度下测定木聚糖酶活性，试验结果显示(图1)，将粗酶液与木聚糖底物反应在不同温度反应，60时活性最高，因此木聚糖酶的最适反应温度为60(最高酶活为69.97u/ml)。图1 木聚糖酶最适反应温度测定23 温度耐受性将木聚糖粗酶液在80 进行孵育后，在最适反应温度检测木聚糖酶的活力。试验结果（图2）显示，粗酶液在80 孵育120 min后，仍具有70 的活力，表明该酶有很好的热耐受性。图2 热耐受性检测23 菌种鉴定将筛选的菌株在固体lb平板上培养过夜，菌落为圆形、白色、不透明、边缘不光滑。革兰氏染色结果（图3）显示为阳性菌，显微镜观察菌体呈直杆状，两端稍圆，单个排列，有少量的端生芽孢。形态鉴定初步表明属于革兰氏阳性的芽孢杆菌。图3 革兰氏染色相差观察本试验从地热水中分离到1株产耐热木聚糖酶的芽孢菌株。酶学试验表明该菌株产生的木聚糖酶最适反应条件为60 ，孵育120 min仍具有70的活力，表明该酶具有较强的热耐受性。该菌株具有较好的热耐受潜力，为耐热耐热木聚糖酶的生产提供了基因资源。参考文献：1 刘明启，孙建义，许英蕾木聚糖酶分子进化的研究进展j中国生物工程杂志。2003，23(1o)：62-662 张红莲，姚 斌，范云六木聚糖酶的分子生物学及其应用j生物技术通报，2002，(3)：23-303 singh s，madlala am，prior bathermomyces lanuginosus：properties of strains and their hemicellulasesjfems micmbiol rev。2003，27：3-164 刘瑞田，曲音波，杨建云木聚糖酶分子结构研究进展j纤维素科学与技术，1997，5(3)：1-65 陆健，曹钰。陈坚，等木聚糖酶的产生、性质和应用j酿酒，2001，28(6)：30-346 刘月英，郑忠辉，傅欲晓棒曲霉ac-2213木聚糖酶合成的调控j 厦门大学学报(自然科学版)，1994，33(3)：394-3977 苏纯阳，程学慧，劳泰财，等新一代的饲用酶制剂一细菌性木聚糖酶j饲料工业，2004，25(2)：40-428 熊沈学，刘文斌，方星星低聚木糖梯度添加对异育银鲫生长及肠道消化酶活性的影响j畜牧与兽医，2005，37(1o)：23-249 ashita d，gupta jk，jauhari bm，et a1a celluasepoor，thermostable alkalitolerant xylanase produced by bacillus circulans ab16 grown on rice straw arts its application in biobleaching of eucalyptus pulpjbioresource technology，2000，73：273-27710rifaat r，ismail s，amjad meffect of cultural conditions on xyla-nase production by streptomyces so。(strain ib 24d)and its potential to utilize tomato pomacejarican journal of biotechnology，2005，4(3)：251-25511beg qk，kappor m，mahajan l，et a1 microbial xylanases and their industrial applications：a review jappl microbiol biotechnol，2001，56：326-33812. 刘伟丰，毛爱军，祝令香，等耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究j微生物学报，2004，44(4)：487-49013oscar g，pilar d，javier-pastor ficloning and characterization of xylanase a from the strain bacillus spbp-7：comparision with a1-kaline pi-low molecular weight xylanases of family 11jcurrent microbiology，2004，48：276-27914 bailey m，biely p poutanen kinterlaboratory testing of methods for assay o