常绿杜鹃花的DNA提取技术研究 毕业论文.doc

毕 业 论 文论文题目：常绿杜鹃花的dna提取技术研究学生姓名： 学生学号： 专业班级：08园林学院名称：园林园艺学院指导老师： 学院院长： 2012年5月5日iii 常绿杜鹃花的dna提取技术研究摘 要本研究以分布于云南、贵州等西南山地(海拔2020一4435m)的数十种杜鹃属植物(rhododendronsp.)为材料进行杜鹃属植物进行总dna提取，采用改良ctab法和改良sds法对照白杜鹃dna进行提取，结果表明：改良sds方法提取的杜鹃花总dna不仅带亮，而且比改良ctab法提取的dna杂质少；采用幼叶比功能叶提取的dna质量好。关键词：dna提起技术；杜鹃花；ctab法；sds法；技术对比the operating theory of essential truth in journalismabstractthe research on distributed in yunnan, guizhou and southwest mountain ( elevation 20204435m ) of dozens of species of rhododendron ( rhododendronsp. ) were used as the materials of rhododendron for total dna extraction, using improved ctab method and the improved method of sds control white azalea dna extraction, the results showed that: the improved method for extracting total sds azaleas dna not only with a bright, and the ratio of the improved ctab method of dna extraction using fewer impurities; young leaves than functional leaf extract dna good quality.key words: dna lift technology；rhododendron；ctab；sds；technical comparison目 录毕业论文原创性声明和毕业论文版权使用授权书摘 要abstract附表索引一、 绪 论1二 、课题研究背景及目的1三 、从研究现状1四、实验方法及内容21实验材料和实验方法21 . 1 实验材料21. 1. 1 植物材料21. 1. 2 实验仪器及药剂21 . 2 实验方法2121 杜鹃基因组dna的提取2122杜鹃基因组dna的检测22结果分析53结论及讨论5结 语6参考文献6附录7致谢8插图索引图1 4图2 5常绿杜鹃花的dna提取技术研究一、绪 论杜鹃属(rhododendron)属于杜鹃花科(ericaceae)杜鹃花亚科(rhododendrofdea e)，杜鹃或杜鹃花是杜鹃属植物的统称。19世纪中叶，英国学者在喜马拉雅考察，发现大量杜鹃，引起世界各国对中国西南高山地区杜鹃资源的注意，随后英、法、美、德、俄等国的植物学家深入中国西南山地调查采集，发表了大量新种，同时大量引入中国杜鹃，并与本土杜鹃杂交，培育出无数的杜鹃新品种，使杜鹃成为西方最重要的木本花卉之一，不仅大量栽培，而且研究也相对普遍和深入。相比之下，国内对杜鹃研究较少，起步晚，在客观上形成了杜鹃“墙内开花墙外香”的局面。云南、四川、西藏三省区的高海拔山地几乎拥有中国杜鹃花种类的90%以上，有“世界杜鹃大花园”之称，观赏价值极高的常绿杜鹃在四川集中分布。基础研究滞后，严重影响野生杜鹃资源的开发利用。本研究应用计算机、电子显微镜和dna分子标记技术，对46种杜鹃的遗传多样性、亲缘关系和系统演化进行分析，旨在探索新技术在杜鹃研究上的应用，并为野生杜鹃的准确分类提供理论依据，有利于杜鹃资源的合理开发和利用。二、课题研究背景及目的杜鹃花( rhododendron l. ) 是世界名花, 中国十大名花之一, 被誉为“木本花卉之王”。我国是世界杜鹃花属植物分布的中心和发源地, 杜鹃花达530多种, 约占世界900 余种的59%。被列入“国际人与生物圈保护区网”的长白山, 具有优越的自然条件, 非常适于各种植物生长。其中野生杜鹃花就有9种, 是整个东北地区杜鹃花属植物分布最集中的地方。在众多杜鹃花的研究文献中, 多是介绍杜鹃花的形态、生态、观赏、培养、药用等方面的报道, 从分子标记的角度研究杜鹃花的工作还较少。利用rapd 技术进行长白山野生杜鹃的研究, 国内外尚未见报道。本研究以长白山杜鹃花为试材, 对rapd反应条件进行了优化。 三、研究现状到目前为止，全世界已知杜鹃花属种类约为967种。中国有561种杜鹃，占世界总种数的58，绝大多数常绿乔灌木型杜鹃在中国，中国是世界杜鹃的原产地和分布中心 。一些学者对杜鹃属(rhododendron)植物运用分子标记的方法进行了一些研究，主要是采用rapd技术 、its序列 ，顾奇萍等探讨了云锦杜鹃issr扩增条件的优化 。本试验以云南、贵州等西南山地(海拔2020一4435m)的数十种杜鹃属植物为试验材料进行dna提取，旨在为研究杜鹃的遗传变异奠定基础。四、研究方法及内容1 实验材料与实验方法1 . 1 实验材料1. 1. 1 植物材料 材料采集于云南、贵州等西南山地(海拔2020一4435m)的数十种杜鹃属植物嫩叶， 用硅胶只作为干标本带回实验室备用。1. 1. 2 试验仪器与药剂 主要药剂：十六烷基三甲基溴化胺 (ctab)、巯基乙醇、(三轻甲基)氨基甲烷(tris)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、乙二胺四乙酸(edta)、氯化钠(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、异戊醇(分析纯)、异丙醇(分析纯)、硼酸(分析纯)、硅胶、琼脂糖、taq酶、10buffer(含mg)、issr引物、dna nlarker、溴酚蓝、hdna、液氮。主要仪器：高压灭菌锅、恒压恒流电泳仪、水平电泳槽、pcr仪、高速冷冻离 tl,jl、微量移液器、水浴锅、研钵、超低温冰箱、冰箱、超净工作台、液氮罐。1 . 2 实验方法121 杜鹃基因组dna的提取 1211改良ctab法 (1)取7 ml离心管，加入2 ml的2ctab提取缓冲液，50 l的巯基乙醇，置于65水中预热20 min；(2)各取1/4杜鹃花干叶片放入研钵，迅速倒入液氮，研磨至粉末状，立即转入预热的7 ml离心管中，65保温45 min，其问每隔10 lnin左右混匀1次(轻轻颠倒数次)，取出样品冷却至室温。(3)加入等体积(2 000 tzl)氯仿一异戊醇(体积比为24：1)的混合液，轻轻振荡混匀，12 000 rrain离心15 min (不低于l5，否则ctab会沉淀)。(4)取上清转至一新离心管中，重复步骤(3)。(5)取上层水相l ml，加入3 ml冰冻至一20的乙醇，一20下冰冻2 h。(6)挑出白色絮状物放入15 ml离心管中，用600 jxl 70的无水乙醇漂洗23次，瞬时离心，将沉淀置于超净工作台风干至透明状。最后，加入100 ixl超纯无菌水溶解沉淀，置4下备用，一20保存。1212改良的sds法 (1)取7 ml离心管，加入2 ml的sds提取缓冲液，50 l的巯基乙醇，置于65水中预热20 min。(2)各取1/4杜鹃花干叶片于研钵中，加半勺pvp(约01 g)，迅速倒人液氮，研磨至粉末状，立即转人预热的7 ml离心管中，65保温45 min，其间每隔10 nlin左右混匀1次(轻轻颠倒数次)，取出样品冷却至室温。(3)加入13体积(700 ill)的5 moll kac(ph值48)，混匀，放入冰中30 rain；(4)加入等体积(2 000 )氯仿一异戊醇(体积比为24：1)，轻轻振荡混匀，12 000 rmin离心15 min(不低于15，否则ctab会沉淀)。(5)取上清转至一新离心管中，重复步骤(3)。(6)取上层水相1 ml，加入3 ml冰冻至一20的乙醇，一2o冰冻2 h；挑出白色絮状物放人15 ml离心管中，用6oo 70的无水乙醇漂洗23次，瞬时离心，将沉淀置于超净工作台风干至透明状。最后，加入100 btl超纯无菌水溶解沉淀，置4下备用，一20保存。 122杜鹃基因组dna的检测 用凝胶电泳及紫外吸收法进行dna质量的检测。琼脂糖凝胶(08)电泳是通常用来分离与鉴定dna的简单而高效的方法，可用来检测dna的完整性与含量。提取的植物基因组dna的相对分子量一般可和hdna(48 kb)相比较。将提取的基因组dna进行电泳，若是一条集中的窄带，与kdna分子量大小相当，则dna完整性较好。若点样孑l有拖尾，则dna不纯。若呈弥散状，则说明dna降解严重。核酸在紫外分光光度计的吸收峰为260 nm，蛋白质及酚类物质的吸收峰为280 nm，因此在此波长处可对微克级的比较纯的核酸进行定量，但不能区分dna和rna。当吸收值为1时，相当于大约50 gml的双链dna，40 gml的单链dna或rna。在260 nm及280 nm吸光度比值可作为核酸纯度的指标。dna和rna纯品的这个比值分别为18和20，若d d： 明显低于此值，说明有蛋白质或酚的污染。 2 结果与分析北方露地杜鹃花6个品种的dna提取中，r1、r2、r3 3个品种无论功能叶还是幼叶均提取出了dna；其他3个品种只有幼叶提取出了dna。下面以r1品种提出的dna为材料进行纯度和浓度分析。21 琼脂糖凝胶电泳法分析总dna的纯度和浓度通过8 gl的琼脂糖凝胶电泳分析核酸，可以看出2种方法都可以提出较高质量的总dna，改良sds法的点样孑l比改良ctab法提取的总dna的点样孑l暗，说明前者去除杂质蛋白质等大分子物质的效果不如后者好(图1)。图1对比功能叶和嫩叶提取的总dna电泳带不难发现，从嫩叶提取的总dna浓度最高(图2)。图222紫外分光光度法分析总dna的纯度和浓度从表2可以看出，改良ctab法和改良sds法所提取的幼叶dna，其d260 d2 比值比较稳定，在i719之间；功能叶的d d 比值较低，说明含有一定的蛋白质等杂质的污染。因此，在杜鹃花的issr反应体系中，最好应用嫩叶所提的dna。3 结论与讨论 由于植物细胞具有细胞壁和复杂的次生代谢物，植物细胞总dna的提取与纯化比其他物种要难得多。纯化的途径可用cscl 梯度离心、柱层析及纯化试剂盒等方法，这些方法虽然可获得高质量的dna，但试验步骤繁琐而且成本昂贵。有关杜鹃基因组dna的提取已有一些研究报道，所用方法各有不同。本研究开始时应用前人对杜鹃花dna提取方法，结果很不理想。因此，本研究使用ctab法和sds法进行基因组dna提取，其中有3处有所改进：一是同时使用较高浓度的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和巯基乙醇(3)，以消除杜鹃叶内复杂的次生代谢物的影响；二是增加酚仿抽提次数，以充分去除各种杂质；三是大量提取，微量提纯，以降低次生代谢物的影响，2种方法均能提出的较高质量的dna，其中改良sds法效果最好。露地栽培杜鹃每年春夏发叶2次，采取嫩叶有时间限制，因此比较功能叶和嫩叶对提取结果的影响，发现以杜鹃嫩叶为材料提取出了高质量的dna，虽然采用功能叶提取的dna杂质相对较多，但d d 。 在154162之间，可以应用在对dna纯度要求较低的分子标记试验中，以缓解试验材料的不足。而大字杜鹃、红枫杜鹃和黄杨杜鹃用功能叶无法提出结语本试验采用改良的ctab 法提取杜鹃花基因组总dna, 经凝胶电泳, 提取的dna 质量高, 适合进行rapd 分析。在试验中发现, 植物叶片要进行充分的研磨, 研磨后要呈现粉末状, 否则会影响提取的效果。据邹喻苹等报道, 所有抗氧化剂都要在研磨前临时加入, 否则无效。本试验经验正在研磨前加入抗氧化剂- 巯基乙醇提取dna 的质量确实要好于研磨过程中加入的。牛皮杜鹃、孢叶杜鹃基因组dna 没有提取出来, 可能是这两种杜鹃所含有的成分比较特殊, 但孢叶杜鹃与其他的杜鹃原生境相同, 都生长在长白山的高山苔原带, 其原因有待于近一步研究。参考文献： 1黄茂如杜鹃花m上海：上海科技出版社，1998 2赵喜华，王曼莹杜鹃花rapd条件的优化j生物技术， 2005，15(1)：4143 3段国峰，肖千文杜鹃花属植物基因组dna rapdpcr反应体系的优化j山西农业大学学报：自然科学版，2008，28(2)：136一 l38 4谭 萍，李 煜，赵饮虹贵州几种常见杜鹃花的随机扩增多态性dna(rapd)研究j西北植物学报，2005，25(4)：794798 5高连明，杨俊波，张长芹，等基于its序列分析探讨杜鹃属映山红亚属的组间关系j云南植物研究，2002，24(3)：313320 6顾奇萍，金则新，李钧敏云锦杜鹃issr扩增条件的优化j广西植物，2007，27(4)：560563附录致谢四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获满囊，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。 伟人、名人为我所崇拜，可是我更急切地要把我的敬意和赞美献给一位平凡的人，我的导师。我不是您最出色的学生，而您却是我最尊敬的老师。您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。授人以鱼不如授人以渔，置身其间，