毕业论文--头孢氨苄的生产与研究进展.doc

目 录 摘要1第一章绪论2第一节概述2第二节 头孢氨苄的发现及研究历史4第二章 头孢氨苄的传统生产方法6第三章 头孢氨苄的生产工艺改进8第一节酶法制备头孢氨苄8第二节 酶催化酰胺化缩合制备头孢氨9第三节 酶催化氯化制备头孢氨苄12第四节 酶法反应-萃取耦合技术13第四章 头孢氨苄的生产与发展前景14第六章 结论18参考文献：19致谢20头孢氨苄的生产与研究进展摘要头孢氨苄的生产在医药工业中占有十分重要的地位。青霉素酰化酶是半合成-内酰。胺类抗生素的重要用酶。由于酶法合成与化学法合成相比具有一定的优越性,随着酶工程技术的发展,酶法合成头孢菌素类抗生素已日益受到重视。提高合成产率,降低侧链消耗,从而降低生产成本是酶法合成头孢菌素类抗生素研究的关键问题。平衡控制和动力学控制是酶法合成过程的两大研究策略,通过改变底物、降低水活度、添加高聚物、采用固定化技术及新型反应体系等措施可改善酶促反应的微环境,改变酶的动力学特性,从而起到强化合成途径的作用。本文旨在综述了该领域的一些研究进展并进行了展望。关键词：头孢菌素，青霉素酰化酶，酶法合成，合成控制第一章 绪论第一节概述 头孢氨苄（cephalexin,1,头孢立新、头孢菌素）经过多年的发展，已成为头孢菌素类抗生素中一个主要品种。 1998年世界年产量达2450t，预计直至2012年后还会以2.5的速度增长，仍将是世界上消耗量最大的头孢菌素类抗生素。我国从上世纪80年代开始进行生物转化-内酰胺类抗生素方面的研究，并取得了一些成果。但由于在酰化酶的提取、分离和固定化技术及产物、原料的分离回收技术等方面没有取得实质性的突破，难以形成技术及经济优势，因此也难以在生产中实际应用。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备头孢氨苄的技术水平也不断得到提高。目前，不仅在青霉素酰化酶的固定化技术方面取得了突破性进展，已经有性能稳定的工业用固定化酶制品在生产中得到广泛的应用如德国boehringer mannheim公司生产的商品名为 enzygel及名称为 pga150和 pga450的固定化酶；意大利米兰recordati公司生产的固定化酶；德国rohm pharma公司生产的商品名为eupergit的固定化酶和荷兰dsm公司（原gistbrocades公司）生产的商品名为assemblasetm的固定化酶等，而且在反应底物、酶缩合条件以及产物分离技术等方面的研究也取得了重要进展，具备了大规模工业化生产的条件。荷兰dsm公司在西班牙的一家工厂已于1998年开始用酶法合成头孢氨苄，设计年生产能力为500t，收率已超过化学法水平，达到90以上。另外美国礼莱公司酶法合成1的技术也已达到同等水平。 酶法合成头孢氨苄过程中所排放的废水仅含有一些简单无机盐，对人类生存环境不会构成危害，因此被誉为“绿色路线”（green route）。而传统的化学法因需使用到二氯甲烷及其他溶剂、化学计算量的硅烷化剂（或其它羧基保护剂，如dbu、tmg等）邓氏盐的侧链保护剂和乙酰化反应的激活剂（如特戊酰氯）等，而形成大量的三废。酶法合成头孢氨苄技术探讨酶法制备-内酰胺类抗生素的技术经过30多年的发展，在酶缩合反应技术、产品分离、过量反应原料的回收以及固定化酶技术等方面都取得很大的进展，配套技术也日臻完善。酶法制备-内酰胺类抗生素的研究还涉及到阿莫西林、氨苄西林、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢噻肟、头孢唑啉等品种。 酶催化缩合反应 酶催化缩合技术的发展水平已相当令人满意：侧链与母核7adca的投料摩尔比已经降至2：1以下，底物的浓度可以达到300600mmoll， 7adca的转化率可以达到93以上，反应温度535。 在酶法制备1的过程中，一般使用经固定化技术处理得到的固定化青霉素酸化酶，而早期使用的固定化细胞（细菌）等形态的酶，因其形态结构和性能方面的缺陷，目前已不再使用。随着固定化酶技术的进步和对固定化酶在反应中失活原因的深入研究，固定化酶的使用寿命已经大大延长，半数失活（half-life）批次已经达到50100批。在制备1的酶缩合反应过程中，不可避免地会发生逆反应酶解反应，即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料，这对提高正反应产率是很不利的。为提高酶缩会反应的产率，侧链对母核的投料量，有的甚至过量46倍（摩尔比），才能得到工业上可以接受的产率，这造成了侧链的过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，对生产来说仍是不经济的。目前人们已发现向反应体系中加入少量的酶抑制剂（苯乙酸、苯氧乙酸、扁桃酸等），可降低酶解作用，同时又不会对酶催化缩合反应产生太大的影响，从而可以得到较高的反应产率，大大降低侧链的投料量，使侧链与母核的投料比例降到2：1以下。 产品的分离与纯化 在酶法制备1的技术中，产品的分离及纯化是一项关键性技术，由于所用原料（苯甘氨酸衍生物、7adca）和1的理化性质相近，采用普通方法难以达到分离提纯的目的，因此该问题一直是酶法合成1工业化生产的一大障碍。目前使用的回收纯化方法有多种，如：酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法（如萘酚复合物法）、柱色谱法、纳米滤膜法等。这些方法各有优缺点，还需进一步的改进和完善。 采用酸碱结晶法分离产品，可以不用有机溶剂避免了对环境的污染。但是此法不能把产品一次分离干净，母液中残留的产品仍需通过浓缩结晶或其他方法加以回收处理，而且产品纯度也不够理想，需要进一步精制。 利用1与-萘酚形成复合物的方法比较简单可行，反应体系中的1可以定量地与-萘酚形成复合物，从而得到完全分离。此法非常适合有酶存在的反应体系（图2）。如能解决回收-萘酚的问题，这将是一个非常好的分离纯化工艺。 采用柱色谱方法分离提纯1可得到高纯度的产品，回收率高，同时也可以回收得到其他可利用的原料。但此法的生产能力有限，同时还产生大量的废水。 过量原料的回收 在酶法制备的工艺中，使用的侧链均是d-苯甘氨酸及其衍生物。主要有：甘氨酸、苯甘氨酸酯（甲酯、乙酯等）及其盐、苯甘氨酰胺及其盐（硫酸盐、盐酸盐等）。为了提高7adca的转化率，侧链化合物往往要相对过量。因此为保障1产品的质量并降低生产成本，须对未反应的侧链进行回收利用。 由于在反应中加入的侧链形态不同，回收方法也不尽相同。目前比较成熟、已运用于生产的回收方法有：采用苯甘氨酰胺或其无机酸盐的，反应完毕后加入适当的醛类物质（如苯甲醛等），使未反应的苯甘氨酰胺与醛反应，生成苯甘氨酰胺席夫碱结晶，从而使未反应的苯甘氨酸胺得到分离回收，回收率可达85。生物催化剂应用于头孢氨苄的合成，不仅可大大减少反应步骤，还可大大减少有机废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本。因此21世纪半合成头孢菌素类抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。当然，还须更多地在分子水平了解酶的作用机理，合理地设计出高催化活性的酶（包括酶的固定化技术），使其具有高专一性、高活性、低成本、低失活和高耐受性的特点；对酶法合成工艺的下游工序（如通过各种适当技术寻找选择性吸附终产品的试剂等）的研究，也有待于进一步深入。第二节 头孢氨苄的发现及研究历史1929年以后，抗生素作为新型抗菌药物相继问世，并以其强烈的杀菌能力而备受青睐，但由于长期大量使用，细菌的耐药性日益增强，同时也因一些抗生素有抗菌谱窄或毒副作用大等缺点，临床应用也受到一定限制。因此，必须对原有抗生素的化学结构进行改造，以使其增加疗效，减少毒副作用。所谓半合成抗生素是指用化学或生物化学等方法改变已知抗生素的化学结构或引入特定的功能基团后，所获得的具有某种优越性能的新抗生素品种或其衍生物。对抗生素的化学改造主要有以下几个方面：增强抗菌力，扩大抗菌谱，对耐药菌有效，便于吸收和口服，降低毒性和副作用，改善药理性质，提高生物利用度。其中前三点最重要，尤其第三点寻找对耐药菌有效的化合物是今后的主要改造方向。于是逐渐发现并合成了第三代抗生素，头孢氨苄。头孢氨苄的合成有两种方法，即化学半合成法（简称化学法，包括混酐法和酰氯法）和酶半合成法（简称酶法）。传统合成方法是从苯甲醛开始经化学合成制得侧链；从青霉菌发酵得到青霉素g，经化学扩环、裂解制得母核7adca。（近期利用微生物发酵制备7adca的技术得到了较快的发展，预计2000年会有工业产品问世），再把母核和侧链经化学方法缩合而得到。现在世界上绝大多数生产头孢氨苄的企业仍沿用这一方法，整个生产过程大约需要经过10步化学反应，最终每kg产品所产生的三废高达30kg以上。 头孢氨苄 的酶法合成技术始于上世纪70年代。日本东洋酿造公司采用巨大芽孢杆菌b400和无色杆菌b402产生的青霉素酸化酶（penicillin acylase，青霉素酰基转移酶、青霉素酰胺酶、青霉素乙酰化酶）为催化剂，缩合制得头孢氨苄，并于1973年开始进行工业化研究。该反应可在水溶液中进行，所用有机溶剂极少，反应条件温和，因此该技术得到了广泛的重视。但由于当时酶的性能较差，把反应产物和过量的原料从反应混合物中分离的技术问题也一直未能很好地解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生产阶段。国内外文献对此已有详细介绍。 我国从上世纪80年代开始进行生物转化-内酰胺类抗生素方面的研究，并取得了一些成果。但由于在酰化酶的提取、分离和固定化技术及产物、原料的分离回收技术等方面没有取得实质性的突破，难以形成技术及经济优势，因此也难以在生产中实际应用。 近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备头孢氨苄的技术水平也不断得到提高。目前，不仅在青霉素酰化酶的固定化技术方面取得了突破性进展，已经有性能稳定的工业用固定化酶制品在生产中得到广泛的应用如德国boehringer mannheim公司生产的商品名为 enzygel及名称为 pga150和 pga450的固定化酶；意大利米兰recordati公司生产的固定化酶；德国rohm pharma公司生产的商品名为eupergit的固定化酶和荷兰dsm公司（原gistbrocades公司）生产的商品名为assemblasetm的固定化酶等，而且在反应底物、酶缩合条件以及产物分离技术等方面的研究也取得了重要进展，具备了大规模工业化生产的条件。 荷兰dsm公司在西班牙的一家工厂已于1998年开始用酶法合成1，设计年生产能力为500t，收率已超过化学法水平，达到90以上。另外美国礼莱公司酶法合成1的技术也已达到同等水平。 酶法合成头孢氨苄过程中所排放的废水仅含有一些简单无机盐，对人类生存环境不会构成危害，因此被誉为“绿色路线”（green route）。而传统的化学法因需使用到二氯甲烷及其他溶剂、化学计算量的硅烷化剂（或其它羧基保护剂，如dbu、tmg等）邓氏盐的侧链保护剂和乙酰化反应的激活剂（如特戊酰氯）等，而形成大量的三废。 第二章 头孢氨苄的传统生产方法头孢氨苄的传统合成有方法，即化学半合成法（简称化学法，包括混酐法和酰氯法）。传统合成方法是从苯甲醛开始经化学合成制得侧链；从青霉菌发酵得到青霉素g，经化学扩环、裂解制得母核7adca。（近期利用微生物发酵制备7adca的技术得到了较快的发展，预计2000年会有工业产品问世），再把母核和侧链经化学方法缩合而得到。现在世界上绝大多数生产头孢氨苄的企业仍沿用这一方法，整个生产过程大约需要经过10步化学反应，最终每kg产品所产生的三废高达30kg以上。 半合成青霉素的制备半合成青霉素是以青霉素发酵液中分离得到的6-氨基青霉烷酸为基础，用化学或生物化学等方法将各种类型的侧链与6-氨基青霉烷酸缩合，制成的具有耐酸、耐酶或广谱性质的一类抗生素。6-氨基青霉烷酸的合成6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid，6-apa)的化学结构为： 6-apa在水中加hcl调ph至3.74.0析出白色结晶，熔点208209，等电点4.3，微溶于水，难溶于有机溶剂，遇碱分解，对酸稳定。无抑茵作用，但与各种侧链缩合可得各种半合成抗生素，成为青霉素类抗生素的母核。6-apa的制备方法有酶解法和化学裂解法两种，本节主要讨论化学裂解法。(1) 工艺原理由青霉素g钾盐经氯化、醚化和水解制得。(2) 工艺过程缩合配料比：青霉素g钾盐:乙酸乙酯:五氧化二磷:二甲苯胺:三氯化磷=1:3.83: 0.025:0.768:0.277(wt)。将青霉素的g钾盐的乙酸乙酯溶液冷至-5，加入二甲苯胺和五氧化二磷，再降温至-40，加三氯化磷，冷至-30，反应保温30min。氯化配料比：缩合液:五氯化磷=1(青霉素g钾盐):0.7(wt)。将缩合液冷至-40，一次加入五氯化磷，在-30保温反应75min。醚化配料比：氯化液:二甲苯胺:正丁醇=1(青霉素g钾盐):0.192:3.4(wt)。氯化液冷至-65，加二甲苯胺，搅拌5min，再加预冷到-60的正丁醇，控制料液温度-45。加毕，在-45保温70min。水解配料比：醚化液:蒸馏水:15%氨水:丙酮=1(青霉素g钾盐):4:2:0.8(wt)。在冷冻的醚化液中加入0的蒸馏水，控制料液温度在-13，水解20min。加氨水(加入一半时加晶种)后，温度控制在1315，加碳酸氢铵调ph至4.1，保温约30min后过滤，用0的无水丙酮洗涤，离心。自然干燥，测效价，得6-apa。半合成青霉素的制造方法用6-apa与侧链缩合制备半合成青霉素的方法是6-apa分子中的氨基与不同前体酸(侧链)发生酰化反应。其方法有两种，即化学法和酶催化法。工业生产上是以化学法为主。(1) 化学法常见的化学法有酰氯法和酸酐法两种。酰氯法，将各种前体酸转变为酰氯，而后与6-apa缩合。一般是于低温下，在中性或近中性(ph6.57.0)的水溶液、含水有机溶剂或有机溶剂中进行。反应完毕用有机溶剂提取，再于提取液中加入适量的成盐试剂和晶种，使成钾盐、钠盐或有机盐析出。如酰氯在水溶液中不稳定，缩合应在无水介质中进行，以三乙胺为缚酸剂。酸酐法，将各种前体酸变成酸酐或混合酸酐，再与6-apa缩合。反应和成盐条件与酰氯法相似。(2) 酶催化法是利用酰胺酶裂解青霉素成6-apa的逆反应。在ph为5和适宜的温度下，可使6-apa和侧链缩合成相应的新青霉素，但提纯较为复杂，收率也低。据报道，日本用产碱杆菌固定化菌体进行缩合反应，收率为81%，已达实用阶段。半合成头孢菌素的制备我国半合成头孢菌素又称先锋霉素。天然头孢菌素-头孢菌素c(cephalosporin c)是1956年发现的，1961年确认了化学结构： 头孢菌素c可由d-alpha-氨基已二酸和7-氨基头孢酶烷酸(7-aca)缩合而成。它与青霉素的结构相似，是由与青霉菌近缘的头孢菌属的真菌所产生的。头孢菌素c抑菌效力低，但具有毒性小、与青霉素很少或没有交叉过敏反应、对稀酸和青霉素酶都较稳定等特点。通过其裂解产物7-aca，可借鉴6-apa半合成青霉素的方法，合成许多抗菌效力较高和抗菌谱更广的头孢菌素类抗生素。此类抗生素发展迅速，正在替代传统的四大抗生素药物(青霉素、链酶素、土霉素和四环素类)。关于头孢菌素c抑菌效力低的原因，有人认为是由于亲水性约d-alpha-氨基己二酰氨基所致，也有人认为与c3位上的乙酰基有关。因此其结构改造一般从两方面进行，一是改造c7位氨基上的取代基；二是改造c3位乙酰氧甲基。实践证明，改造c7位氨基上的取代基和c3位乙酰氧甲基，可以得到多种头孢菌素。从头孢菌素c可以合成7-氨基头孢霉烷酸(7-aca)，通过7-aca可以合成一系列新的抗生素，称为头孢菌素类抗生素或半合成头孢菌素。这些半合成头孢菌素既保持头孢菌素c的优点，又能克服原头孢菌素抑菌效力低的弱点，是制药工业中发展较快的一类药品。头孢氨苄的传统合成方法具有很多的缺点。整个生产过程大约需要经过10步化学反应，最终每kg产品所产生的三废高达30kg以上。 不仅反应过程繁琐复杂，工艺路线长，而且产生大量工业三废，造成环境的污染。从而也降低了企业的生产效益。第三章 头孢氨苄的生产工艺改进第一节 酶法制备头孢氨苄在头孢氯苄酶法缩合反应中，所使用的酶基本上是采用固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶，而早期使用的固定化细胞(细菌)等形态的酶，因其形态结构和性能方面的缺陷，已逐步被淘汰。目前所使用的固定化酶，在生物工程菌的选育发酵、酶的提取、固定化载件的选择和固定化技术等方面都有了长足的进步已经较好地解决了早期固定化酶在形态结构和性能方面的缺陷；同时由于对固定化酶催化反应机制和反应动力学方面的深入研究，因此，在头孢氨苄酶法合成中，固定化酶的使用寿命已经大大延长。头孢氨苄的酶催化缩合技术近年来的发展水平已相当令人满意。其中侧链与母核7 adca的投料比例已经降低到1：12：1(分子比)之间；反应底物的浓度可以达到300600mmol-14 ；反应温度控制在535，7-adca的转化率可以达到93以上。在酶法制备头孢氨苄技术中，产品分离与纯化的方法是一项关键性技术，由于所用的原料(苯甘氨酸衍生物、7 adca)和产物头孢氨苄的理化性质相近，采用普通的方法难以达到分离提纯的目的，头孢氨苄与萘酚形成复合物的方法是一个比较简单可行的分离方法，反应体系中的头孢氨苄可以定量地与萘酚形成复合物而得到完全分离。采用一萘酚作为复合剂，其非常适合有酶存在的反应体系，几乎是定量地产生头孢氨苄一萘酚复合物。酶法合成头孢氨苄路线见图4。 图4 酶法制备头孢氨苄工艺路线第二节 酶催化酰胺化缩合制备头孢氨 酶法制备-内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢丙烯、头孢克洛等。酶催化缩合反应类型一般有两类，一类为热力学控制的酶催化缩合反应，另一类为动力学控制的酶催化缩合反应。 (1)热力学控制的酶催化缩合反应其特点是不必活化酰基配体，废物产生少。 schroen等研究了不同 ph、溶剂浓度和温度条件下，热力学控制的头孢氨苄酶法合成。ph 58，酶的稳定性较好；ph 4，酶的活性大大减弱；在水中直接合成，只有很少量的头孢氨苄生成，加入与水互溶的有机溶剂（甲醇和三甲醇二甲醚）有一定好的效果，头孢氨苄平衡浓度增加 23 倍，最大为 0.25mmo1/l (36%三甲醇二甲醚，30，3d)。研究了不同侧链对产品平衡浓度影响，侧链有苯乙酸、-溴苯乙酸、l-马来酸、d-马来酸、对羟基马来酸、吲哚乙酸。研究发现，当侧链为苯乙酸，产品平衡浓度最大 (2.8mmol/l)，当侧链带有羟基苯乙酸（即马来酸），产品平衡浓度小（最小 0.6mmol/l）。结果表明，侧链结构对产品平衡浓度影响很大。酶可以是游离酶，也可以是固定化酶，来源 e.coli。虽然，热力学控制的头孢氨苄酶法生产头孢氨苄，由于产品平衡浓度低，应用价值不大，但提示对某些-内酰胺抗生素，由于侧链结构特性，热力学控制的酶催化缩合有可能实施。 diender 等报道了热力学控制阿莫西林酶法合成，在水溶液中，加入青霉素g 酰化酶（来源 e.coli），同时加入有机溶剂，提高阿莫西林合成平衡常数和合成缩合收率 ulijn等报道，以青霉素酰化酶（粗酶，游离态）为催化剂，通过沉淀产品制备酸性和两性离子-内酰胺抗生素的研究。将苯乙酸和氨水溶液、底物 6-apa（悬浮物）直接加入到反应器中，加入酶催化剂，一边反应一边将产品沉淀。这种热力学控制酶催化反应对青霉素 g 可行，但对两性-内酰胺抗生素阿莫西林则不行。研究发现，通过加人某些相反离子，使其有利沉淀。阿莫西林阴离子与zn2+阳离子形成溶解性差的盐。 zn2+离子加入尽管使-内酰胺降解，但使缩合收率增加至少 30 倍，产品平衡浓度可达 30mmol/l由于热力学控制的酶催化缩合-内酸胺抗生素反应，现阶段缩合收率还较低，应用价值还不大。 (2)动力学控制的酶催化缩合反应 此类反应酰基配体需活化，而酰基配体活化一般是形成酰胺类化合物或酯类化合物vroom报道，将苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸制成相应的酰胺衍生物，在青霉素酰化酶作用下，此酶固定在包含凝胶和由氨基酸组成的多聚体上，酶来源于 escherichia coli、acetobacter pasteuri- anum、xanthomonas citrii、kluyvera citrophila、bacillumegaterium、alcaligenes faecalis,反应温度 035，最适为 10，ph59，合成了头孢氨苄、头孢羟氨苄、氨苄西林、阿莫西林。用此方法，也可合成头孢拉定、头孢克洛、头孢丙烯。boesten 等报道，7-adca 与苯甘氨酰胺缩合得到头孢氨苄，并将母核 7-adca从母液中回收。 van doren 报道将底物母核通过 ph 调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素酰化酶（最好固定化）作用下（酶来源 acetobacter pasterurianuyn、alcaligenesfaecalis 、 bacillus megaterium 、 escherichia coli 、 fusarium oxysporum 、xanthomonas citri 等），与相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物母核调到过饱和浓度的转化率高 10%左右，母核与侧链摩尔比不大于 2.5。用此方法合成了头孢克洛、头孢氨苄。侧链形成酯类化合物中，形成甲酯的较多。youshko 等报道，6-apa 与侧链苯甘氨酸甲酯在青霉素酰化酶 atcc11105（游离态，来源 escherichia coli）作用下，合成氨苄西林。青霉素酰化酶催化水溶液中氨苄西林合成主要由初始底物浓度决定。比较了均相体系中和非均相体系中酶合成反应。在“水溶液-沉淀”非均相体系中，通过形成过饱和溶液进行，然后沉淀产品氨苄西林使得生物催化过程良好进行，使得氨苄西林转化率由 6-apa 计为 93%。最近还有报道，侧链与多醇（如乙二醇）形成含羟基的酯，再与母核在酶的催化下缩合，转化率高达99%，此方法尤适于头孢丙烯、头孢羟氨苄的合成。在酶法制备-内酰胺抗生素的过程中，一般使用经固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶，而早期使用的固定化细胞等形态的酶，因其形态结构和性能方面的缺陷，目前已不再使用。随着固定化酶技术进步，和对固定化酶在反应中失活原因的深人研究，固定化酶的使用寿命已经大大延长，半数失活(half-life)已经达到 50-100 批次。在制备-内酰胺抗生素的酶缩合反应过程中，不可避免地会产生逆反应水解反应，即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料，这对提高反应产率是很不利的，为提高酶缩合反应的产率，侧链对母核的投料量大大过量，这造成了侧链的过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，对生产来说仍是不经济的。maurizi 报道酶缩合反应制备头孢氨苄，向反应体系中加人少量的酶抑制剂（苯乙酸、苯氧乙酸、扁桃酸等），可降低酶解作用，同时又不会对酶催化缩合反应产生太大的影响，从而可以得到较高的反应产率，大大降低侧链的投料量，使侧链与母核的投料比例降到 2:1 以下。20第三节 酶催化氯化制备头孢氨苄酶催化-内酰胺抗生素合成研究，对其酰化缩合反应报道较多。最近，开始对酶催化氯化反应有研究报道。从微生物 rathayibacter 种中分离制备对头孢菌素氯化过氧化物有活性的酶，在 ph6.0 磷酸盐缓冲液中，加人氯化钠和 3%过氧 化 氢 溶 液 ， 此 种 酶 可 将 廉 价 的 头 孢 氨 苄 转 为 价 高 的 头 孢 克 洛 。 仅 rathayibactebiopuresis 能产生头孢菌素氯化过氧化物酶。现转化率不高，如能提高转化率，将对头孢克洛的生产产生巨大的影响。“一锅法”酶法研究情况酶法合成-内酰胺抗生素，一般一步反应在一个反应器中进行，近年来，有人将几步酶法反应（例如水解/缩合或缩合/缩合等）在一个反应器中进行，这样，不需分离中间体，简化了过程，有利于工业化生产，这将是酶法合成的趋势之一。 ternadez-lafuente 等报道新型化学酶法合成头孢唑林，通过 d-氨基酸氧化酶、戊二酰化酶和青霉素 g 酰化酶催化作用，生物转化头孢唑林。以头孢菌素 c为起始原料，在水溶性中，经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林，不分离纯化中间体，每步酶法收率接近 100%。先将头孢菌素 c 酶法脱乙酰基，然后由 dao和 ga 催化，再由 pga 固定化酶（来源 esherichia coli atcc11105）进一步催化酰化7-aca，得到7-(1h-四氮唑)-乙酰氨基-3-乙酰氧甲基-3-头孢烷酸，最后与 mmtd 侧链化学法缩合得到头孢唑林。 wegman等报道，自苯甘氨酸腈二步酶法转化，一锅法制备头孢氨苄。腈水解酶（来源 r. rhodochrous）催化水解 d-苯甘氨酸腈为酰胺，然后在青霉素酰化酶(e.c.3.5.1.11)作用下，7-adca与 d-苯甘氨酰胺缩合，得到头孢氨苄。然后将 1，5-二羟基萘加至反应液中，与头孢氨苄一起结晶，这使得反应液头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率 79%，合成/水解比 7.7。研究还显示 d-苯甘氨酸腈对青霉素 g 酰化酶有明显选择抑schnien 等报道己二酰 7-adca 水解和头孢氨苄酶法合成一锅法完成，所用酶为固定酰胺化酶（来源 escherichia coli），缩短了头孢氨苄制备过程。第四节 酶法反应-萃取耦合技术生物技术产业化成功的关键之一在于生物反应过程的成功开发. 生物催化剂不仅价格昂贵, 且催化性能易受ph 值、温度、离子强度和有机溶剂影响; 同时在反应过程中还存在产物、副产物对反应的抑制, 使催化剂性能得不到最大的发挥. 此外,由于反应底物和产物分子结构通常比较接近, 它们的一些理化性质极为相似, 这给下游分离提取带来了一定的困难. 因此, 提高生产效率要解决的关键之一在于如何使生物催化剂发挥最佳的催化性能,同时在反应过程中分离获取纯度和浓度尽可能高的产物. 为克服上述困难, 近年来反应-萃取耦合技术在酶法转化领域的研究日益深入, 许多重要的化工单元操作如蒸发、液液萃取、膜过滤等, 已被引入这一耦合过程.酶法反应-萃取耦合技术一般利用两相体系,生物催化剂在其中一相单侧分配并进行反应; 同时利用底物、产物和催化剂在相间分配行为的差异使它们在不同的相中分配, 以使产物与催化剂和底物分离, 在一定程度上可以解除产物对催化剂的抑制作用, 提高酶法合成的产率. 同时, 通过选择合适的相体系, 酶法反应-萃取耦合技术还可利用产物和底物在体系中分配行为的差异实现产物的初步纯化, 从而可以减轻下游分离操作的负荷. 由于双水相自身的特性, 其作为液液萃取过程中一个重要的单元操作已在生化分离中广为应用 1,3, 将双水相系统引入酶法合成-萃取耦合技术的研究也正在逐步开展中.头孢氨苄由头孢霉素母核 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸 ( 7-adca) 和侧链结构物质苯甘氨酸或其甲酯 ( pgme) 酰化而成. 自 20世纪70年代日本酶法合成工艺成功开发以来, 酶法因其优势已有逐步取代化学酰化的趋势. 进入 20 世纪 80 年代后, 我国对此酶法工艺亦多有研究. 但目前工艺普遍存在 侧链物质 添加量大 通常 pgme 和 7-adca 的摩尔添加比为 ( 2 4 ) 1, 甚至更高和转化率较低 ( 水相体系一般为 20%左右) 等困难 10 13; 同时由于头孢氨苄的不稳定及其与 7-adca 在某些性质方面的相似性 14, 后继的产物分离纯化也存在相当的困难. 选择合适的合成和分离工艺对头孢氨苄的酶法工业化生产至关重要. 本文以头孢氨苄为对象, 初步探讨了双水相体系用于酶法合成-萃取耦合技术生产这一产品的可行性. 青霉素酰化酶在双水相体系中的稳定性将青霉素酰化酶在20% peg 400/ 12%硫酸镁双水相体系中保留不同时间测定酶活, 计算酶活保留率. 如没有特别说明, 所有的酶活 均在 100mmoll- 1的 ph值70 的磷酸钠缓冲液中测定.选择 ph 值70主要是考虑在碱性条件下镁离子会形成氢氧化镁沉淀, 影响实验的结果.15头孢氨苄双水相体系合成反应7-adca 和 pgme 按实验设计要求添加. 水相反应体系设计为20g 50 mmoll- 1的ph 值 65的磷酸钠缓冲液; 20% peg 400/ 15%硫酸镁双水相反应体系设计为 20g,用磷酸钠缓冲液 ( 100mmoll- 1) 调ph 值65. 青霉素酰化酶添加量均为5 uml- 1. 反应过程用hplc 检测. 2 结果双水相体系的选择酶法工艺要求生物催化剂可重复使用. 头孢氨苄酶法合成涉及的 4种物质分别为产物头孢氨苄、底物7-adca 和pgme 以及生物催化剂青霉素酰化酶. 为实现双水相体系酶法合成-萃取耦合技术生产头孢氨苄, 必须寻找到合适的双水相体系, 使产物尽可能在一相分配, 而底物和催化剂分配在另一相. 许多盐均可与 peg 形成双水相体系, 常用的有 mgso4、( nh4)2so4和混合磷酸盐 ( khp)等. 表 1 显示了要考察的 4 种物质在不同盐与peg 组成的双水相体系中的分配情况. 在所考察的双水相体系中, 7-adca 和 pgme 均倾向于在两相间平均分配 ( 分配系数约为 1) . 固定盐的种类, 随 peg 分子量增加, 头孢氨苄的分配系数 ( kc) 呈下降趋势, 当 peg 相对分子质量由 400上升到 2000时, kc由67下降为33. 同时还显示, 在使头孢氨苄向 peg 上相富集的过程中不同盐显示不同的效果, 强弱顺序依次为mgso4、 (nh4)2so4和 khp. 在所考察的 3种盐中, 为实现产物和底物最大程度的分离, 硫酸镁双水相体系提供了较好的结果. 由于头孢氨苄可以是青霉素酰化酶进行水解反应的底物, 随着合成反应的进行, 当头孢氨苄在反应液中积累到一定浓度时, 青霉素酰化酶催化其水解的速度大大加快,从而使反应产率下降. 此外, 酶法转化生产头孢氨苄过程中还存在产物头孢氨苄对青霉素酰化酶的抑制作用, 从而导致反应的转化率不高. 因此, 在水溶液中进行合成反应时最大转化率很低, 且在到达一个最大值后表现出下降的趋势. 在双水相体系中, 由于产物头孢氨苄和催化剂青霉素酰化酶分别分配在 peg 相和硫酸镁相, 当反应进行时, 在peg 相产生的头孢氨苄立即被萃取进入 peg 上相, 有效地避免了头孢氨苄在青霉素酰化酶周围的富集. 当合成的头孢氨苄从催化剂周围移走后, 反应过程中头孢氨苄对青霉素酰化酶的抑制得到了有效的解除, 反应的平衡被打破, 并朝着有利于头孢氨苄合成的方向进行. 同时, 头孢氨苄被转移到peg 上相后, 青霉素酰化酶催化头孢氨苄水解的反应也在很大程度上得到解除. 另外, 同水溶液体系相比, 高浓度的peg 和硫酸镁的存在大大降低了双水相体系中的水活度, 水活度的降低有利于反应向合成的方向偏移. 因此, 在双水相体系中头孢氨苄取得了较水相体系高的产率. 论证了双水相体系应用于酶法合成-萃取耦合技术生产头孢氨苄的潜在可能.通过实现产物头孢氨苄在 peg 上相进行富集、青霉素酰化酶在硫酸镁下相分配有效地构建了一个 20% peg 400/ 15%硫酸镁双水相体系, 在此体系中催化合成头孢氨苄, 通过不断地将下相产生的产物头孢氨苄萃取进入上相, 消除了产物抑制并打破化学反应的平衡,使反应平衡向合成反应的方向进行, 最终提高酶法合成的产率; 同时, 由于产物头孢氨苄在上相富集, 给后续的分离纯化工艺带来了一定的方便. 双水相体系酶法合成-萃取耦合技术显示出其独有的优越性. 但是, 本文开发的双水相体系应用于头孢氨苄的酶法合成-萃取耦合过程还存在一些困难,包括批次反应产率不稳定、形成双水相体系的高聚物难以回收、催化剂损失严重等. 双水相体系在酶法合成-萃取耦合领域的产业化进程还有待更为深入的研究.第四章 头孢氨苄的生产与发展前景 头孢氨苄的合成有两种方法，即化学半合成法（简称化学法，包括混酐法和酰氯法）和酶半合成法（简称酶法）。传统合成方法是从苯甲醛开始经化学合成制得侧链；从青霉菌发酵得到青霉素g，经化学扩环、裂解制得母核7adca。（近期利用微生物发酵制备7adca的技术得到了较快的发展，预计2000年会有工业产品问世），再把母核和侧链经化学方法缩合而得到。现在世界上绝大多数生产头孢氨苄的企业仍沿用这一方法，整个生产过程大约需要经过10步化学反应，最终每kg产品所产生的三废高达30kg以上。 而酶法合成头孢氨苄却克服了传统生产方法。不仅反应过程相对来说较简单，而且产生的工业三废少，被誉为“绿色路线”。除此之外，酶法反应还具有高效性，因此优于传统方法。头孢氨苄 的酶法合成技术始于上世纪70年代。日本东洋酿造公司采用巨大芽孢杆菌b400和无色杆菌b402产生的青霉素酸化酶（penicillin acylase，青霉素酰基转移酶、青霉素酰胺酶、青霉素乙酰化酶）为催化剂，缩合制得头孢氨苄，并于1973年开始进行工业化研究。该反应可在水溶液中进行，所用有机溶剂极少，反应条件温和，因此该技术得到了广泛的重视。但由于当时酶的性能较差，把反应产物和过量的原料从反应混合物中分离的技术问题也一直未能很好地解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生产阶段。国内外文献对此已有详细介绍。 我国从上世纪80年代开始进行生物转化-内酰胺类抗生素方面的研究，并取得了一些成果。但由于在酰化酶的提取、分离和固定化技术及产物、原料的分离回收技术等方面没有取得实质性的突破，难以形成技术及经济优势，因此也难以在生产中实际应用。 近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备头孢氨苄的技术水平也不断得到提高。目前，不仅在青霉素酰化酶的固定化技术方面取得了突破性进展，已经有性能稳定的工业用固定化酶制品在生产中得到广泛的应用如德国boehringer mannheim公司生产的商品名为 enzygel及名称为 pga150和 pga450的固定化酶；意大利米兰recordati公司生产的固定化酶；德国rohm pharma公司生产的商品名为eupergit的固定化酶和荷兰dsm公司（原gistbrocades公司）生产的商品名为assemblasetm的固定化酶等，而且在反应底物、酶缩合条件以及产物分离技术等方面的研究也取得了重要进展，具备了大规模工业化生产的条件。 荷兰dsm公司在西班牙的一家工厂已于1998年开始用酶法合成1，设计年生产能力为500t，收率已超过化学法水平，达到90以上。另外美国礼莱公司酶法合成1的技术也已达到同等水平。 酶法合成头孢氨苄过程中所排放的废水仅含有一些简单无机盐，对人类生存环境不会构成危害，因此被誉为“绿色路线”（green route）。而传统的化学法因需使用到二氯甲烷及其他溶剂、化学计算量的硅烷化剂（或其它羧基保护剂，如dbu、tmg等）邓氏盐的侧链保护剂和乙酰化反应的激活剂（如特戊酰氯）等，而形成大量的三废。 在酶法制备-内酰胺抗生素的技术中，产品的分离及纯化是一项关键性技术。由于所用原料侧链、母核和产品的理化性质相近，采用普通方法难以达到分离提纯的目的，因此该问题一直是酶法合成-内酰胺抗生素生产的一大障碍。目前使用的回收纯化方法有多种，如：酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法（如萘复合物法）、柱色谱法、纳米滤膜法、两相萃取法等。这些方法各有优缺点，还需进一步的改进和完善。采用酸碱结晶法分离产品，可以不用有机溶剂，避免了对环境的污染。但是此法不能把产品一次分离干净，母液中残留的产品仍需浓缩结晶或其他方法加以回收处理，而且产品纯度也不够理想。 利用头孢菌素与萘类化合物形成复合物的方法比较简单可行，反应体系中的产品几乎可以定量地与萘类化合物形成复合物，从而得到完全分离。此法非常适合有酶存在的反应体系。如能解决回收萘类化合物的问题，这将是一个非常好的分离纯化工艺。 wegman 等报道一锅法制备头孢氨苄，将 1,5-二羟基萘加至反应液，与头孢氨苄一 起结晶，这使得头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率 79%。schroen 等报道，在酶法合成头孢氨苄过程中，同时将产品通过与萘类衍生物形成复合物。这些复合物易结晶，复合物为复合剂与头孢氨苄按一定比例组成。复合物的形成利于防止不需要的水解。优化了反应条件，ph7.5，温度 25为最适宜条件。讨论了产物形成复合物对反应的影响，在大多情况下，有好的影响，水解被抑制。特别是复合剂为 1，5-二羟基萘，酶为液态酶，这样可得到高浓度的头孢氨苄。 采用两相萃取法分离提纯产品，是一个较好方法。hernandez justiz 等报道由动力学控制的酶法（自大肠杆菌的青霉素酰化酶）缩合头孢氨苄，通过连续萃取水溶性产品（周围是酶），从而使收率提高，这样，可避免酶快速水解。将酶以共价键固定于多孔载体上，反应开始前，孔状结构载体可以洗涤，用其中一相填充，这样，当事先平衡好的生物催化剂与第二相混合（那里反应产物将被萃取），固相酶保留于开始选择的第一相中。首次评估了在不同二相体系中头孢氨苄分配系数。在剧烈条件下，可获得高的分配系数。在100%聚二乙醇600-3mol/l，硫酸铵体系中，头孢氨苄被萃取到聚乙二醇体系中，可获最佳分配系数。固定化青霉素酰化酶在硫酸铵中，然后进一步悬浮于100%聚乙醇600中，这样，可得到 90%头孢氨苄合成收率，这里苯甘氨酸甲酯浓度150mmol/l7-00mmo1/l。在这个反应体系中，固相酶留在硫酸铵水相中，由于将产品连续萃取到聚乙二醇相中，使头孢氨苄的水解得到抑制。相反，在单相体系中，由于头孢氨苄的快速水解，综合收率低于 55%。4酶反应器研究酶催化法合成-内酰胺抗生素生物反应器主要有填充床生物反应器、搅拌槽式生物反应器、膜式生物反应器等，现研究较多的是膜式生物反应器。tarvascio等报道非均热膜生物反应器用于酶法合成头孢氨苄的情况。一种新的疏水性的催化膜，通过青霉素酰胺化酶 e.c.3.5.1.