生物科学专业毕业论文28359.doc

本科生毕业设计(论文)中文题目 应用ssap技术分析渐渗系后代多样性研究 外文题目 学院生命科学学院 专业 生物科学 ssap分子标记是waugh等( 1997 )首先在大麦上开发的一种基于逆转座子ltr序列的锚定aflp技术,用于检测逆转座子插入位点与邻近限制性内切酶位点之间的dna多态性,是目前应用最广泛的基于逆转座子元件的分子标记;与aflp相比,ssap分子标记具有数量多、全基因组分布和多态性高等优点。生物和非生物胁迫对所有机体都可能形成巨大的进化动力,为了生存,植物体必须依靠自身的耐受、抗性和逃避的技能,形成复杂的代谢反应来应对和存活;而胁迫诱导基因组的反应包括反转录转座子的活性、转座和基因组结构的变异。因此,基于逆转座子的ssap分子标记能更好地反应因环境或其它因子的改变而引起的遗传多样性差异。ssap除了用来构建高密度的遗传连锁图谱外,ssap分子标记还已被成功用于龙舌兰、蚕豆、大麦、紫花豌豆、首蓓、西红柿、辣椒、柑橘、苹果、等物种的遗传多样性分析,但至今尚无基于ty1-copia类逆转座子的ssap分子标记在东乡野生稻渐渗系上的应用。 东乡野生稻是全球分布最北的国家二级保护野生植物，素有“植物大熊猫”之称，蕴藏着高产、强耐冷、抗旱、抗多种病虫等大量有利基因以及与栽培稻起源、进化有关的信息。此前，众多育种工作者获得了东乡野生稻与不同基因型栽培稻的种间杂种 f1，通过连续回交自交建立了一些高代重组自交系，并对一些重要农艺性状的遗传及生理学特性作了大量研究，如耐旱特性的鉴定、高产、耐冷以及茎杆木质化等性状相关基因的 qtl 分析。然而，目前利用东乡野生稻成功改良栽培稻数量性状的报道仍很少。这一方面是由于野生种中的不良连锁基因和不利农艺性状的存在，加上所有平衡群体中野生种中不利基因高频的出现、基因互作的增加、微效多基因效应被掩盖等缺点，限制了野生种有利基因的发掘和利用。另一方面，在外源基因渐渗过程中，受体植物的各世代会出现广泛的遗传和表观遗传( epigenetic ) 变化，在基因组和表型上明显表现出多种不稳定现象，亲本序列的丢失( sequence elimination ) 或新序列的出现、基因沉默( gene silencing ) 或基因激活( gene acti-vation )以及 dna 甲基化模式改变和转座子或逆转座子激活等。这些遗传与表观遗传变化在一定程度上导致种间杂种后代疯狂分离，很难在短时间内稳定、纯合，很大程度上阻碍了野生有利基因在实际育种中的充分利用。针对以上制约野生稻优异基因发掘与利用的瓶颈问题，笔者利用江西省水稻生理及遗传重点实验室已构建好的东乡野生稻 栽培稻渐渗系为材料进行 ssap分析，研究渐渗系后代多样性，为探索和揭示东乡野生稻渐渗诱发栽培稻遗传与表观遗传变异机制奠定基础，为有效的挖掘与利用东乡野生稻有利基因提供有用的信息。1 材料与方法1.1供试材料 江西东乡野生稻( o rufipogon griff ，以下简称“东野”) ，栽培稻协青早 b( o sativa spindica kato ，简称“协 b”) ，18个渐渗系后代,以及27个国外水稻品种（表1-1）。 表1-1 水稻居群 table 1-1 population 居群 1 xb population 1 居群 2 dwr population 2 居群 3 il5335 il5243 il16 il58 il116 il126population 3 il149 il183 il159 il18 il40 il223 il5339 il5 il12 il33 il82 il75 居群 4 空育131 哈04 密阳46 金23b population 4 珍汕97b 南京6号 台农1号 测64 桂99 谷梅4号 日本晴 tp309 稻花香 居群 5 k12 trenasse wells bengalpopulation 5 lemont r15 2428 cocodrie ronolo katy della tempheton francis dellrose 1.2 实验方法1.2.1 模板dna的制备选择新鲜幼嫩叶片，用液氮保存，按照 murray 和 thompson（1980）的方法提取总 dna，并稍作改动，详细步骤如下：1）将叶片放入预冷的研钵中，液氮研磨至粉末状后，装入 2 ml 预冷的离心管中，立刻加入预热（65）的 ctab 裂解液（100mm tris-hcl，ph 8.0；1.4 m nacl；20mmedta， ph 8.0；2% ctab；1% -巯基乙醇），混匀后 65水浴 1h，每隔 15 min 颠倒混匀一次。2）待温度降至室温以后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1），上下颠倒混匀，室温静置 5min，11, 000 rpm 25 下离心 10min。3）取上清液于新的离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），上下颠倒混匀，静置 5min，11,000 rpm 25下离心 10min。4）取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24/1），上下颠倒混匀，静置 5min，11, 000rpm 25下离心 10min。5）取上清，加入 2/3 体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温下静置 10min，12, 000rpm 25 下离心 10min。6）弃上清，用 70%乙醇洗涤沉淀两次。抽干沉淀，加入 500 l te 缓冲液（100mm tris-hcl, ph 8.0; 1.0 mm edta, ph 8.0），充分溶解。7）加入 rnase（终浓度为 100g/ml）37 温浴 30min。8）加入等体积氯仿/异戊醇（24/1），轻轻混匀，12, 000 rpm 25 离心 10 min。重复一次。9）取上清，加入 1/10 倍体积的 3m naac（ph 5.2）溶液和 2 倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀，-20 静置 1h。12, 000 rpm 4 离心 15min。10）弃上清，用 70%乙醇洗涤沉淀两次。室温风干沉淀，溶于适量的 te 缓冲液中，-20 中保存备用。1.2.2 基因组dna酶切 用限制性内切酶ecor i和 mse i (neb) 进行酶切反应,反应体系如下: dna 500ng 10 buffer 4.0u ecor i 0.5ul mse i 0.5ul ddh2o up to 40.0ul注:酶切反应前,先将dna、 10 buffer、100 bsa、ddh2o混匀, 4放置30min后, 加入内切酶, 混匀、低速离心数秒, 37温浴。1.2.3连接接头 ecor i 接头序列为：5-ctcgtagactgcgtacc-3 3-catctgacgcatggttaa-5 mse i 接头序列为：5-gacgatgagtcctgag-3 3-tactcaggactcat-5 用 t4dna ligase（takara）进行连接反应，体系如下： dna 酶切产物 40.0l ecor i 接头（5pmol/l） 1.0l mse i 接头（50pmol/l） 1.0l 10multicore buffer 1.0l t4dna ligase（5u/l） 1.0l atp（10mm） 1.0l ddh2o 5.0l注: 酶切反应前,先将dna、10buffer、ddh2o混匀,4放置30min后,加入内切酶,混匀、低速离心数秒,37温浴。1.2.4 预扩增反应体系如下： dna 酶切连接产物 5.0l 10pcr buffer 2.0l mg2+（25mm） 1.2l dntp（2.0mm each） 2.0l taq 聚合酶（5u/l） 1.0l e-a（10ng/l） 3.0l m-c（10ng/l） 3.0l ddh2o 2.8lprimer e-a: 5-gactgcgtaccaattca-3primer m-c: 5-gatgagtcctgagtaac-3预扩增程序为： step 1 94 3min step 2 94 1min step 3 56 1min step 4 72 1min step 5 to step 2 35 cycles step 6 72 10min step 7 end预扩增产物稀释 20-30 倍后用做选择性扩增的模板。1.3.4 选择性扩增以逆转座子的 ltr 序列信息设计特异引物，与 mse i 接头对应的引物组合进行选择性扩增。引物序列信息见表 1-2。 表 1-2 ssap 选择性扩增引物序列table 1-2 selective amplification primer sequences used in ssap 引物名称 引物序列(5.一3.) names of primer sequences of primers hss1 gcgtgtttcgtgccttcg 接头引物 hss2 gtgccttcgtagacacctgc oss15-1 ggtgtctttctattatcccttltr引物 oss15-2 ggtgtctttctattatcccttat oss17-1 tggtcacaaccctaaatcct oss17-2 cgactggtcacaaccctaa 反应体系如下： dna 酶切连接产物 5.0l 10pcr buffer 2.0l mg2+（25mm） 1.2l dntp（2.0mm each） 2.0l taq 聚合酶（5u/l） 1.0l 接头引物（10ng/l） 3.0l ltr引物（10ng/l） 3.0l ddh2o 2.8l选择性扩增程序为： step 1 94 3min step 2 94 30sec step 3 65（每个循环降 0.7） 30sec step 4 72 1min step 5 to step 2 11 cycles step 6 94 30sec step 7 56 30sec step 8 72 1min step 9 to step 6 23 cycles step 10 72 10min step 11 end1.3.5 扩增产物的检测1.3.5.1 变性聚丙烯酞胺胶电泳pcr产物的非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳步骤:(l)用清洗液将电泳槽两块玻璃板彻底洗净,蒸馏水冲洗,滤纸擦干,95%酒精擦洗后晾干;同时将边条和梳子洗净并用95%酒精擦净,晾干。(2)将3ml三氯甲烷加200l “acrly glide glass plate coating”的混合液倒在短板上，用滤纸将其涂抹涂匀；将“3ml无水乙醇+10l 冰醋酸+10l binding silane”的混合液倒在长板上并用滤纸涂抹均匀；室温晾干两块板。(3)将边条放在长板两边,短板放在边条上，对齐、夹紧,水平或稍稍倾斜放置。(4)称取25.2252g尿素,加入6ml 10xtbe缓冲液和9ml 40% pa胶,用蒸馏水定容至60ml后,搅拌溶解；溶解后加入50l temed和250l 10% aps,迅速摇匀后倒入预冷的烧杯中。(5)从玻璃板上端连续注入,流速较慢的部分可用吸耳球敲打,使其均匀流动,待凝胶溶液到达玻璃板底部后,插入梳子,凝固3-4小时。(6)待胶凝固后洗去梳齿处的尿素等杂物,拔去梳子并刮去多余凝胶。(7)将玻璃板固定在电泳槽上,灌入1xtbe缓冲液作为电泳缓冲液,用200l的枪将胶孔内的气泡、硅化油、碎胶吹出。(8)70w恒定功率预电泳30min。(9)预电泳后再用加样枪头冲洗胶孔直至无硅化油、碎胶的残留。(l0)预电泳期间准备样品:5l pcr产物加5l上样缓冲液,混匀,94-95水浴中变性4-5min后立即置于冰上。(ll)上样：70w恒功率电泳直至二甲苯青跑至胶版的3/4处1.3.5.2 ssap条带的显色ssap条带的显色采用银染法，参照现代分子生物学技术（卢圣栋, 1993）。详细步骤如下： （1）固定：电泳结束后，小心分开两块玻璃板，将附着凝胶的长玻璃板放入固定液（10%冰醋酸）中，轻轻摇动，固定 30min 至溴酚蓝完全褪去。固定液回收备用。（2）漂洗：用去离子水漂洗玻璃板两次，每次 5min。（3）染色：将玻璃板转入染色液（2g agno3，3ml