食品科学与工程专业毕业论文43942.doc

摘要本科生毕业设计（论文）题目： 酶促棕榈油醇解过程研究 酶促棕榈油醇解过程研究摘要1,3-位置选择性脂肪酶在 1,3-甘油二酯（dag）制备和油脂改性中发挥着重要作用。在脂肪酶催化油脂的醇解反应过程中，往往存在着酰基转移反应。研究用特异性脂肪酶作为催化剂的反应过程中的酰基转移变化规律对于生产目标产物及1,3-位置选择性脂肪酶的应用都具有重要意义。本文以1,3-位专一性酶lipozyme rm im催化甲醇和棕榈油的醇解体系为研究对象，研究底物比、反应温度和反应用酶量对醇解体系过程中产生的酰基转移的现象进行探究。以期了解1,3-位专一性脂肪酶催化甘三酯醇解酯交换反应过程中的酰基转移，为1,3-位专一性脂肪酶在酶促醇解反应中的实际应用提供理论指导。棕榈油与甲醇的醇解过程中酰基转移的情况，包括1,2-甘二酯酰基转移后形成1,3-甘二酯和2-单甘酯酰基转移后形成1（3）-单甘酯。结果表明：当甲醇与棕榈油摩尔比小于3:1时，酰基转移量随着反应时间的增加而增加；当反应温度在50-60之间，酰基转移量会随着温度和时间的增加而增加；当酶量从4%增加到8%，酰基转移量随着时间的增加而增加。关键词：酰基转移；醇解；脂肪酶abstract acyl migration has been researched by 1,3-positional specificity lipase（lipozyme rm im）catalyzed palm oil with methanol in solvent free system，including acyl migration of 1,2-diglyceride（1,2-dg）to 1,3-diglyceride（1,3-dg）and 2-monoglyceride（2-mg）to 1-monoglyceride （1（3）-mg）.discusses the effects of substrate molar ratio，reaction temperature and lipase loading on the acyl migration.the results show that methanol/oil molar ratio was not higher than 3:1, acyl migration increased with ration time. the temperature in the rang of 50 to 60 ,acyl migration increased greated along with increasing of temperature and ration time.when lipase loading increased from 4% to 8%, acyl migration increased greated along with increasing of temperature.key：lipozyme rm im；methanolysis；acyl migration目录第1章 绪论11.1 脂肪酶的存在11.2脂肪酶的选择性11.2.1脂质类型或底物的选择性11.2.2区域或位置选择性21.2.3脂肪酸和酰基供体的选择性21.2.4立体选择性21.2.5非选择性21.3 脂肪酶在生物技术方面的应用21.3.1酯的水解21.3.2甘油解31.3.3酯化反应31.3.4醇解/酸解反应31.3.5酯交换反应31.4 不同因素对醇解产物的影响31.4.1底物摩尔比的影响31.4.2 温度的影响41.4.3 酶量的影响41.5 本论文研究目的及研究内容41.5.1 研究目的41.5.2 研究内容5第2章 材料与方法52.1 实验材料52.1.1 材料与试剂52.1.2仪器设备62.2 实验方法62.2.1棕榈油的脂肪酸组成分析62.2.2 醇解反应62.2.3高效液相分析反应产物72.2.4各因素对反应产物的影响72.2.4.1底物摩尔比对酰基转移的影响72.2.4.2温度对酰基转移的影响72.2.4.3酶量对酰基转移的影响7第3章 结果与讨论83.1棕榈油的脂肪酸组成83.2醇解反应的产物83.3 不同因素对酰基转移的影响93.3.1底物对酰基转移的影响93.3.2温度对酰基转移的影响103.3.3酶量度酰基转移的影响11第4章 结论与展望134.1 主要结论134.2 问题与展望14参考文献.14致谢17酶促棕榈油醇解过程研究第1章 绪论.1.1 脂肪酶的存在脂肪酶(lipase e.c. 3.1.1.3)又称三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol esterhydrolases)，广泛的存在于动植物和微生物中。脂肪酶的天然底物是甘油酯类，然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分1和手性药物的合成2成为酶工程领域研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。1.2脂肪酶的选择性与化学催化相比，酶催化反应的一个显著优势就是其内在的选择性。这种选择性（selectivity）指的是酶催化一组底物中的某些成员发生反应的优先性，客观上表现为不同竞争性底物反应速度的差异3。也有人将此性质称为专一性(specificity)，我们认为，选择性应该是更为确切的表达，因为没有绝对专一性的酶。脂肪酶的选择性可分为五类：脂质类型或底物的选择性、区域或位置选择性、脂肪酸或酰基供体的选择性、立体选择性和非选择性。1.2.1脂质类型或底物的选择性该选择性指的是酶催化某一类型的脂质（甘一酯 mg、甘二酯 dg、甘三酯tg、磷脂、脂肪酸甲酯等）的能力。虽然大多数脂肪酶都对催化甘三酯水解具有较高的活性，但是有些脂肪酶则对一些不完整甘油酯(mg、dg 等)具有选择性。penicillium camembertii 脂肪酶催化 mg 和 dg 水解与合成的活性要高于 tg4。从老鼠的肝组织中提取的脂肪酶5对催化甘一酯的水解具有较高的活性，而对dg 和 tg 则几乎没有活性。1.2.2区域或位置选择性该选择性指的脂肪酶对催化甘油 1,3-位和 2-位酯化或水解的活性。猪胰脂酶、rhizomucor miehei 等可以催化甘三酯水解，生成 2-甘一酯；也可以催化甘油与脂肪酸的酯化合成 1,3-甘二酯。但是，由于热力学平行的关系，反应过程中会伴随有酰基位移的发生，所以不论是水解反应还是酯化反应都会有其它异构体的生成。1.2.3脂肪酸和酰基供体的选择性该选择性指的是脂肪酶对脂肪酸的链长、不饱和程度、不饱和键的位置以及顺反异构体的反应的倾向性。有的脂肪酶对短碳链脂肪酸有选择性；而有的对中碳链或长碳链脂肪酸有选择性6。1.2.4立体选择性立体选择性指的是对 tag 的 1-位或 3-位的区分能力，以及其它手性或潜手性化合物的选择性酯化能力。rogalska 等7研究了 25 种动物和微生物来源的脂肪酶催化三辛酸甘油酯水解的反应，发现pseudomonas aeruginosa和pseudomonassp 是严格的 sn-1 脂肪酶；candida antarctica b 脂肪酶是严格的 sn-3 脂肪酶。但是这种选择性也受到构成甘三酯碳链长度的影响，同种脂肪酶对 sn-1 或 sn-3 的选择性会随着脂肪酸碳链的长度而变化1.2.5非选择性所谓的非选择性脂肪酶，就是对甘油的三个位置反应速率近似相等，常用的candida rogusa 脂肪酶就是非选择性脂肪酶8。1.3 脂肪酶在生物技术方面的应用1.3.1酯的水解比起油脂在酸碱催化及高温高压下的水解，酶催化油脂水解的条件要温和得多。尽管如此，利用脂肪酶进行油脂的水解在工业上应用的实例还不多。脂肪酶目前在工业上的应用主要集中在洗涤剂领域。这一重大突破是在 1998 年novo/nordisk 推出其产品 lipolase tm之后发生的9。该产品是真菌 humicola lanuginosa 在宿主 aspergillus niger 体内表达生产的胞外酶。目前，世界上最大的两家洗涤剂生产商宝洁（proctor and gamble）和联合利华（unilever）使用的主要都是这种产品。1.3.2甘油解甘一酯是一种常用的乳化剂，广泛应用于食品、化妆品和药品的乳化。甘一酯可以通过油脂的甘油解反应得到，与化学方法相比，酶催化反应在富含多不饱和酸的油脂的甘油方面具有优势10-11。酶催化反应可以在较低的温度下进行，可以有效地避免多不饱和脂肪酸的氧化和聚合。1.3.3酯化反应利用脂肪酶的专一性，可以通过甘油的直接酯化获得纯度很高的甘一酯、1，3-甘二酯等产品12。schneider 等13首先将甘油吸附到硅胶上，然后再与脂肪酸反应，获得了纯度很高的甘一酯和甘二酯产品。1.3.4醇解/酸解反应通过油脂的糖醇醇解反应可以合成糖酯等生物表面活性剂。由于化学方法更廉价，所以在蔗糖酯的生产方面，酶法并不占优势。但是，借助于酶催化反应可以很容易的将一些具有特殊功能而又对热敏感的脂肪酸（如 epa、dha、cla等）引入甘三酯，生产所谓的功能性油脂14。1.3.5酯交换反应结构脂质的合成是目前一个很热的研究领域，通过专一性脂肪酶可生产诸如类可可脂、拟人乳脂等高附加值的产品。比如利用棕榈油的中间分提物生产类可可脂已经实现了工业化。rhizomucor miehei lipase 是结构脂合成中使用最广泛的一种脂肪酶15-16。本实验采用由诺维信中国生物技术有限公司提供的具有1,3-特异性的固定化脂肪酶lipozyme rm im作为催化剂，催化棕榈油与甲醇的酯交换。1.4 不同因素对醇解产物的影响1.4.1底物摩尔比的影响过量的醇可以增加酯交换反应产率，但也会使酶活性降低甚至失活，尤其在非均相反应体系中较显著。加入有机溶剂能增加醇的溶解性，抑制酶失活从而提高生物柴油的产率。例如，在正己烷中，甲醇/葵花籽油的摩尔比为3:1，固定化荧光假单胞菌脂肪酶催化反应24h小时后，甲酯转化率达72%；在同样条件下，来源于根霉菌、疏绵状嗜热丝孢菌和洋葱假单胞菌三种固定化酶催化酯交换反应48h后，甲酯转化率近80%。过量的醇是提高酯交换产率的先决条件,但反应过程中须保持低浓度的醇。因此，soumanou和bornscheuer在根霉菌脂肪酶催化制备生物柴油的反应中，将醇分为三部分（每部分醇/油摩尔比为1:1）分步加入到反应体系中，24h后产率分别为84%。通常酶法催化制备生物柴油过程中，在有机溶剂体系中需要稍微过量的醇（大于醇油化学计量摩尔比率即45:1），可达到较高的酯产率；无溶剂体系中醇应分步加入，而第一步酯交换反应时要考虑醇在油中的溶解性及温度的影响。1.4.2 温度的影响不同的脂肪酶在无溶剂体系中催化酯交换反应的最佳温度范围基本相同(30-55)。iso等在研究荧光假单胞菌脂肪酶催化合成油酸乙酯的反应中发现：在30-55之间，酯交换反应速率随着温度的增加而增加。xu等在固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶催化制备生物柴油的实验中（醇油摩尔比1：1）发现：当温度从30逐渐升到40时，反应速率逐渐增大；当升至50时，反应速率不再增加。但醇油摩尔比增大，升高温度将会加快酶的失活。du等在固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶催化反应发现温度、酯交换反应速率和脂肪酶稳定性之间的影响关系与xu等实验结果相同。温度从30升高到40，加快了反应速度，但降低了脂肪酶的稳定性。因此，酶法催化酯交换反应的最佳温度主要取决于生物催化剂稳定性和酯交换反应速率之间的相互影响，也受到醇油摩尔比、有机溶剂和酶热稳定的影响。1.4.3 酶量的影响 酶量的不同直接影响着酷交换反应速度和酯交换率，一般来说，随着酶量的增大，酶与底物接触几率增大，酯交换率或醇转化率增大。对于不同的原料，最佳脂肪酶的用量不一，shimada等17采用4%酶量催化植物油，而刘德华等18采用60%酶量催化豆油。1.5 本论文研究目的及研究内容1.5.1 研究目的1,3-位专一性脂肪酶广泛用于催化油脂改性，然而在利用1,3-位专一性脂肪酶催化油脂改性时会存在副反应酰基转移反应19，酰基转移对酯交换反应的产品组成有很大的影响，若酰基转移得不到有效的控制，则很难得到预期的产品。lipozyme rm im是一种常用的1,3-位专一性脂肪酶，在lipozyme rm im催化甘油三酯（tag）醇解反应过程中，理论上存在1,2-dag、2-mag、tag、脂肪酸甲酯和甘油,但实际上产物中还有1,3-dag和1（3）-dag，证实了酰基转移的存在20 。研究发现影响酰基转移的因素较多，其中底物比、反应温度和反应用酶量的影响较大21。醇解反应是酯交换的一种，甘油三酯和醇（比如甲醇）在脂肪酶的作用下发生醇解反应生成dag、mag及脂肪酸甲酯、甘油等副产物22 。本文以lipozyme rm im催化棕榈油与甲醇酯交换为反应模型，研究底物比、反应温度和反应用酶量对酰基位移的影响，以期了解1,3-位专一性脂肪酶催化甘三酯醇解酯交换反应过程中的酰基转移，为1,3-位专一性脂肪酶在酶促醇解反应中的实际应用提供理论指导。1.5.2 研究内容在无溶剂体系下1,3-位专一性酶lipozyme rm im催化棕榈油与甲醇的醇解过程中酰基转移的情况（1） 在温度和酶量一定的条件下，底物摩尔比对酰基转移的影响。（2） 在底物摩尔比和酶量一定的条件下，温度对酰基转移的影响。（3） 在底物摩尔比和温度一定的条件下，酶量对酰基转移的影响。第2章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 材料与试剂5 棕榈油 新实力食品（南京）有限公司提供 固定化脂肪酶lipozyme rm im, 由诺维信中国生物技术有限公司提供甲醇 分析纯，国药集团化学试剂有限公司正己烷、异丙醇、乙酸 色谱纯2.1.2仪器设备waters 1525高效液相色谱系统，检测器 蒸发光散射检测器色谱柱 waters spherisorb silica色谱柱（2.0mm250mm）离心机、集热式恒温磁力搅拌水浴锅等gc-14b气相色谱仪 日本岛津公司2.2 实验方法2.2.1棕榈油的脂肪酸组成分析脂肪酸甲酯的制备：采用bf3-ch3oh快速酯化法。色谱分析：peg-20000毛细管柱（30 m0.25 mm0.25 m），采用程序升温：初温100 ，保持3 min，以每分钟20180 并保持4 min，再以每分钟12235 保持15 min。载气n2(99.999 %)，燃烧气h2(99.999 %)和空气；进样口温度250 ，检测器250 ，h2压力60 kpa，空气压力50 kpa，柱前压220 kpa；进样量1.0 l，分流比1：50。利用峰面积归一法确定各种脂肪酸含量。2.2.2 醇解反应将一定量的棕榈油与甲醇共同置于圆底烧瓶中，加入一定量的固定化脂肪酶，于一定温度下反应一定时间，取样，hplc分析产物中的含量。由于选用的lipozyme rm im是1,3-位专一性酶，故以醇解过程的中间产物1,3-dag和1（3）-mag的含量评价反应的酰基转移情况。由高效液相色谱仪进行产物含量的测定。2.2.3高效液相分析反应产物一定量的反应物用正己烷溶解后，经10000 r /min离心10分钟后用于hplc分析。色谱条件：检测器：蒸发光散射检测器；色谱柱：waters spherisorb silica色谱柱（2.0mm250mm）；流动相a：正己烷-异丙醇（体积比99:1）；流动相b：正己烷-异丙醇-乙酸（体积比1:1:0.01）；柱温：35；进样量：5l；漂移管温度：75；流速：0.5ml/min。梯度洗脱条件见表1。出峰顺序为tag 、1，3-dag、1，2（2,3）-dag、1（3)-amg、 2-mag。 面积归一化法定量。表1 梯度洗脱条件时间/mina相/%b相/%010001080201470301510002010002.2.4各因素对反应产物的影响2.2.4.1底物摩尔比对酰基转移的影响选用底物醇油摩尔比为1:1、3:1及6：1作为底物研究的变量，反应温度55，加酶量6%（油的质量），在一定的磁力搅拌条件下不同时间取样。2.2.4.2温度对酰基转移的影响由于原料是50 -54的棕榈油以及甲醇的沸点是64.5，故选用50、55、60作为温度研究的变量，醇油摩尔比为1:1，加入酶量6%（油的质量），在一定的磁力搅拌条件下不同时间取样。2.2.4.3酶量对酰基转移的影响甲醇与棕榈油的底物摩尔比为1:1，反应温度为55，在一定磁力搅拌条件下，加入的固定化脂肪酶的量占棕榈油质量的4%、6%、8%。在不同的时间取样进行分析。第3章 结果与讨论3.1棕榈油的脂肪酸组成棕榈油的脂肪酸组成分析如表6表6 棕榈油的脂肪酸组成样品肉豆蔻酸棕榈酸(软脂酸)硬脂酸油酸亚油酸平行11.25753.4794.43932.7036.901平行21.30053.9714.26032.1116.944平均1.27853.7254.3532.416.9223.2醇解反应的产物醇解反应是酯交换的一种，甘油三酯和短链醇（比如甲醇）在脂肪酶的作用下发生醇解反应生成1,2-dag和2-mag，1,2-dag和2-mag经酰基转移生成1,3-dag和1-mag,反应过程中生成的副产物有脂肪酸的短链酯和甘油23-24，如图1。鹅 鹅 鹅 鹅 鹅 鹅 鹅 鹅 鹅鹅鹅鹅 鹅鹅鹅 鹅鹅鹅鹅鹅鹅鹅嗯嗯鹅鹅鹅看看看看看看 看看看 看看看看看看 卡啊啊啊啊啊啊啊啊啊 啊啊啊啊啊 啊啊 啊啊啊啊啊啊啊 啊啊 啊啊啊 啊啊啊 啊啊啊 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醇解反应产物由图1可知，在甲醇与棕榈油摩尔比为1:1，反应温度为55，6%（油的质量）条件下，1,3-dag和1-mag含量随着反应时间的增加而增加；1,2-dag，2-mag和tag则随着时间的增加而呈下降趋势，其中1,2-dag和2-mag含量在两小时达到最大值都在呈下降趋势。说明了在此反应过程中，酰基转移量随着时间的增加而逐渐增加的，1,2-dag和2-mag含量呈现先增加后降低的趋势，说明目标产物在两小时达到最大值，之后会转化成1，3-dag 和1-mag,最后dag和mag达到平衡。3.3 不同因素对酰基转移的影响3.3.1底物对酰基转移的影响在反应温度55，加酶量6%条件下，考察甲醇与棕榈油的摩尔比对产物中酰基转移组分含量的影响，结果见图1。由于1mol甘油三酯在理论上需要3mol甲醇来参加反应，在此理论比值（即甲醇与棕榈油的底物摩尔比为3:1）下，酰基转移较少；当甲醇与棕榈油的底物摩尔比为1:1时，即小于理论比值3:1时，1,3-dag和1（3）-mag含量显著增加；而当甲醇与棕榈油的底物摩尔比为6:1时，即大于理论比值3:1时，1,3-dag和1（3）-mag含量只有少量的降低，即酰基转移量没有发生很大的改变。这可能是甲醇在棕榈油中的溶解性差，当甲醇为3mol当量，底物与酶的接触已达到饱和，且甲醇等短链醇对酶等蛋白质有变性作用，过量的甲醇对脂肪酶的催化反应有很强的抑制作用25-26，因此即使增加甲醇的量也不会使酰基转移增加。由此可见，在利用该酶进行酶促醇解反应时，欲很好的利用其1,3位专一性，则以较高的醇油比为佳。图1 底物摩尔比对醇解反应产物中酰基转移组分含量的影响3.3.2温度对酰基转移的影响基转移。在甲醇与棕榈油摩尔比为1:1，加入酶量6%（油的质量），50、55、60作为温度研究的变量条件下，考察了反应温度对酰基转移组分含量的影响，结果见2。由图2可知，酰基转移量1,3-dag与1（3）-mag含量随着温度的升高（从50上升至60）而增加，这可能一方面是因为本实验采用熔点较高的棕榈油，反应温度升高，体系黏度低，传质速率就快，进而反应速度快，使得1,3-dag与1（3）-mag含量随着温度的升高而增加；另一方面反应温度升高会使甘三酯的水解速度加快，反应体系中甘二酯的浓度增大，有利于1,2(2，3)-dag向1,3-dag及2-mag向1（3）-mag转化，即产生更多的酰基转移。同时发现在反应前4小时，酰基转移量增加的较快，尤其在反应前2小时，1,3-dag比1（3）-mag的增加量更多，这可能是因为1,3-dag有一个酰基受体，而1（3）-mag有两个酰基受体，使得酰基受体进攻机会更多27-28,而引起在反应前4小时1（3）-mag 比1,3-dag的增加量更大。但随着反应时间的增加，酰基转移量则缓慢的增加，当反应至6小时后，1,3-dag和1（3）-mag的含量几乎没有发生改变。由此可见，利用该酶(lipozyme rm im的最适温度范围在50-65)进行酶促醇解反应时,在酶的最适范围内温度高利于甘二酯和单甘脂的酰012345670246810时间(h)5055601-mag含量(%)图2温度比对醇解反应产物中酰基转移组分含量的影响3.3.3酶量度酰基转移的影响在甲醇与棕榈油摩尔比为1:1，反应温度为55，4%、6%、8%（油的质量）作为酶量研究的变量条件下，考察了加酶量对产物中酰基转移组分的影响，结果见图3。由图3可知，酶量为4%时，1,3-dag与1（3）-mag含量为18.7%和5.2%；酶量为6%时，1,3-dag与1（3）-mag含量能达到30%和8.5%；酶量为8%时，1,3-dag与1（3）-mag含量达到31%和9.1%，即酶量从4%增加到8%，1,3-dag与1（3）-mag含量是逐渐增加，尤其酶量大于6%，1,3-dag与1（3）-mag含量增加的更多。同时发现随着反应时间的增加，1,3-dag与1（3）-mag含量增加；在反应前2小时，1,3-dag与1（3）-mag含量增加迅速，当反应至6小时后，1,3-dag与1（3）-mag含量增加的缓慢。即酰基转移量随着酶量和时间的增加而增加，反应前期酰基转移量增加显著，反应后期，酰基转移量增加缓慢。这可能是酶量的增加使甘三酯的水解程度加剧，初期水解会产生更多的甘一酯和甘二酯29-30，且1,2（2,3）-dag与2-mag没有1,3-dag和2-mag稳定15，会使1,2（2,3）-dag和2-mag大量的转化成1,3-dag和1（3）-mag，因此在醇解反应前期，随着酶量的增加酰基转移量增加的更为明显。由此可见，在利用该酶进行酶促醇解反应时，为了很好的利用其1,3位专一性，应以较高的酶量为宜。图3酶量比对醇解反应产物中酰基转移组分含量的影响第4章 结论与展望4.1 主要结论本文在1.3-特异性脂肪酶催化棕榈油与甲醇的醇解体系下，底物摩尔比、反应温度和加酶量对醇解过程中发生的酰基转移现象的影响进行了研究，得出以下结论：（1）在底物摩尔比为1:1，反应温度为55、加酶量为6%的反应条件下进行了研究，发现产物1,3-dag和1-mag含量随着反应时间的增加而增加，即酰基转移量随着时间的增加而逐渐增加；1,2-dag，2-mag和tag则随着时间的增加而呈下降趋势。（2）在温度为55，加酶量为6%，醇油底物摩尔比分别为1:1、3:1和6:1的反应条件下进行了研究，发现当甲醇与棕榈油摩尔比小于3:1时，酰基转移量随着反应时间的增加而增加；（3）在底物摩尔比为1:1，加酶量为6%，反应温度分别为50、55和60的反应条件下进行了研究，发现酰基转移量会随着温度和时间的增加而增加；（4）在底物摩尔比为1:1，温度为55，加酶量分别为4%、6%和8%的反应条件下进行了研究，发现当酶量从4%增加到8%，酰基转移量随着时间的增加而增加。4.2 问题与展望（1）本文用1,3-特异性脂肪酶催化醇解体系，发现底物摩尔比、温度和酶量对醇解过程中出现的酰基转移（副产物）是有影响的，如何抑制酰基转移（副产物）从而提高目标产物的产量，有待进一步更深入的探究。参考文献.1 wei li, ren-wang li, qiang li,etal. acyl migration and kinetics study of 1(3)-positional specic lipase of rhizopus oryzae-catalyzed methanolysis of triglyceride for biodiesel production j. process biochemistry 2010,45:18881893.2 roxana rosu,mamoru yasui,yugo lwas