高产果胶酶菌株的筛选_食品科学与工程毕业论文.doc

高产果胶酶菌株的筛选目 录前言- 2 -1 材料与方法- 3 -1.1材料- 3 -1.2试剂- 3 -1.3仪器设备- 3 -1.4试验方法- 3 -1.4.1技术路线- 4 -1.4.2菌种分离- 4 -1.4.3菌株培养条件的研究- 5 -2结果与分析- 6 -2.1初筛结果- 6 -2.2复筛结果- 6 -2.3菌种形态观察- 7 -2.4单因素试验结果- 7 -2.4.1碳源对菌株产酶能力的影响- 7 -2.4.2氮源对菌株产酶能力的影响- 7 -2.4.3表面活性剂对菌株产酶活性的影响- 8 -2.4.4发酵培养基初始ph值对菌株产果胶酶的影响- 8 -2.4.5发酵温度对菌株产果胶酶的影响- 8 -2.5正交试验结果- 9 -3 结论- 10 -参考文献- 11 -致谢- 13 -高产果胶酶菌株的筛选摘要：本试验采用平板分离法，从腐烂的水果（苹果、梨、枣、甜瓜、籽瓜）中进行高产果胶酶菌株的筛选。同时，通过单因素试验和正交试验对菌株的培养条件进行了优化。试验结果表明：菌种的最适碳源为葡萄糖，浓度为1.5%；最适氮源为蛋白胨，浓度为0.6%；最佳表面活性剂为吐温-60，浓度为0.01%；最适ph值为3.8；最适发酵温度为43。在此条件下菌株的产酶能力可以达到10758 u/.ml。关键词：果胶酶，筛选，培养条件优化前言果胶酶（pectinases）是指能分解果胶质的多种酶的总称，不同来源的果胶酶其特点也不同，微生物来源的果胶酶主要有聚半乳糖醛酸酶(pg)，聚半乳糖醛酸裂解酶(pgl)、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(pmgl）和果胶酯酶(pe)1。pg在果胶酶系中发现较早，它可以水解d-半乳糖醛酸-1,4糖苷键，产物为单半乳糖醛酸和二半乳糖醛酸；pgl通过切断果胶分子-1,4糖苷键，生成具有不饱和键的半乳糖醛酸酯；pmgl可以切断果胶分子-1,4糖苷键，产物为28个糖醛酸单位的不饱和的甲基半乳糖酸低聚物；pe能够使果胶中的甲酯水解，生成果胶酸和甲醇2。产果胶酶的菌种一般可以从腐烂的果蔬以及果园泥土中的微生物中利用果胶为唯一碳源的分离培养基中筛选出来。野生菌株的酶活力往往很低，必须对其进行诱变及发酵条件的优化等以改善菌株的产酶性能。果胶酶的工业化生产均采用微生物发酵方法进行。产生果胶酶的微生物如表1所示3。表1 常用产果胶酶菌种微生物产果胶酶菌属霉菌aspergillus、penicillium、rhizopus、fusarium细菌erwinia、pseudomonas、bacillus、clostridium酵母trichosporm、kluyveromyces、saccharomyces、aureobasidium商品酶制剂的生产菌主要是一些真菌。包括aspergillus niger，rhizopus oryzae，rhizomucor meihei等。reddy(1997)概括了曲霉属中产果胶酶的一些菌种，主要有a.flavus，a.niger，a.terreus，a.sydowii等。其中黑曲霉是国际公认的安全菌株，它的代谢产物可以直接应用于食品4。果胶酶在工业中的应用十分广泛，主要集中在果汁果酒的澄清、果蔬汁的提取5、对水果和蔬菜进行浸解、液化以生产单细胞果汁和菜汁、果实脱皮、木材防腐、棉织物精炼加工等方面6。国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代。八十年代以来我国学者对果胶酶菌种选育进行了广泛的研究。田英华等选育了一株高产果胶酶的黑曲霉突变株 hya4，在优化的发酵条件下酶活力达1285 u/g7。全桂静等利用平板菌落法，从腐烂的南果梨样品中分离筛选得到果胶酶高产菌株as2，果胶酶活性达到6 635u/g干曲8。albert等人利用不同真菌之间的协同效应将aspergillus niger和fusarium moniliforme进行混合培养，产生的果胶酶的活性可以达到1，041.6units/g dry weight)，是单独培养aspergillus niger的1.7倍9。试验采用平板分离法，从腐烂的水果（苹果、梨、枣、甜瓜、籽瓜）中进行高产果胶酶菌株的筛选。同时，通过单因素试验和正交试验对菌株的培养条件进行了优化，旨在为降低企业生产成本，实现果胶酶的国产化提供一定的技术支撑。1 材料与方法1.1材料苹果、梨、枣、甜瓜、籽瓜：市售。1.2试剂果胶（美国sigma公司），硝酸铵，硫酸钠，硫酸镁，氯化钾，硫酸铁，磷酸氢二钾，硝酸钠，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，硫代硫酸钠，碘，碘化钾，可溶性淀粉，硫酸铵，马铃薯，蔗糖，葡萄糖等。1.3仪器设备微量移液器（finnpipette，上海雷勃分析仪器有限公司），摇床（sha-c，金坛市恒丰仪器厂），高压灭菌锅（yx-280b型，上海绿宇精密仪器制造有限公司），电磁炉，水浴锅，烧杯，试管，培养皿，接种针，碘量瓶，酸式滴定管等。1.4试验方法1.4.1技术路线采样富集培养初筛复筛培养条件优化1.4.2菌种分离 培养基配方富集培养基：果胶2%，硝酸铵0.2%，硫酸钠0.05%。选择培养基：果胶0.1%，蔗糖2.0%，硫酸镁0.05%，氯化钾0.05%，硫酸铁0.001%，磷酸氢二钾0.1%，硝酸钠0.3%。菌种保藏培养基：pda培养基液体培养基：橘皮粉4 g，硫酸铵2g，三水磷酸氢二钾 0.3g，氯化钾0.6 g，七水硫酸镁0.55g。 筛选参考张浩森（2008）方法10，进行产果胶酶菌株的筛选：（1）增殖培养：取采集的果园土及果蔬的腐烂部分少量，放入500ml装有增殖培养基的三角瓶中，于30、180 rpm条件下摇床培养3天，得增殖培养液。（2）菌株的初筛：取增殖培养液，采用稀释涂布法涂布于选择培养基平板上，30培养3天，加质量分数为1%十六烷基三甲基溴化铵(多糖沉淀剂)，静止10min，菌落周围出现透明圈的为产果胶酶的菌株。（3）菌株的复筛：挑取dp/dc较大的几个菌落，划线接种于选择培养基上于37条件下培养3d，测定粗酶液酶活。酶活测定参考孙越（1997）、陈静（1999）方法11,12，进行酶活测定：（1）酶液制备：将发酵液于4，8000r/min离心10min后取上清液作为粗酶液。（2）1%果胶溶液配制：取果胶粉1g，加热溶解，煮沸，冷却后过滤，调节ph值至3.5，定容至100ml。（3）酶活测定：取两个100ml三角瓶，一个为酶液瓶(a瓶)，一个为空白瓶(b瓶)，并分别在a瓶、b瓶中各加入10ml的1%果胶溶液，a瓶加5ml重蒸馏水和5ml酶液后调整ph值至3.5，b瓶中加10ml重蒸馏水，40水浴，准确计时1h，立即加热煮沸使酶失活，冷却至室温。取上述a瓶、b瓶中溶液各5ml，分别加入另外两个三角瓶a1、b1瓶中，然后各加1ml浓度为1mol/l的碳酸钠溶液摇匀，再各加5ml浓度为0.05mol/l碘-碘化钾溶液于两个三角瓶中，摇匀，加塞，放置20min，再分别吸取2ml浓度为1mol/l硫酸加入上述两个三角瓶，用0.05mol/l硫代硫酸钠滴定至淡黄色时停止滴定，加入1ml浓度为0.5%的淀粉指示剂，此时溶液呈兰色，继续滴定至兰色消失为止，记下消耗的硫代硫酸钠体积：a1瓶为aml，b1瓶为bml。（4）数据处理：在上述条件下，将每小时酶促催化果胶分解成1mg游离的半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活性单位，具体计算公式如下；活性单位数/毫升酶液=(b-a)m0.5120/(515)式中：b空白消耗硫代硫酸钠溶液体积(ml) a试样消耗硫代硫酸钠溶液体积(ml) m硫代硫酸钠摩尔浓度 0.511摩尔硫代硫酸钠相当于0.51g游离半乳糖醛酸 20反应液体积(ml) 5吸取反应液体积(ml) 1反应时间(h)1.4.3菌株培养条件的研究 单因素试验（1）葡萄糖对菌株产果胶酶的影响分别以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%葡萄糖添加量作为发酵培养基中的碳源进行产酶试验, 同时测定酶活，以确定发酵碳源最适添加量。（2）蛋白胨对菌株产果胶酶的影响分别以0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%蛋白胨添加量作为发酵培养基中的氮源进行产酶试验, 同时测定酶活，以确定发酵氮源最适添加量。（3）发酵培养基中表面活性剂对菌株产果胶酶的影响分别向发酵培养基中加入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%tween-60表面活性剂，进行产酶试验，以确定发酵培养基中添加表面活性剂最适添加量。（4）发酵培养基初始ph值对菌株产果胶酶的影响调节发酵培养基的初始ph值分别为3.5、4、4.5、5、5.5，进行产酶试验。测定各个ph值下的菌株产酶能力。（5）发酵温度对菌株产果胶酶的影响分别在30、35、40、45、50对产酶菌株进行产酶试验，测定各个温度下的菌株产酶能力。正交试验 根据单因素试验结果，对碳源葡萄糖（a），氮源蛋白胨（b），表面活性剂吐温-60（c），发酵培养基初始ph（d）和发酵温度（e）五个因素进行l16（45）正交试验，因素水平编码值如表2。以果胶酶活力为评价指标，确定菌株最佳的发酵培养条件，并进行验证试验。表2 因素水平编码表码值因 素a(%)b(%)c(%)de()44.44734.24524.04313.84 数据处理 试验数据采用spss16.0进行处理2结果与分析2.1初筛结果初筛结果透明圈大小及dp/ dc值见图1及表3。 图1 初筛结果表3 菌株透明圈dp/ dc值菌株dp(cm)dc(cm)dp/ dca6a8a5a2a22.2复筛结果对dp/dc值最大的三株菌株进行液体培养，测定其果胶酶活力。测定结果如表4。表4 复筛酶活力比较菌株酶活（u/ml）a17692.1a29632.5a36543.52.3菌种形态观察 通过革兰氏染色在显微镜下观察到该菌株为革兰氏阴性短杆菌。2.4单因素试验结果2.4.1碳源对菌株产酶能力的影响图2葡萄糖添加量对菌株产酶能力的影响由图2可知，随着葡萄糖含量的逐渐增加，菌株的产酶能力先急剧增强再缓慢下降，当碳源葡萄糖的浓度为1.5%时，菌株的产酶能力最高，达到7013 u/ml，因此可得，菌株的最佳碳源葡萄糖浓度为1.5%。2.4.2氮源对菌株产酶能力的影响图3蛋白胨添加量对菌株产酶能力的影响由图3可知，随着蛋白胨添加量的逐渐增加，菌株的产酶能力表现为先上升后下降的变化，当氮源蛋白胨的浓度为0.6%时，菌株的产酶能力最高，达到8791 u/ml，因此可得，菌株的最佳氮源蛋白胨的浓度为0.6%。2.4.3表面活性剂对菌株产酶活性的影响图4不同表面活性剂添加量对菌株产酶的影响图4表面活性剂添加量对菌株产酶能力的影响由图4可知，随着表面活性剂添加量的逐渐增加，菌株的产酶能力变化幅度不大，当表面活性剂的浓度为0.03%时，菌株的产酶能力出现峰值，达到9224 u/ml，因此选择菌株发酵的最佳表面活性剂添加量为0.03%。2.4.4发酵培养基初始ph值对菌株产果胶酶的影响图5 ph值对菌株产酶能力的影响由图5可知，随着ph值的逐渐升高，菌株的产酶能力表现为先升高再降低趋势。当ph值为4.0时，菌株的产酶能力达到最大值为8653 u/ml，随着ph值的进一步升高，菌株的产酶能力逐渐下降。这主要是因为ph值的改变首先导致培养基的成分发生变化，不利于菌株的利用，另外是由于ph值升高超出了产物酶的最适ph值范围，致使测定结果偏低。2.4.5发酵温度对菌株产果胶酶的影响 图6 不同温度对菌株产酶的影响由图6可知，随着温度的逐渐升高，菌株的产酶能力表现为先升高再降低的变化。当温度为45时，产酶能力达到最大值为9865 u/ml，随着温度的继续升高，菌株的产酶能力表现为下降。2.5正交试验结果由表5可知影响菌株产酶性能的主次因子依次为dce ab，即发酵培养基初始ph表面活性剂吐温-60发酵温度碳源葡萄糖氮源蛋白胨。选取最佳组合为：a3b1c4d4e3，即葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐温-60添加量0.01%，发酵培养基初始ph值3.8，发酵温度43。在此条件下菌株的产酶能力可以达到10758 u/ml。表5 正交试验结果处理因素试验结果（u/ml）abcde1111115888.32122223031.631333310040.34144443206.55212345771.76221436354.77234124547.48243216471.39313421399.2103243110552.311331242506.912342136762.813414235013.8144231410463.315432413381.416441326063.2k15541.6757600.4755203.2753585.4506373.325k25786.2754518.2504736.8754255.9003760.350k36320.4255119.0005830.0006915.4507042.900k45305.3003082.2257093.5258106.8755487.1003 结论3.1由腐烂的大枣中筛选出的菌株初步鉴定为革兰氏阴性短杆菌。3.2由单因素试验得出菌株的最佳碳源为1.5%葡萄糖，最佳氮源为0.6%蛋白胨，最佳表面活性剂为0.03%吐温-60，发酵培养基初始ph4.0，发酵温度45。3.3由正交试验得出菌株的最适发酵条件为：葡萄糖添加量1.5%，蛋白胨0.6%，吐温-60添加量0.01%，发酵培养基初始ph值3.8，发酵温度43。在此条件下菌株的产酶能力可以达到10758 u/ml。参考文献1王璋,食品酶学.北京轻工业出版社,1990,164-1752周人纲,白玉山,kgierschner.果胶裂解酶的分离、提纯及特征,微生物学通报,1990,17(2):88-923赵丽莉,微生物果胶酶研究及其在果蔬加工中的应用进展,2007,7(6):951-9534钦传光,丹娃伦亭娜,丁诺狄安娜.果胶酶高产菌种的筛选j,中国酿造,2000,3(4):14-155赵允麟,赵莉.黑曲霉复合酶的调节与控制m.工业微生物,2001.9,31(3):19-226sakai,yozaki.protopectin solubilizing enzyme that does not catalyze the degradation of polygalacturonie acid.agric.biol.chem,1988,52(4):1091一10937田英华,刘晓兰,邓永平.果胶酶高产菌aspergillus niger hya4的选育j;齐齐哈尔大学学报,2005(1):14-16 8全桂静.果胶酶高产霉菌的筛选及固体发酵条件的优化.沈阳化工学院学报,2008,22(1):36-409 ivanka stoilova & albert krastanov. overproduction of laccase and pectinase by microbial associations in solid substrate fermentation.appl biochem biotechnol,1988，52(4):1091-109310张浩森,缪静,余晓斌.果胶酶高产菌株的筛选及产酶条件的研究,生物学杂志:2008,25(1)11孙越.果胶酶活性的测定方法j,食品科技,1997(3):37-3812陈静,王淑军,杨从发,等.果胶酶产生菌的选育j,淮海工学院学报, 1999(3):63-65screening of strain producing pectinasegong yali (college of food science and engineering, gansu agricultural university, 05 class of food science and engineering)abstract：strain（g-）