骨疏丹方剂的大孔树脂纯化工艺研究 毕业论文.doc

沈阳药科大学本科毕业论文 目录沈 阳 药 科 大 学本 科 毕 业 论 文论文题目： 骨疏丹方剂的大孔树脂纯化工艺研究起止时间： 2011年3月2日 6月24日姓名学号： 所在学院： 药学院年级班级： 2007级药学一班指导教师： 实习单位： 沈阳药科大学分析化学教研室30目 录摘 要1abstracts2第一章 前 言31.1 骨疏丹处方简介及研究概况31.1.1 处方各味药材的介绍31.1.2 骨疏丹处方的药理学研究31.1.3 配伍机制研究41.1.4 促成骨细胞活性成分群研究41.1.5 提取工艺与质量控制方法41.2 中药的现代除杂技术51.2.1 大孔吸附树脂51.2.2 大孔吸附树脂的类型51.2.3 大孔吸附树脂分离技术操作流程61.2.4 影响大孔吸附树脂技术的因素61.2.5 大孔吸附树脂的优缺点71.3 本文的立题依据及研究思路71.3.1 立题依据71.3.2 研究思路8第二章 实验部分92.1 实验材料92.1.1 仪器92.1.2 试剂92.1.3 药材102.2上柱药液的制备102.3 指标成分的含量测定102.3.1 总黄酮的含量测定102.3.1.1 对照品溶液的制备102.3.1.2 标准曲线的绘制102.3.1.3 样品的测定102.3.2总香豆素的含量测定102.3.2.1 对照品溶液的制备102.3.2.2 标准曲线的绘制112.3.2.3 样品的测定112.3.3 hplc同时测定5种活性成分112.3.3.1 5种活性成分的结构式112.3.3.2 色谱条件及系统适用性试验112.2.3.3 混合对照品溶液的制备122.2.3.4 供试品溶液的制备122.3.3.5 样品的测定132.4 浸膏的测定132.5 大孔吸附树脂的选择132.5.1 大孔树脂的静态吸附试验142.5.2 大孔树脂的静态解吸附试验142.5.3 试验结果142.6 d101型树脂吸附工艺研究152.6.1 吸附工艺正交设计152.6.2 吸附工艺正交试验结果152.6.3正交试验结果分析162.6.4 验证试验172.7 d101型树脂洗脱工艺研究182.7.1 洗脱工艺正交设计182.7.2 洗脱工艺正交试验结果192.7.3 洗脱工艺正交试验结果分析192.7.4 验证试验212.8 大孔吸附树脂的重复使用次数23第三章 讨论243.1 讨论243.1.1 正交试验指标成分的确定243.1.2 上样溶液温度243.1.3 上样浓度的选择243.1.4 预吸附时间的确定243.1.5 吸附正交试验中上样体积因素下水平的选择及确定243.1.6 洗脱正交试验中洗脱体积因素下水平的选择253.1.7 洗脱流速的确定25第四章 结论26参考文献27致 谢28沈阳药科大学本科毕业论文 摘要摘 要本文建立了骨疏丹提取物的大孔吸附树脂纯化工艺，通过静态和动态试验以总黄酮、总香豆素保留率及纯度为指标，对影响大孔树脂富集纯化因素进行优化，最后通过hplc法测定的5个活性成分含量之和的保留率将最优条件加以验证。结果表明：d101型大孔吸附树脂对骨疏丹中总黄酮、总香豆素的吸附、解吸能力较强。骨疏丹提取物的上样浓度为0.250gml-1(生药浓度)，室温上样，上样体积为2.5bv，吸附速度为2bvh-1，上样后立即洗脱，水洗体积为7bv，弃去水洗液后，用5bv80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，结果总黄酮、总香豆素纯度之和提高2.99倍，树脂可重复使用15次以上需再生。此纯化工艺稳定可靠，为工业上大规模纯化骨疏丹提取物提供了科学依据。关键词：骨疏丹，大孔吸附树脂，纯化沈阳药科大学本科毕业论文 英文摘要abstractsthe purification progress for gushudan extracts was established with macroporous adsorption resin.the static and dynamic adsorption tests were employed to investigate effects of separation and purification for the total flavonoisd and coumarins from gushudan extracts with the recovery rate of the total flavonoids and coumarins,degree of purity as index. at last, the recovery rate of five active compound was verify by hplc. the result showed that d101 type resin had better adsorption and desorption properties to total flavonoids and coumarins of gushudan extracts.and the optimal purifying condition was as follows: the gushudan extracts solution of 2.5times volumes of the resin(0.250mgml-1of the crude drug oncentration)was loaded with a speed of 2 times volume of the resinh-1in room temperate, and the diamter-height ratio of the resin is 1:3, the impurity was washed away with 7 times volume of the resin wates.and then,the total flavonoids and coumarins were eluated with 80% ethanol. and the eluant volume was 5times of the resin. the eluting rate was 5 times volume of the resinh-1. the results showed that the degree of purity total flavonoisd and coumarins is higher by 2.99 times, and the resin is reuseable for 15 times.the optimized process was stable and feasible. for industry purification gushudan extract offer scientific basis.keyword: gushudan, macroporous adsorption resin, purificati沈阳药科大学本科毕业论文 前言第一章 前 言1.1 骨疏丹处方简介及研究概况骨疏丹处方是根据骨质疏松症的发病机理，以中医药理论和多年临床实践为基础，利用其“中药小复方精选系统操作技术平台1”和“普济方数据库管理系统”精心拟定而成，由淫羊藿、骨碎补、蛇床子、丹参四味中药组成。具有补益肝肾，强壮筋骨，活血止痛的功效。用于肝肾不足证原发性骨质疏松症。我实验室前期已对其进行深入的研究。1.1.1 处方各味药材的介绍淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(epimedium brevicornu maxim.)、箭叶淫羊藿(epimedium sagittatum(sieb.et zucc.) maxim.)、柔毛淫羊藿(epimedium pubescens maxim.)、或朝鲜淫羊藿(epimedium koreanum nakai)的干燥叶，夏、秋季茎叶茂盛时采集，晒干或阴干。味辛甘、性温，归肝肾经。有补肾阳、强筋骨之效，用于治疗筋骨痿软、麻木拘挛2。淫羊藿中主要含黄酮类化合物，包括淫羊藿苷、朝藿定b、朝藿定c等3。骨碎补为水龙骨科植物槲蕨drynaria fortunei (kunze) j. sm.的干燥根茎，呈扁平长条状，多弯曲，有分枝，表面覆盖深棕色的小鳞片，柔软如毛，经火燎着呈棕褐色或暗褐色。味苦性温，入肝肾经，可疗伤止痛，补肾强骨，外用消风祛斑4。骨碎补中含有柚皮苷、木犀草素-7-o-d-葡萄糖醛酸苷、咖啡酸-4-o-d-吡喃葡萄糖苷、4-o-d-吡喃葡萄糖基香豆酸、对羟基反式肉桂酸、反式桂皮酸、3,4-二羟基苯甲酸、5-羟甲基糠醛、蔗糖等5。蛇床子为伞形科植物蛇床cnidium monnieri (l.)cuss.的干燥成熟果实，夏秋二季果实成熟时采集，除去杂质，晒干。果实为双悬果细小，呈椭圆形。其有温肾壮阳，燥湿，祛风，杀虫止痒之效6。蛇床子含有多种化学成分，主要含香豆素类化合物，此外还有色原酮类，苯并呋喃类，糖类，以及萜醇类等多种化合物7。丹参为唇形科植物丹参salvia miltiorrhiza bge.的干燥根及根茎，春秋二季采挖，除去泥沙干燥，其有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功能8。8药典?（70-71）。丹参的化学成分分为脂溶性和水溶性两类。脂溶性成分主要包含丹参酮i、丹参酮a、丹参酮b、隐丹参酮等，水溶性成分主要为酚酸类物质，其中包含：丹参素、丹参酸乙、丹参酸丙、丹参酚酸a、丹酚酸b、咖啡酸、迷迭香酸9。1.1.2 骨疏丹处方的药理学研究10选用双侧去卵巢所致的雌性大鼠骨质疏松模型，考察了骨疏丹方剂醇提物的抗骨质疏松药效和在动物体内的促骨形成作用。结果表明，给予骨疏丹提取物后，高、中剂量给药组大鼠的骨密度明显增加，碱性磷酸酶活性明显降低，血清骨钙素、雌二醇水平有显著性的提高，提示骨疏丹方剂可有效抑制过高的骨转换率，促进骨形成而发挥抗骨质疏松作用；给药高剂量组的骨钙、骨磷含量与模型组相比均显著增加，骨干重、去脂干重及灰重有显著增加的趋势。中、高剂量给药组的骨强度均显著高于模型组，提示骨疏丹方剂可促进骨矿物质在骨的沉积，提高大鼠骨矿量和骨密度。骨质疏松症临床以疼痛为主，采用醋酸扭体法考察了骨疏丹方剂的镇痛作用。研究表明给予高剂量骨疏丹方剂能使醋酸所致的小鼠扭体次数明显减少，具有明显的镇痛作用；中、低剂量也显示出一定的镇痛效应。1.1.3 配伍机制研究应用本实验室建立的成骨样细胞umr106活性检测技术，以促进成骨样细胞增殖和分化的作用为活性检测指标，确定骨疏丹方剂以75%乙醇回流提取所得提取物具有较强的促进成骨样细胞的增殖与分化的作用；在此基础上，利用正交实验设计法对骨疏丹方剂进行了拆方研究，考察了16个子方对成骨样细胞增殖和分化的作用，从细胞水平验证了骨疏丹组方中四种单味药材之间君臣佐使的配伍作用，确定了骨疏丹方剂各味药用量的最佳配比10。本同时实验室将hplc数据与促成骨样细胞umr106增殖活性进行相关性分析，验证了淫羊藿在方中促成骨样细胞增殖的主导地位，且药物配伍后各处方的促细胞增殖作用均强于淫羊藿的单独作用，三味药的协同作用强于两味药，四味药配伍后使细胞增殖活性达到最大11。 1.1.4 促成骨细胞活性成分群研究10采用薄层色谱、硅胶柱色谱、ods柱色谱等现代分离技术，以成骨样细胞umr106的增殖与分化为活性追踪指标，对骨疏丹方剂中的活性成分(群)进行了追踪分离。从淫羊藿的主要活性部位正丁醇层中分离纯化得到了金丝桃苷、淫羊藿苷、朝藿定b、朝藿定c和肌醇。从蛇床子的主要活性部位氯仿层分离纯化得到了蛇床子素、-谷甾醇、佛手苷内酯和欧前胡素。从骨碎补的主要活性部位正丁醇层分离纯化得到了新北美圣草苷和柚皮苷。丹参的主要活性部位为氯仿层。结果发现黄酮类化合物淫羊藿苷、朝藿定b和朝藿定c能显著地促进成骨样细胞增殖和分化作用。香豆素类化合物蛇床子素、佛手苷内酯和欧前胡素具有促成骨样细胞增殖和分化的作用。骨碎补中新北美圣草苷和柚皮苷具有较强的促成骨样细胞增殖作用。丹参酮a具有显著的促成骨样细胞分化作用。1.1.5 提取工艺与质量控制方法利用正交试验设计,以活性指标成分淫羊藿苷、蛇床子素、柚皮苷和丹参酮a的含量以及浸膏重量为评价指标，对骨疏丹方剂的醇提工艺进行了优化。经过综合评价确立了骨疏丹方剂的最优醇提工艺为12倍量的75%乙醇为提取溶剂，提取3次，每次90min10。刘曼建立了紫外分光光度法测定了骨疏丹方剂中总黄酮和总香豆素的含量， 并以总黄酮与总香豆素含量为评价指标，再次优化提取条件，结果验证最佳提取条件与原工艺一致11。在此基础上，又以活性指标成分柚皮苷、朝藿定b、淫羊藿苷、蛇床子素、和丹参酮a的含量，以及总黄酮、总香豆素及浸膏重量为评价指标，又将最佳提取工艺优化为2次，其他提取条件不变(待发表)。李超将骨疏丹方剂制成颗粒剂12，并根据药效学试验，得出人体口服骨疏丹颗粒剂的日服剂量，但因日服剂量过大，根据申报新药的要求，需对骨疏丹方剂除杂，减少浸膏率，提高单位浸膏中有效成分的含量。1.2 中药的现代除杂技术 由于醇沉的沉淀面广，除杂专属性差，且具有成分高，工艺周期长，不便于连续化生产，成品稳定性差等特点，逐渐被一些现代除杂技术所取代，如膜分离技术，大孔吸附树脂技术和高速离心技术等。 查阅相关文献可知，方中君药淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷的富集多采用大孔树脂吸附法，而刘健伟等采用d101大孔吸附树脂纯化骨碎补总黄酮提取物，使纯化后提取物中总黄酮含量高达66.0%，而上柱纯化前总黄酮的含量只有24.5%13。而史万忠等采用dm301大孔吸附树脂纯化补肾方(何首乌、淫羊藿苷、骨碎补等），使有效成分总黄酮得到较好富集14。而香豆素类化合物也多采用大孔吸附树脂法进行分离纯化，汤春妮采用hpd300树脂使香豆素含量约50%的样品纯度提高到97%以上15。张霄翔等采用d101树脂纯化丹参总酚酸，使纯化后样品中总酚酸含量达到77.74%，比粗提物中总酚酸含量提高了3.6倍16。 综上所述，我室决定采用大孔吸附树脂对骨疏丹提取物进行纯化。1.2.1 大孔吸附树脂 大孔吸附树脂是二十世纪六十年代发展起来的一类具有良好吸附性能的不含离子交换基团的有机高聚物吸附剂17，具有很好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择性的吸附有机物。其吸附性能与活性炭相似，从相互作用力的角度观察，它所具有的吸附性与范德华力或氢键有关，筛选性能与具有网状结构和很高的比表面积有关。从显微结构上看，大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球组成的网状空穴结构，因此颗粒的比表面积很大，加上合成时引入一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；另一方面，这些网状空穴在合成树脂时具有一定的孔径，使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同具有一定的选择性。通过以上吸附性和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经过一定的溶剂洗脱而达到分离的目的18。1.2.2 大孔吸附树脂的类型大孔吸附树脂按其极性大小和所选用的单体分子结构不同，可分为非极性、中极性和极性三类19。(1)非极性大孔吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合制得的不带任何功能基，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适于由极性溶剂中吸附非极性物质，也称为芳香族吸附剂，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物；(2)中等极性大孔吸附树脂是含酯基的吸附树脂,以多功能团的甲基丙烯酯作为交联剂。其表面兼有疏水和亲水两部分。既可由极性溶剂中吸附非极性物质，又可作为非极性溶剂中吸附极性物质，也称为脂肪族吸附剂，例如聚丙烯酸酯型聚合物；(3)极性大孔吸附树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基团的吸附树脂，它们通过静电相互作用吸附极性物质，如丙烯酰胺。1.2.3 大孔吸附树脂分离技术操作流程20在运用大孔吸附树脂进行分离精制工艺时，其大致操作步骤为：大孔吸附树脂预处理树脂上柱药液上柱大孔吸附树脂的解吸大孔吸附树脂的清洗、再生。由于每一个操作单元都会影响到大孔树脂的分离效果，因此对大孔吸附树脂的精制工艺和分离技术的要求就相对较高。1.2.4 影响大孔吸附树脂技术的因素(1)大孔吸附树脂规格的影响21：大孔吸附树脂的理化性质对吸附分离的影响很大，一般要求吸附容量大，吸附速度快和机械强度好。由于树脂极性、孔度、孔径和比表面积不同，故性质不同，使用时必须根据情况加以选择。(2)上样溶剂性质的影响18：通常一种成分在某种溶剂中溶解度大，则在该溶剂中，大孔吸附树脂对该成分的吸附力就小，反之亦然。吸附量与药液浓度符合frendich和aanmur经典吸附公式，即药液浓度增加吸附量增加，但药液浓度增加有一定限度，即不能超过大孔吸附树脂的饱和吸附容量。一般树脂吸附量与药液浓度成反比，通常以较低浓度进行吸附较为有利，如果药液浓度偏高，则吸附容量会显著减少。(3)吸附流速的影响：对于同一浓度的上样溶液，吸附流速过大，树脂的吸附量就会降低，但吸附流速过小，吸附时间就会增加，在实际应用中，应综合考虑来确定最佳吸附流速，既要使大孔吸附树脂的吸附效果好，又要保证较高的工作效率。(4)大孔树脂柱内径与其柱高比例也影响大孔吸附树脂吸附效果。合适的径高比可为分离提供较高的柱效，从而更有利于大孔吸附树脂的吸附和分离。(5)洗脱溶剂性质的影响22：常用低级醇溶液洗脱，所选用的溶剂应符合两种要求：一种要求溶剂应能使大孔网状吸附剂溶胀，这样可减弱溶质与吸附剂之间的吸附力；另一种则要求所选用的溶剂应容易溶解吸附物。因为解吸时不仅需克服吸附力，而且当溶剂分子扩散到吸附中心后，应能使溶质很快溶解。(6)洗脱流速的影响：一般情况下，洗脱流速过大，洗脱溶剂还没来得及交换和溶解在大孔吸附树脂上被吸附的有效成分，就从柱中流出，从而没有达到分离纯化的目的，而且耗费溶剂，但洗脱流速过小，洗脱时间就会增加。在实际应用中，应综合考虑来确定最佳洗脱流速。1.2.5 大孔吸附树脂的优缺点21优点：(1)应用范围，表现为许多生物活性物质对ph较为敏感，易受酸碱作用而失去活性，这限制了离子交换法的应用，而采用大孔吸附树脂吸附过程中整个ph不变；(2)理化性质稳定、分离性能优良、使用方便，大孔树脂对有机物的选择性良好，且脱水能力强，效果不亚于火星炭；(3)较少产品的吸潮性，传统工艺制备的中成要大部分具有较强的吸潮性，是中药生产及贮藏中长期存在的难题。而经大孔树脂吸附技术处理后，可有效去除大量的糖类、无机盐、粘液质等吸潮成分，有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性；(4)溶剂用量少，大孔树脂可同时完成除杂和浓缩两道工序，仅用少量的溶剂洗脱即达到分离的目的，而且避免了严重的乳化现象，提高了；(5)可重复使用，降低成本、缩短生产周期。不足与改进：(1)大孔吸附树脂价格较贵，吸附效果易受流速和溶剂浓度的影响；品种有限，不能满足中药多成分、多结构的需求；操作较复杂，对树脂的技术要求较高；(2)致孔剂和降解物的毒性问题，但在长期试验中，已经摸索出了树脂使用前对致孔剂、降解物的处理方法，并形成了一整套完整的检测方法，制定了苯、甲苯等的质量控制标准，并通过了国家药品监督管理局的审评；(3)吸附量问题，该问题也曾引起广泛的关注，但只要经常进行上柱前后药液中指标成分含量的检测，及时处理或更换树脂即可解决。 近年来，大孔树脂广泛用于抗生素的分离提纯，维生素的分离提纯，富集中药制剂中的有效成分，克服中药“粗、黑、大”及服用剂量大等缺点，为实现中药复方制剂工艺改革的产业化、现代化提供了新的思路和方法。1.3 本文的立题依据及研究思路1.3.1 立题依据目前骨质疏松病日益严重，西医治疗骨质疏松的药物虽然很多，但均有不同程度的副作用，不能满足临床治疗的需要。中医药治疗骨质疏松具有副作用小的特点，并且在修复骨质，提高骨量的同时，还能调节内分泌、免疫等多个系统的功能状态，可起到标本兼治、综合治疗的目的。中药小复方骨疏丹正是基于这一思想建立起来的，具有较强的抗骨质疏松作用，但因浸膏服用量大，浸膏中含有大量的吸湿性成分，不利于制成现代制剂，因此考虑在不降低药效的基础上，拟采用大孔吸附树脂法对骨疏丹方剂进行纯化，以有效降低浸膏率，减少浸膏的吸湿性。 1.3.2 研究思路本文通过指标成分总黄酮与总香豆素的静态比吸附量、解吸率从4种大孔吸附树脂中优选出对总黄酮和总香豆素吸附、解吸能力均较强的d101大孔吸附树脂；采用l9(34)正交设计试验分别优选了d101大孔吸附树脂纯化骨疏丹的最佳吸附、解吸工艺；通过hplc图谱验证了最佳纯化工艺中活性成分柚皮苷、朝藿定b、淫羊藿苷、蛇床子素、丹参酮a的含量保留率；最后采用确定工艺考察了d101大孔吸附树脂纯化骨疏丹方剂的重复使用次数，为工业上大规模纯化骨疏丹提取物提供了指导意义。沈阳药科大学本科毕业论文 实验部分第二章 实验部分2.1 实验材料2.1.1 仪器 jasco-pu-980型高效液相色谱仪 日本分光公司jasco-uv-975型紫外-可见检测器 日本分光公司anastar chromatogpaphy色谱工作站 scientific system inc.752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司hy-2调速多用振荡器 国华仪器有限公司al104分析天平 德国梅特勒公司yp电子天平 上海光正医疗仪器有限公司kq-300de型超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司sz-93自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂tgl-16c型离心机 上海手术器械厂2.1.2 试剂甲醇(色谱纯) 天津康科德科技有限公司乙腈(色谱纯) 天津康科德科技有限公司95%乙醇(分析纯) 沈阳市富康消毒药剂厂柚皮苷(纯度99%以上) 自制朝藿定b(批号a0229) 成都曼斯特生物科技有限公司淫羊藿苷(批号110822-200305) 中国药品生物制品检定所蛇床子素(批号110826-201013) 中国药品生物制品检定所丹参酮a(批号110826-200513) 中国药品生物制品检定所双蒸水 自制d101型大孔吸附树脂 沧州宝恩化工有限公司ab-8型大孔吸附树脂 沧州宝恩化工有限公司dm130型大孔吸附树脂 沧州宝恩化工有限公司da201型大孔吸附树脂 沧州宝恩化工有限公司2.1.3 药材 淫羊藿、骨碎补、蛇床子、丹参4味药材均经过我校中药学院路金才教授鉴定。 淫羊藿为小檗科植物淫羊藿epimedium brevicornum maxim.的干燥叶，产地甘肃，购自亳州千草药业有限公司。骨碎补为水龙骨科植物槲蕨drynaria fortuner (kunze) j. sm.的干燥根茎，产地湖北，购自河北祁新中药颗粒饮片厂。蛇床子为伞形科植物蛇床cnidium monnieri (l.)cuss.的干燥成熟果实，产地江苏，购自-。丹参为为双子叶植物唇形科植物丹参salbia miltiorrhiza bge.的干燥根及根茎，产地山东，购自-。将上述各单味药材粉碎成粗粉，备用。2.2 上柱药液的制备按处方比例取药材适量，加12倍量75%的乙醇回流提取1.5h，提取2次，制得提取液后减压浓缩至无醇味后，加水定容至生药浓度0.250gml-1，于4冰箱保存备用。上柱前超声处理10分钟使其溶解。2.3 指标成分的含量测定2.3.1 总黄酮的含量测定2.3.1.1 对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，配制成淫羊藿苷浓度为0.238mg/ml的对照品储备液。2.3.1.2 标准曲线的绘制分别精密吸取0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml淫羊藿苷对照品储备液(浓度0.238mg/ml)于10ml量瓶中，各加入1%alcl3(甲醇)1.0ml，摇匀，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，按照紫外-可见分光光度法，于414nm处测定吸光度。以对照品的浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，绘制标准曲线。回归方程为：y=0.1508x，r=0.9999。结果表明：淫羊藿苷在0.00952mg/ml0.0476mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。2.3.1.3 样品的测定精密量取上柱药液、以及吸附-解吸后药液以甲醇定容，摇匀后测定。2.3.2总香豆素的含量测定2.3.2.1 对照品溶液的制备精密称取蛇床子素对照品适量，配制成蛇床子素浓度为0.109mg/ml的对照品储备液。2.3.2.2 标准曲线的绘制分别精密吸取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml蛇床子素对照品储备液(浓度0.109mg/ml)于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，于320nm处测定吸光度。以对照品的浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，绘制标准曲线。回归方程为：y=0.1525x，r=0.9999。结果表明：蛇床子素在0.00218mg/ml0.01308mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。2.3.2.3 样品的测定精密量取上柱药液、以及吸附-解吸后药液以甲醇定容，摇匀后测定。2.3.3 hplc同时测定5种活性成分23 2.3.3.1 5种活性成分的结构式本课题组在骨疏丹促成骨细胞增殖试验中发现以下5种成分都具有较好的促成骨细胞增殖活性，其结构式如图2-1所示，因此将以下5种成分的保留率作为验证试验的指标。把柚皮苷、朝藿定b、淫羊藿苷、蛇床子素、丹参酮a的结构式画上。 柚皮苷 朝藿定b 淫羊藿苷 蛇床子素丹参酮a2.3.3.2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱：diamonsil (2)柱(250mm4.6mm，5m)；流动相：乙腈(a)-1.5%冰醋酸水溶液(b)；梯度洗脱顺序如下： time(min)a(%)b(%)01882191940202872352872375070507030547030558020658020检测波长：270nm柱温：25流速：1.0ml/min进样量：20l2.2.3.3 混合对照品溶液的制备精密称取柚皮苷、朝藿定b、淫羊藿苷、蛇床子素、丹参酮a对照品适量，加甲醇定容，配制成质量浓度分别为0.160、0.306、0.228、0.114、0.102mg/ml的混合对照品储备液，将上述混合对照品储备液制成一系列不同质量浓度的对照品溶液，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得各组分的线性范围和回归方程见表2-1所示。 表2-1 活性成分的线性范围和回归方程线性范围回归方程柚皮苷0.003200.0480y=2107x-204240.9994朝藿定b0.006120.00918y=2107x-397400.9994淫羊藿苷0.004680.0702y=3107x-350060.9994蛇床子素0.004560.0684y=1107x-143470.9992丹参酮a0.002040.0306y=6107x-261670.99952.2.3.4 供试品溶液的制备精密量取上柱药液、以及吸附-解吸后药液以甲醇定容，摇匀后过0.45m。2.3.3.5 样品的测定分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液20l，注入液相色谱仪中，对照品溶液，上柱药液色谱图如图2-2(a)，2-2(b)所示，测定5个色谱峰的峰面积，通过外标一点法计算含量。 图2-2(a):对照品色谱图 图2-2(a):上柱药液色谱图2.4 浸膏的测定 精密吸取上柱药液及吸附-洗脱后溶液适量至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干水分后，将其放入105烘箱中，3小时后取出放入干燥器冷却0.5h，立即称重。2.5 大孔吸附树脂的选择2.5.1 大孔树脂的静态吸附试验：取预处理好的4种型号d101 (非极性)、ab-8(弱极性)、dm130(中极性)、da201(极性)干树脂各1g，精密称定，分别置100ml具塞锥形瓶中，精密加入上柱药液(0.250g/ml)25ml后放于振荡器上，频率100次min-1，每隔20min振摇20s，间隔振摇4h，室温静置24h，使其达到饱和吸附，倾出吸附后的上清液，测定总黄酮、总香豆素的含量，计算树脂的饱和吸附量。饱和吸附量(mgg-1)干树脂=上样液中总黄酮(总香豆素)的含量(mg)-上清液中总黄酮(总香豆素)的含量(mg)/树脂质量(g)。2.5.2 大孔树脂的静态解吸附试验将2.5.1中4种静态饱和吸附后的树脂过滤，吸干表面水分，精密加入25ml75% 乙 醇，频率100次min-1，每隔20min振摇20s，间隔振摇4h，室温静置24h，取解吸后溶液，测定总黄酮、总香豆素的含量，计算树脂的解吸率。 解吸率(%)=解吸溶液中总黄酮(总香豆素)的含量(mg)/上样液中总黄酮(总香豆素)的的含量(mg)-上清液中总黄酮(总香豆素)的的含量(mg)2.5.3 试验结果 4种大孔吸附树脂的总黄酮、总香豆素的吸附与解吸试验结果如下表2-1所示，从表中可以看出：d101大孔吸附树脂对总黄酮、总香豆素的静态饱和吸附量均优于其他3种树脂，且解吸率也较高，因此综合选择d101大孔吸附树脂作为以下纯化工艺用树脂。表2-2. 4种大孔吸附树脂对总黄酮、总香豆素的吸附与解吸试验结果树 脂型 号d101ab-8dm130da201吸附量（mg/g)解吸率吸附量（mg/g)解吸率吸附量（mg/g)解吸率吸附量（mg/g)解吸率指标成分总黄酮66.079.6%47.567.8%39.074.3%36.682.1%总香豆素41.785.6%39.292.5%37.077.4%33.981.5%2.6 d101型树脂吸附工艺研究2.6.1 吸附工艺正交设计精密量取经过预处理的d101大孔吸附树脂50ml，选取上柱药液体积、吸附速度、大孔树脂的径高比作为考察因素，每个因素各取3个水平进行l9(34)正交试验，正交因素水平见表2-3。吸附完成后用7bv的蒸馏水洗脱，弃去水洗液，采用6bv90%的乙醇以5bv/h的速度洗脱，收集醇洗脱液，定容至500ml。测定醇洗脱液中总黄酮与总香豆素的含量，以及洗脱液的浸膏含量。计算总黄酮、总香豆素的保留率、浸膏率及纯度(单位浸膏中有效成分的含量gg-1)。保留率=洗脱液中总黄酮(总香豆素)的含量(mg)/上柱液中总黄酮(总香豆素)的含量(mg)100%浸膏率=浸膏重量(g)/原药材重量(g)100%纯度=单位浸膏中总黄酮(总香豆素)的含量(g/g)100%表2-3 吸附工艺正交设计因素水平表水平因素上样体积（bv）流速（bv/h）径高比误差11.511: 32221：532.531: 72.6.2 吸附工艺正交试验结果 吸附工艺正交试验结果如表2-4所示。表2-4 吸附工艺正交设计结果试验总黄酮保留率（x）香豆素保留率(y)总黄酮纯度总香豆素纯度浸膏率170.8%87.1%31.6%21.6%7.17%263.9%79.5%31.0%21.4%6.60%358.5%71.7%30.9%21.1%6.05%462.1%79.3%31.5%22.4%6.31%559.0%72.1%31.5%2.14%5.99%6762.6%77.8%33.2%22.9%6.04%57.5%71.4%32.8%22.7%5.61%863.1%78.6%32.7%22.6%6.18%958.6%72.0%33.8%23.1%5.55%2.6.3正交试验结果分析以总黄酮纯度与总香豆素纯度权重系数各占50%评分时发现各因素均无显著性影响，以总黄酮保留率、总香豆素保留率权重系数各50%综合评分，直观分析及方差分析结果如表2-5(a)，2-5(b)所示。 表2-5(a)吸附工艺正交设计直观分析结果上样量吸附速度柱径比误差保留率评分111111002122290.73133382.54212389.45223183.16231288.97313281.68321389.79332182.7均值191.06790.33392.86788.600均值287.13387.83387.60087.067均值384.66784.70082.40087.200极差6.4005.63310.4671.533表2-5(b)吸附工艺正交设计方差分析结果因素偏差平方和自由度f比f临界值显著性上样量62.516214.44119.000吸附速度47.802211.04219.000柱径比164.329237.96019.000* (0.05)误差4.332*注：综合评分=x*50%/70.8%+ y*50%/87.1% 从方差分析结果可知：柱径比具有显著性差异，因此柱径比选择最佳试验条件1:3。上样量与吸附速度均无显著性差异，从提高效率和降低生产成本的角度选择上样量2.5bv，吸附速度2bv/h。2.6.4 验证试验 为考察最佳吸附条件的稳定性，按照最佳吸附条件进行验证(n=3)，取预处理好的50ml树脂，使其柱径比为1:3，加入骨疏丹上柱药液125ml(生药浓度0.250g/ml)，以2bvh-1的速率吸附，吸附完成后用7bv的蒸馏水洗脱，弃去水洗液，采用6bv90%的乙醇以5bv/h的速度洗脱，收集醇洗脱液，90%的乙醇定容至500ml。纯化前后5种活性成分的色谱图如图所示,与图2-2(a)比较发现主要色谱峰峰形未发生变化纯化结果如下表所示，表明该工艺稳定可靠。2-3 洗脱液色谱图表2-6 纯化前后结果总黄酮保留率（x）香豆素保留率(y)5个成分之和总黄酮纯度（g/g）总香豆素纯度（g/g）浸膏率纯度之和平均值纯度之和提高倍数上柱药液100%100%100%13.1%7.21%24.2%20.31%1洗脱液163.6%79.3%95%32.5%22.3%6.20%54.6%（rsd=0.1%）2.69洗脱液263.9%79.5%93%32.2%22.1%6.29%洗脱液362.1%78.7%94%32.2%22.5%6.11%2.7 d101型树脂洗脱工艺研究2.7.1 洗脱工艺正交设计精密量取经过预处理的d101大孔吸附树脂50ml，选取水洗体积（bv）、洗脱乙醇浓度、乙醇洗脱体积(bv)作为考察因素，每个因素各取3个水平进行l9(34)正交试验，正交因素水平见表2-6。吸附完成后用7bv的蒸馏水洗脱，弃去水洗液，采用6bv90%的乙醇以5bv/h的速度洗脱，收集醇洗脱液，以相应浓度乙醇定容至500ml。测定醇洗脱液中总黄酮与总香豆素的含量，以及洗脱液的浸膏含量。计算总黄酮、总香豆素的保留率、浸膏率及纯度。表2-7 洗脱工艺正交设计因素水平表水平因素水洗体积（bv）乙醇浓度乙醇洗脱体积（bv）误差1570%42780%53990%62.7.2 洗脱工艺正交试验结果洗脱工艺正交试验结果如表2-8所示。表2-8 洗脱工艺正交试验结果试验总黄酮保留率（x）香豆素保留率(y)总黄酮纯度（x1）总香豆素（y1）浸膏率162.2%83.1%33.5%24.9%5.94%262.5%83.9%30.8%23.0%6.49%358.4%64.9%36.5%22.6%5.11%458.9%79.2%35.2%26.3%5.35%557.1%72.3%30.5%21.5%5.99%655.6%70.1%36.1%25.4%4.92%757.4%71.7%34.5%24.0%5.32%861.8%79.2%32.1%22.9%6.16%955.4%67.1%36.2%24.4%4.89%2.7.3 洗脱工艺正交试验结果分析以总黄酮纯度与总香豆素纯度权重系数各占50%评分的直观分析表及方差分析表如表2-9(a)、 2-9(b)所示，以总黄酮