毕业论文-芥菜(Brasscia juncea Coss)抽薹性状遗传规律分析及相关基因分子标记研究09070.pdf

西南大学 硕士学位论文 芥菜（brasscia juncea coss.）抽薹性状遗传规律分析及相关 基因分子标记研究 姓名：周贤达 申请学位级别：硕士 专业：蔬菜学 指导教师：宋明;汤青林 20100501 摘要 芥菜( b ，口s s c 励跖咒c p 口c o s s ) 抽薹性状遗传 规律分析及相关基因分子标记研究 蔬菜学专业硕士研究生：周贤达 指导教师：宋明教授 汤青林副研究员 捅要 芥菜( b r a s s c i a j u n c e ac o s s ) 是十字花科( c r u c i f e r a e ) 芸薹属( b a s r s c i a ) 蔬 菜作物，在我国栽培历史悠久。芥菜不耐酷暑和严寒，适宜于冷凉湿润气候条件 下栽培，南北各地均以秋播为主。但由于芥菜的阶段发育对低温和长日照要求不 严格，低温春化和长日照会互补，只要完成营养生长就可能抽薹开花，进而对商 品性产生影响。同时在育种上，为了缩短育种周期、加代繁殖、加快育种进程， 需要提前抽薹开花期；而制种时，为了父母本的花期相遇，又需要调节双亲抽薹 开花的一致性，所以深入研究芥菜抽薹开花性状及其机理显得非常重要。本试验 从芥菜抽薹性状遗传规律及相关基因分子标记两方面进行了研究。 本试验以芥菜为材料，利用混合群体分离法( b u l k e ds e g r e g a n t a n a l y s i s ，b s a ) 将由同一对亲本得到的f 2 代群体按照抽薹时间的早晚分成早抽薹群体和晚抽薹群 体两组，构建d n a 池，然后使用i s s r 分子标记技术对两个d n a 池进行分析， 寻找与芥菜抽薹基因连锁的分子标记，并利用该标记对7 6 个单株抽薹性进行鉴定。 试验结果如下： 1 芥菜抽薹遗传规律 早抽薹亲本材料0 3 号和晚抽薹亲本材料4 1 号经春化处理后的抽薹时间相差 3 0 天左右，以此为参考依据，对f 2 代植株群体经春化处理后的抽薹时间进行划分， 对结果进行f 检测表明，芥菜抽薹性状符合1 ：2 ：1 的遗传规律，但是植株群体 的抽薹时间并不完全一致。由此推测芥菜抽薹可能受一个主效基因控制。 2 芥菜抽薹相关基因i s s r 标记 建立了适宜芥菜的i s s r 体系。2 0 此反应体系：d n t p s 为0 8m m o l l ，t a q d n a 聚合酶为1 u ，引物为1 0p m o l m l 。对5 0 条i s s r 引物使用两亲本及f 2 代极早抽 薹和极晚抽薹基因池进行筛选，最终寻找到在两亲本及f 2 代均表现相同多态性的 引物l 条，编号为u b c 8 2 6 。使用引物u b c 8 2 6 ，在f 2 代进行i s s r 扩增，结果发 现条大小约为1 9 k b p 的多态性条带，在早抽薹群体表现为有带，晚抽薹群体表 现为无带。经过统计计算遗传距离为4 0 c m 。 两南大学硕十学传论文 3 i s s r p c r 反应产物两种电泳方式对比 分析芥菜i s s r p c r 扩增片段大小，确定适于芥菜i s s r 的聚丙烯酰胺电泳凝 胶配方：3 0 聚丙烯酰胺溶液为6 2 0 m l ，5 x t b e 为7 5 0m l ，1 0 过硫酸铵为2 7 0 1 x l ， t e m e d 为5 0 此。 对芥菜i s s r p c r 反应产物分别进行1 琼脂糖电泳和5 聚丙烯酰胺凝胶电 泳对比分析，发现5 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以有效分离扩增产物，特别是在 1 k b p 2 k b p 之间的条带可以显著提高条带分辨率，降低分析难度，有利于i s s r p c r 反应产物的分析。 4 抽薹相关蛋白的分析 分别提取f 2 代极早抽薹和极晚抽薹群体的花薹的可溶性蛋白，进行s d s p a g e 电泳分析( 5 浓缩胶，1 0 分离胶) ，最终在3 5 k d a 附近寻找到一条可能与芥菜抽 薹相关的可溶性蛋白条带。 关键词：芥菜；抽薹；i s s r 标记；s d s p a g e i l a b s t r a c t a n a l y s i so fb o l t i n gi n h e r i t a n c ec h a r a c t e r a n dr e l a t e dg e n em o l e c u l a rm a r k e r si n m u s t a r d ( b r a s s c i a j u n c e ac o s s ) m s c a n d i d a t e ：z h o ux i a n d a s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rs o n gm i n g a s s o c i a t er e s e a r c h e rt a n gq i n g l i n a bs t r a c t m u s t a r d ( b r a s s c i aj u n c e ac o s s ) i sa l li m p o r t a n tv e g e t a b l ec r o pw i t l lal o n g c u l t i v a t i o nh i s t o r yi nc h i n a m u s t a r di n t o l e r a n c e dh e a ta n dc o l d ， a p p r o p r i a t e c u l t i v a t i o nw i t hc o o lh u m i d h o w e v e rt h ed e v e l o p m e n to fm u s t a r di sn o ts t r i c t 、析mt h e l o wt e m p e r a t u r ea n dl o n gd a y ，v e r n a l i z a t i o na n dl o n gd a yw i l lc o m p l e m e n te a c h o t h e r ，a sl o n ga sc o m p l e t e dt h ev e g e t a t i v eg r o w t h ，i tw i l lb o l t i n ga n df l o w e r i n g i nt h e b r e e d i n go ft h em u s t a r d ，w en e e dt h ep r e m a t u r eb o l t i n g t oa d dg e n e r a t i o n ， p r o p a g a t i o n ，s h o r t e nb r e e d i n gp e r i o d ，a n da c c e l e r a t e db r e e d i n gp r o c e s s i nt h es e e d i n g p r o d u c t i o n ， r e g u l a t et h ep a r e n t st of l o w e r i n gs i m u l t a n e o u s l y t h e r e f o r e ， i ti s n e c e s s a r yt os t u d yt h eb o l t i n ga n df l o w e r i n go fm u s t a r d ，t h i sr e s e a r c hs t u d i e dt h e m e c h a n i s mf r o mt h ep h y s i o l o g ya n dt h em o l e c u l a rt w od i f f e r e n ta s p e c t sw h i c ht h el e a f m u s t a r dr e p r o d u c t i o ng r o w t ht r a n s f o r m s t h i se x p e r i m e n tu s e dt h em u s t a r df o rt h em a t e r i a l ，、 ，i t l lt h em e t h o do fb u l k e d s e r g e a n ta n a l y s i s ，d i v i d e db o l t i n gc h a r a c t e r so ff 2g r o u p sf r o mo n ec o u pp a r e n t si n t o t w os e c t i o n sa n de s t a b l i s h e dd n a p 0 0 1 i no r d e rt of i n dt h eg e n el i n k e dt o g e t h e r ， f u r t h e ra p p r a i s et h ec h a r a c t e r so fb o l t i n gw i t h7 6m a t e r i a l s t h er e s u l t s 1 m u s t a r db o l t i n gi n h e r i t a n c e p a r e n tm a t e r i a lb ye a r l yb o l t i n gn o 3a f t e rv e r n a l i z a t i o nw a se a r l y3 0 d a y st h a n p a r e n tm a t e r i a lb yl a t eb o l t i n gn o 4 1 a sar e f e r e n c e ，d i v i s i o nv e r n a l i z a t i o nt i m eo f f 2 p l a n t s ， w i t ht h e z 2t e s ts h o w e d ，t h em u s t a r db o l t i n ga c c o r d1 ：2 ：1 ，r e a s o n e dt h e b o l t i n gg e n em a y b eh a v eo n em a j o rg e n e 2 i s s rm a k e ro fm u s t a r db o l t i n gg e n e a ni ss ra n a l y s i ss y s t e mi se s t a b l i s h e d 、析t l lm u s t a r db yo p t i m i z i n gs o m ef a c t o r s o fi s s rt e c h n o l o g i c a ls y s t e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed n t p ss h o u l d b e0 8 m m o l l ，t a q d n ap o l y m e r a s es h o u l db e1u ，p r i m e rs h o u l db e1 0p m o l m l f i n dt h e i ss rm a k e r - u b c 8 2 6w h i c hs h o w e dab a n dn e a r1 9 k b pw a si d e n t i f i e dt ob el i n k e d w i t l lt h eb o l t i n gg e n e t h eg e n e t i cd i s t a n c ew a s4 0 c m 1 1 1 两南大学硕十学f 7 ：论文 i i 3 c o m p a r i s o no ft w oe l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d s a n p a g ea n a l y s i ss y s t e mi se s t a b l i s h e dw i t hm u s t a r d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e 3 0 a c r b i ss h o u l db e6 2 0m l ，5 x t b es h o u l db e7 5 0m l ，1 0 a p ss h o u l db e 2 7 0 1 x l ，t e m 匝ds h o u l db e5 0 u l n l er e a c t i o nr e s u l t sf o ri s s r - p c rb ym u s t a r de l e c t r o p h o r e s i sf o r1 a g a r o s eg e l a n d5 p o l y a c r y l a m i d e ，t h er e s u l ts h o w e dt h a t5 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s i sm o r ee f f e c t e df o rt h ep c rp r o d u c t s ；e s p e c i a l l yt h eb a n d sb e t w e e nlk b p - 2 k b pc a n s i g n i f i c a n t l yi m p r o v er e s o l u t i o na n dr e d u c et h ea n a l y s i sd i f f i c u l t 4 a n a l y s i so fb o l t i n gr e l a t e dp r o t e i n u s i n g5 s t a c k i n gg e la n d10 s e p a r a t i n gg e lo nt h es o l u b l ep r o t e i nf o rf 2g r o u p ； f i n a l l yf i n dab a n dn e a r3 5 k d as h o u l db et h es o l u b l ep r o t e i nb a n d 、斩n 1t h em u s t a r d b o l t i n g k e yw o r d s ：m u s t a r d ；b o l t i n g ；i s s rm a r k s ；s d s - p a g e i v 缩略词表 缩略词表 4 5 第1 罩文献综述 第1 章文献综述 芥菜( b r a s s c i a u n c e ac o s s ) 是十字花科( c r u c i f e r a e ) 芸薹属( b a s r s c i a ) 蔬 菜作物，在我国栽培历史悠久。卜慕华【l 】、陈世儒【2 】等认为中国是芥菜的起源中心 或原产地之一，刘佩瑛【3 l 还认为四川是菜用芥菜的次生起源中心。芥菜在我国的栽 培历史可以追溯到公元前六世纪。在陕西省西安半坡文化层出土菜籽( 芥菜或芜 菁籽) ，经1 4 c 测定距今6 0 0 0 7 0 0 0 年。西汉的尹都尉书中记载有“赵魏之 郊谓之大芥，其小者谓之辛芥，或谓之幽芥”的词句，到东汉时期长江中下游地区 芥菜的栽培已经相当普遍。通过中国精耕细作的农业技术和广阔、复杂的自然条 件的孕育，芥菜已经形成许多新的亚种、变种、类型和品种。1 9 8 9 年，重庆市农 业科学院的杨以耕等提出了中国菜用芥菜新的分类体系：即将菜用芥菜分为根芥、 叶用芥、花薹用芥和茎用芥四大类共1 6 个变种 4 1 。过去对芥菜的研究主要集中在 细胞学及种质资源多样性等方面，如乔爱刚5 1 、杨以耕4 1 、陈材林【6 1 对芥菜分类的 研究，陈玉萍 7 1 、金万梅【8 1 对芥菜离体培养的研究。而在芥菜的抽薹性方面的研究 却非常岁弘1 2 】，特别是缺乏分子生物学方面的研究。 1 1 抽薹遗传规律 1 1 1 抽薹现象 芸薹属( b r a s s i c a ) 是十字花科( c r u c i f e r a e ) 中经济价值最大的一个属，该属 共有约4 0 个种，其主要分布区域在地中海地区；我国共有该属1 3 个栽培种、1 1 个变种，1 个变型。由于芸薹属作物分化类型多、营养价值高、适应性强，在我国 各地都有广泛栽培，如其适应性广，如甘蓝类( b r a s s i c ao l e r a c e a ) 的结球甘蓝、 花椰菜、青花菜、芥蓝和苤蓝，白菜类( b r a s s i c ac a m p a s t r i s ) 的大白菜、白菜、 乌塌菜、菜花薹；以及芥菜种( b r a s s i c a j u n c e a ) 的根用芥、茎用芥、叶用芥等。 抽薹是指叶菜类、根菜类、鳞茎类等二年生蔬菜花茎从叶丛中伸长生长的现 象。它是进入生殖生长的形态标志。蔬菜为方便采种的需要在栽培中应创造适宜 花芽分化和抽薹开花的环境条件，使植株适时抽薹；采收食用器官，则要求抑制 抽薹防止植株营养的消耗阻碍正常食用器官的生长。抽薹又可分为三种情况： 完全抽薹：在充分满足植株低温和长日诱导条件后，遇抽薹适温时的抽薹。采种 栽培必须达到完全抽薹。不完全抽薹：由于未能完全满足植株通过春化的低温 条件，或春化后遇到高温而抽薹开花，形成的花器畸形，易脱落，结实少，种子 小。抽薹中止：指花茎已经开始伸出但中途停止生长而恢复营养生长的现象。 在产品器官生长达到采收期以前( 或形成过程中) 发生的抽薹称为先期抽薹，它 影响产量和品质。如结球甘蓝、洋葱等由于越冬前幼苗个体过大而容易由于低温 两南大学硕十学何论文 诱导而通过春化阶段，于翌年在产品器官成熟之前发生的抽薹；又如在北方高寒 地带秋播的大白菜和萝卜，因遇较低温度和较长的日照，在收获前发生的抽薹等。 1 1 2 抽薹性状遗传规律 芸薹属植物中的抽薹性状研究主要集中在几种主要的蔬菜作物中，如大白菜 抽薹期的研究。m e r o 和h o n m a 在1 1 3 - 1 4 】通过大白菜和芜菁的杂交，提出大白菜的 抽薹期早晚性状是受两个主效加性基因决定的。t e u t o n i c o 和o s b o m t l 5 j 在白菜中利 用f 2 ：3 家系首先定位了2 个q t l 。随后，o s b o m 等【l6 j 利用一个重组自交系群体定 位了3 个影响开花时间的主效应q t l ，总表型贡献率为6 0 左右。a j i s a k a 等l l 7 j 在大白菜中用b s a 法结合r a p d 定位了一个控制极端晚抽薹的q t l ，获得一个 r a p d 标记r a l 2 2 5 c 与控制抽薹性状的位点连锁。该位点可以解释7 7 的表型变 异。赵建军【”】利用b r a p a 亚种类型大白菜c c l 5 6 和一个油用类型r a p i dc y c l i n g r c 1 4 4 为f 2 代构建的a f l p 遗传图谱对开花时间进行了q t l 定位，检测到3 个 与开花时间有关的q t l 。 程斐等【19 】在大白菜抽薹性状的遗传规律研究中指出大白菜的抽薹期可能不总 是单基因控制的性状，而是受多基因控制的性状，而且指出了早抽薹性状对晚抽 薹性状为部分显性。他指出抽薹性状受环境因素影响小，晚抽薹的表现型与基因 型相关程度大，亲本能够较稳定地将其晚抽薹性遗传给以后的各个世代。夏广青1 2 0 j 通过对易抽薹的秋大白菜自交系1 0 3 9 和耐抽薹的春大白菜自交系b 1 7 的g a 处 理研究表明：g a 可以促进l f y m r n a 的积累和表达，双链上刀基因的导入则可 以明显延迟白菜的抽薹开花。黄细松【2 l j 通过低温处理发现白菜在处理后f l c 的表 达非常弱，当植株茎端开始向生殖生长转化时f c a 和刀的表达有增强的趋势， 但是f l c 和f c a 之间没有明确的关系。 g r a n t 和b e v e r s d o r f 【2 2 】认为，油菜开花期受加性显性基因控制。s e m y k 和 s t e f a n s s i o n 2 3 】，s c h u l e r 等【2 4 1 认为油菜开花期无明显的杂种优势，但存在超亲分离。 z 锄a 1 1 【2 5 】认为，油菜开花期受多基因控制，但存在主基因效应。l a g e r c r a n t z 等 2 6 】 报道甘蓝型油菜的开花期受3 对主基因控制。t c u t o n i c o 等【2 7 】在b n a p u sr f l p 图的 第2 ( l g 2 ) 、第8 ( l g 8 ) 和第9 连锁群( l g 9 ) 上标记出控制开花期的3 个主 基因。管荣展【2 8 】利用主位点组分析方法解析了1 4 个甘蓝型油菜品种间的杂种开花 期性状，结果和l a g e r c r a n t z 等的相同。戚存扣和盖钧镒 2 9 j 利用该方法对不同地理 来源的1 2 个甘蓝型油菜品种双列杂交组合的开花期的遗传差异进行了研究，发现 开花期的遗传受4 个主基因控制，并且各主基因作用方向、效应大小不等。蔡长 春等d o 利用主基因一多基因混合模型对一个d h 系在三地的开花期和光敏感性进 行了遗传分析，发现甘蓝型油菜的开花期和光敏感性主要由2 对或者2 对以上主 2 第1 章文献综述 im ：ie ,i i ii 皇曼曼曼曼曼曼曼皇 基因及多基因控制，同时不同光周期条件下开花期基因间的互作模式有所不同。 f e r r e i r a 等 3 1j 以春油菜品种s t e l l a r 和冬油菜品种m a j o r 构建的d h 系为材料，用包 含有1 3 2 个r f l p 标记的遗传图谱对开花期性状进行q t l 定位，将主效应q t l 定 位到l g 9 上，另外还检测到2 个微效位点。o s b o m 等【l6 j 对该群体进行了进一步的 研究并和白菜的开花期q t l 定位结果作了比较，发现有2 个主效应q t l 是一致的。 将这些位点所在的遗传图谱和拟南芥基因组进行序列比对后发现这些q t l 所在区 域和拟南芥第5 染色体上包含f l c 、c o 基因在内的区段同源。b u t r u i l l e 等【3 2 j 利用 4 个回交群体定位了7 个开花时间的q t l ，一共可以解释表型变异的5 9 。z h a o 等【3 3 j 在分析一个包含2 8 2 个株系的d h 群体在欧洲和中国4 点试验的结果时也发 现了这个现象，在所定位的7 个开花期q t l 中有3 个位点还同时控制成熟期。 d e l o u r m e 等【3 4 j 分析了1 个由冬油菜d a r m o r b z h 和春油菜y u d a l 构成的d h 群体在 3 个环境中的花期并进行了q t l 定位，共找到8 个q t l ，分别可以解释表型变异 的1 5 到2 7 ，其中位于n 1 ，n 1 6 和n 1 7 上的q t l 加性效应为负值，说明冬油 菜亲本d a r m o r - b z h 的等位基因促进开花。 b a g g e t t 和w a h l e r t | 3 s j 根据青花菜和甘蓝的杂交组合，通过f l 和f 2 的表型分析 发现开花期受数量性状控制，以加性效应为主，并且一年生对两年生是显性效应。 m e r o 和h o n m a 1 4 儿弘j 分析了b r a p as p p p e k i n e n s i s 的需春化特性发现该特性由一个 或两个呈加性效应的主效基因控制。f e r r e i r a t 3 l 】基于一年生和二年生栽培种杂交所 得的b n a p u s 的d h 群体研究表明春化主效基因位于l g 9 上。c a m a r g o 和o s b o m 【3 刀 在甘蓝中检测到的3 个q t l s 可以解释5 4 1 的开花期变异，并且还发现其中两个 区间存在互作。b o h u o n 等【3 8 】在甘蓝中鉴定了位于4 个连锁群上的q t l ，通过与拟 南芥基因组序列比对发现所有q t l 区间与拟南芥第5 染色体上包含有许多开花基 因的区段同源。r a e 等1 3 刿利用建立的甘蓝重叠替换系定位了1 1 个开花性状的q t l ， 分别位于0 l ，0 2 ，0 3 ，0 5 和0 9 。陈书霞等【4 0 】通过对芥蓝和甘蓝杂交的f 2 群体 抽薹期性状q t l 扫描，得到位于连锁群l g l 、l g 2 、l g 3 上的3 个q t l 位点。 l g l 连锁群上的q t l 位点可以解释开花时间变异的9 1 ，为主效基因，呈负加性 效应。在连锁群l g 2 上的q t l 位点可以解释开花时间变异的8 9 6 ，呈正加性效 应。连锁群l g 3 上的q t l 位点解释开花时间变异的8 9 6 ，呈负加性效应。3 个 q t l 均为主效基因。采用联合分析时，3 个q t l 位点联合解释开花时间的9 1 1 。 l a g e r a n t z 等1 2 6 j 在黑芥中定位了一个q t l ，找到候选基因为c o 同源基因，该基因 是拟南芥光周期调控途径中的重要基因。 1 2 抽薹调控途径 对于抽薹的相关研究报道最早见于1 9 5 2 年【4 1 1 ，现在对于抽薹以及其相关联的 西南大学硕十学何论文 ! ii i 舅曼曼曼曼量! ! 曼曼皇曼曼曼曼曼皇量舅曼曼皇曼曼曼曼曼量曼曼量曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼璺曼曼曼曼曼曼曼曼鼍皇曼曼舅曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼曼曼寰 开花时间调控问题从传统生理方面主要提出了开花素学说、营养物质转移假说和 多因子控制假说三种模式【4 2 1 。抽薹受到内源信号和环境因子的双重作用，通过这 种作用形成一种复杂的网络信号途径。通过对双子叶模式植物拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 深入研究，目前已确定拟南芥有5 1 个与开花相关的位点【4 3 1 ，从中至少 可以确定4 条主要的调控遗传途径：自主途径、赤霉素途径、春化途径和光周期 途径。其中前两条途径主要受植物内源信号影响，后两条途径主要受环境因素的 调型4 4 1 。 自主途径的基因不论日照长短都会促进开花，而不依赖于环境条件，而拟南 芥自主途径的突变体在任何日照条件下都延迟开花，尤其在短日照条件下的晚花 表型更为明显。春化作用或低比率红光：远红光能恢复自主途径突变体的正常开 花表型1 4 5 1 4 6 1 。现在自主途径已克隆了7 个突变体：f c a 、f p a 、f y 、f l d 、l d 、 f 陋和凡斟4 7 1 。自主途径的基因可以抑制f l c 的表达，因此它们突变体中f l c 的m r n a 的水平比野生型、长日照途径和赤霉素途径的晚花突变体高。f c a t 4 9 1 、 f p a 5 0 1 、e l k f 4 7 和f y 5 1 1 4 个组份编码r n a 结合蛋白，抑制f l c 表达，它们主要 作用于凡c 的前体m r n a 。 赤霉素途径主要是由赤霉素控制生长发育调节抽薹开花过程。通过赤霉素调 节植物抽薹开花的分子机理主要是g a 可以激活开花基因l f y 的启动子，从而加 强l f y 的转录活性【5 2 。现在已克隆的g a 生物合成基因主要有g a j 、g a 4 和g a 5 。 g a 的信号传导途径则是双向调节g a 的含量，通过对g a 的调节进而完成对抽薹 开花时间的调控【5 3 1 1 5 4 1 。 春化作用是冬性植物诱导抽薹开花中有着不可替代的作用，通过对拟南芥开 花相关位点的定位可以确定其中2 8 个与春化作用相关，其中最主要的两个显性位 点是f l c 和删【5 5 】。f l c 编码开花抑制物【5 6 1 。删增强f l c 的转录活性，f l c 通 过f r l 的参与延迟植物开花。在拟南芥中现在已发现6 个与春化作用直接相关的 基因：v r n l 、v r n 2 、v r n 3 、v r n 4 、v r n 5 和v i n 3 5 7 】【5 8 】。 光周期途径将光照的时间信号与植物的开花启动联系在一起。植物对光周期 的感应需要光受体和昼夜节律钟的共同作用，光受体可分为3 类：隐花色素、光 敏色素和紫外光b 类受体。隐花色素和光敏色素通过吸收光谱调节植物发育。昼 夜节律钟是植物体内在调节系统，可以保证植物的生理状态和外界节律的同步f 5 9 】。 在拟南芥中已寻找到2 种隐花色素：c r y l 和c r y 2 ，5 种光敏色素：p h y a 、p h y b 、 p h y c 、p h y d 和p h y e 删川和4 种节律相关基因：t o c l 、皿、l h y 和c c a l l 6 2 】。 1 3 分子标记技术 分子标记一般认为可以分为两种，广义上的分子标记主要指d n a 和蛋白标记， 4 第1 章文献综述 而狭义分子标记则仅仅指d n a 标记1 63 | 。现在一般所说的分子标记通常指以聚合酶 链式反应( p c r ) 扩增技术为基础，将扩增结果用电泳检测，反映基因组某种变异 特征的特异性d n a 片断。由于分子标记是直接从分子水平检测d n a 的变异性， 可以有效避免环境因素对表达的影响，通过分析位置不同的d n a 条带来展示遗传 的差异性，这些条带基本可以看作是形态学标记在分子水平的展示，但相对于形 态学标记来说，分子标记具有的检测位点无限话的特点更加有利于后期工作，所 以分子标记现在越来越受到重视。相对传统标记，分子标记具有无表型效应、不 易受环境影响、标记数量庞大等优点奠定了其在遗传图谱构建、抗性基因定位、 辅助育种以及品种鉴定等方面广泛应用的基础。 随着整个分子生物学学科的发展，人们发明了一系列以d n a 变异为基础的分 子标记方法。最早的分子标记是在1 9 7 4 年由g r o d z i c k e r t 删等人发现的r f l p ，到 了1 9 8 0 年，人类遗传学家b o s t e i n 提出利用r f l p 来构建遗传连锁图谱的构想， d o m s k e l l e n 等在1 9 8 7 年利用r f l p 绘制了第一张人类遗传图谱，就此揭开了分 子标记技术大规模应用的序幕。最近2 0 年在人类基因组研究计划的推动下，分 子标记技术的研究与应用得到了长足发展。分子标记所具有的简单、快速、直接、 可以检测植物的各个组织、器官及整个发育时期、不易受自然环境及植物生长发 育时期的特异性影响的特点越来越受到广大科研工作者的重视，在基因定位、遗 传作图等方面的作用越来越大。 1 3 1 简单重复序列间多态性标记( i s s r ) i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 标记是由z i e t k i e w i c a t 韶j 等在1 9 9 4 年提出 的一种新兴利用加锚微卫星寡核苷酸做引物在简单重复序列( s s r ) 5 端或3 端加 上2 4 个随机选择的核苷酸，引起特定位点退火，保证引物与基因组d n a 中的 s s r 的5 或3 末端结合，导致位于两个重复序列间的保守d n a 序列经由p c r 扩 增得到结果。根据其技术特点，i s s r 标记又被命名为随机扩增微卫星多态性 ( 啪s ) 、微卫星引动p c r ( p c r ) 等名称。由于i s s r 引物本身是一组微卫 星序列，所以扩增产物的多态性主要由引物的结合位点变化引起的，扩增产物的 多态性变化都是由扩增区域内的微卫星d n a 序列的插入、缺失或重复单元数目变 异引起的。 真核生物特别是植物中含有大量s s r 序列【8 9 】【矧，而其变异速度又特别快，因 此基因组中即含有大量i s s r 位点信息【9 1 1 。与s s r 相比，i s s r 标记主要是结合了 p a p d 的通用性与s s r 的大部分有点。与r a p d 标记相比，i s s r 由于采用的引物 较长( 1 6 2 5 b p ) 、退火温度较高，所以重复性较好。与s s r 标记相比，i s s r 不需 要对目标d n a 进行先期测序、引物在不同物种间具有通用性，因此具有更好的通 西南大学硕士学f 7 ：论文 用意思，尤其适合在基因组研究方面较为滞后的物种。由于i s s r 引物不需要预先 d n a 测序，降低的实验成本、提高了实验效率，也正因为如此，导致某些i s s r 标记可能在基因组d n a 的特定区域无法找到配对区域从而缺少相应的扩增产物。 i s s r 标记通常显示为一种类孟德尔式的显性或共显性遗传，在基因组d n a 中显 示出良好的稳定性和多态性。i s s r 标记的优点：引物不需要预先的d n a 测序； 显性标记呈孟德尔式遗传；具有很好的稳定性和多态性。缺点是：不用引物的反 应条件不尽相同，同一引物也不能适应所有物种，所以i s s r 反应成功的关键在于 寻找到重复性好、多态性强的引物m j 。 1 3 2 随机引物扩增多态性标记( r a p d ) r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ) 标记是19 9 0 年由w i l l i a m s 和 w e l s h l 6 9 】等领导的两个研究小组同时提出，以一系列随机序列的寡聚核苷酸单链为 引物，对所研究的基因组d n a 进行p c r 扩增，对扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测扩增产物的多态性 7 0 】，进而推测基因组d n a 相应区域的多态性。当某一引物同模板d n a 有互补的结合位点时，这些结合位点 在基因组某些区域内的分布符合p c r 扩增条件就可以扩增出p c r 片段。r a p d 是 一种可以进行全基因组覆盖的、快速的分子标记手段。因为r a p d 使用了一种和 p c r 相似的技术，如果基因组d n a 发生变异就会改变结合位点的改变进而导致 p c r 扩增片段发生变化，因此通过分析扩增产物的变化，就可以检测基因组d n a 的多态性。r a p d 的引物序列一般长度为1 0 b p ，单一引物的多态性有限、检测序 列特定，但由于其引物序列庞大所以理论上可以覆盖全基因组，从而实现对全基 因组d n a 的多态性检测【7 1 】【8 0 1 。r a p d 技术的优点：操作简便、快速、只需要少 量的d n a 、对d n a 制备的质量要求不高、无需同位素或非同位素标记且一套引 物可用于不同生物的基因组分析，缺点：绝大部分r a p d 是显型标记，不能区分 基因型是纯合或是杂合的，每个标记提供的信息量少，并且重复性差【8 1 1 。 1 3 3 微卫星标记( s s r ) s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 标记是由m o o r e t 8 5 1 等和s o l l o t t e r e r 8 6 】等于1 9 9 1 年提出的，它以1 “个核苷酸为单位串联重复达几十个甚至上百个的核苷酸序列， 在其两端有一段保守的d n a 序列，通过其设计成为一对互补的引物序列，然后通 过p c r 扩增和电泳分析得到基因组d n a 的多态性图谱。s s r 标记的优点：呈孟 德尔式遗传，共显性；多态性丰富；稳定性好，重复性高，检测技术简便快捷，实 验成本低；对d n a 数量及纯度要求不高；引物序列公开发表，易于传播使用。s s r 分析的缺点：必须针对每个染色体座位的s s r ，测定并找到其两端的单拷贝序列 6 第1 罩文献综述 设计引物1 8 7 j 。 1 3 4 扩增片段长度多态性( a f l p ) a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 标记结合了r f l p 和r a p d 的优点在1 9 9 3 年由z a b e a u t 8 2 矛1 v o s 8 3 1 创立和发展起来。将整个基因组d n a 使用 一对酶切位点个数有差异的内切酶组合进行酶切，再通过p c r 进行选择性地扩增， 在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上电泳产生一组特异的d n a 限制性片段的图谱。 a f l p 的优点：有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量 位点，因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的a f l p 标记。 多态性水平高、检测位点高、速度快。缺点：对基因组纯度和反应条件要求较高， 另外用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入并且需要用同位素来检测， 相对比较费时耗财瞰】。 1 3 5 限制性酶切片段长度多态性( r f l p ) r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 属于第一代分子标记技术是 在1 9 7 4 年由g r o d j i e k e r 创立的。r f l p 以g d n a 和c d n a 克隆作为探针【硎，使用 细胞核d n a l 6 5 1 或者细胞器d n a 删【6 刀为模板，将d n a 经限制性内切酶消化后，通 过与探针进行杂交而检测到的d n a 片段长度多态性。这种多态性与限制性内切酶 在d n a 上识别切点的分布有关。不同的限制性内切酶会特异性的识别d n a 链上 的特异性核苷酸序列，从而在特定位点切开d n a 链，形成特异性的d n a 片段。 r f l p 主要反映d n a 水平上的变异，任何d n a 序列的改变均会改变酶切位点间 的d n a 片段长度，不同物种的d n a 序列是不同的，同一物种的不同的个体的r f l p 如果不同，则显示其d n a 序列一定发生了某种程度的变化，这种变化经s o u t h e m 杂交及放射自显影就会使r f l p 带的特征有所改变，由此即可对生物的变异进行分 析。r f l p 标记的优点是：无表型效应、共显性、标记可以覆盖全基因组、可利用 的探针多、不受环境及生长发育阶段影响、近中性变异。缺点是：对d n a 质量要 求高，需要量大，操作复杂，通常要接触放射性【6 8 1 。 1 3 6 单核苷酸多态性( s n p ) s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 是指发生在d n a 上某个特定位置上的 单个碱基变异。对s n p 的分析不需要凝胶电泳，并且s n p 数目庞大，它以寡核苷 酸杂交分析为基础，小于5 0 碱基的短的单链d n a 分子在适当的条件下，一般寡 核苷酸与另一个d n a 分子仅在可形成完全的碱基配对时才能杂交，如果有一个位 置不能形成碱基对，则不能杂交。s n p 标记相比传统分子标记技术的不同主要在 于直接以序列变异作为标记，使用d n a 芯片进行检测。因此s n p 作为第三代遗 两南大学硕十学位论文 传标记方法有着全新的优势。s n p 标记的优点：绝大部分为2 个等位基因、共显 性遗传、可直接对杂交后代进行单体筛选、覆盖整个基因组、检测快速易自动化、 重复性好。缺点是成本高昂、定位有效s n p 困难【9 2 】。 1 4 基因定位策略 作物中许多目标性状常受到主效基因的控制如抗病性、育性、抗逆性等，这 样就表现为质量性状遗传的特点，但是这些性状绝大部分并不是典型的质量性状， 而是除主效基因控制外还会受到很多微效基因的影响，因而表现为非典型的质量 性状。这些目标基因寻找与其紧密连锁的d n a 分子标记可以有效减轻传统育种手 段的工作强度，同时也为该基因的图位克隆奠定下良好的基础。为了满足目标基 因定位的需要就要培育特殊的遗传群体，这些群体必须满足以下要求：群体中除 目标基因所在座位的局部区城外，基因组d n a 序列的其余部分都是相同的。在这 样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。现在构建满足基因定 位需要的群体的主要方式分为两种：一是近等基因系法( n e a ri s o g e n i cl i n e s n i l ) ； 二是混合分离群体分组法( b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ， b s a ) 。另外还有极端个体 分组和隐性基因组分析法( b u l k e d e x t r e m e sa n dr e c e s s i v ec l a s sa n a l y s i s ，b e r c a ) 和d n a 池分析法。 1 4 1 近等基因系法 利用近等基因系法进行基因定位的主要原理就是比较轮回亲本、近等基因系 ( n i l ) 及供体亲本三者的标记基因型，当n i l 与供体亲本具有相同的标记基因型， 但与轮回亲本的标记基因型不同时，则该标记就可能与目标基因连锁。 在目标基因所在的染色体区域附近，检测到d n a 标记的机率大小取决于被导 入的染色体片段的长度及轮回亲本和供体亲本基因组之间d n a 多态性的程度【9 3 1 。 检测机率随培育n i l 中回交次数的增加而降低。当轮回亲本和供体亲本分别属于 栽培种和野生种时，更有可能发现多态性的分子标记。相反，轮回亲本和供体亲 本的亲缘关系越密切，其多态性的分子标记就越少。导入的染色体片段越大则轮 回亲本与供体亲本间多态性越大，但片段过大又易导致在回交过程中分子标记与 目标基因的连锁程度降低。 通过筛选大量d n a 探针和p c r 引物或采用多种限制性酶与探针组合，可以 提高获得与