硕士论文-双水相酶法转化L苯丙氨酸的研究.pdf

南京工业大学 硕士学位论文 双水相酶法转化l-苯丙氨酸的研究 姓名：孙广海 申请学位级别：硕士 专业：生物化工 指导教师：周华;韦萍 20040501 双水相酶法转化l 苯丙氨酸的研究 捅要 l 苯丙氨酸是一种重要的合成中间体，在食品和医药领域有广泛的应用，可 作为食品添加剂、抗癌中间体和合成阿斯巴甜的原料，具有良好的市场前景。 双水相生物转化体系是一种新型的生物转化体系，具有许多适合于生物转化 的特点，在抗生素、有机酸和多肽的合成领域已有成功应用的先例。本文以双水 相体系作为生物转化体系，研究了双水相体系在酶法合成l 苯丙氨酸中应用的可 行性。本文主要考察了各个因素对分配系数的影响，确定了理想的双水相体系的 组分配比，考察了细胞在双水相体系中的稳定性和酶法合成l 一苯丙氨酸的可行 性，并对聚乙二醇( p e g ) 苯丙酮酸钠盐这一新型双水相体系进行了探索。 本文研究了不同的双水相体系对酶法合成l 。苯丙氨酸路线的底物、产物和细 胞等物质的萃取分离效果，初步选定p e g l 0 0 0 ( 2 0 ，w w ) n a 2 h p 0 4 ( 1 6 w w ) 为反应体系，底物苯丙酮酸的分配系数达到5 5 6 ，对产物l 苯丙氨酸的分配系 数达到1 0 6 ，对细胞的分配系数达到1 1 2 ，基本实现将底物和生物催化剂萃取 到一相、而产物萃取到另一相的目的。萃取的最佳条件是：p h 值为8 5 ，温度 为3 9 。c ，n a c i 盐浓度为2 0 9 l ，表面活性剂加入量为0 0 2 。 大肠杆菌菌体内的转氨酶在传统水相体系中催化能力下降很快，而双水相体 系中的p e g 组分对细胞具有保护作用，可以实现细胞的重复利用。在单批次转 化中，双水相体系的产物转化率相对于传统水相体系仅有少量提高，而在多批次 转化中，产物转化率则比传统水相体系提高了2 7 4 。 研究表明，p e g 可以直接和反应底物苯丙酮酸钠盐溶液形成双水相体系， 丰富了双水相体系的范围。实验表明，无机盐和苯丙酮酸钠盐可以联合作用与 p e g 形成双水相。若单纯用苯丙酮钠盐溶液，则需要很高的浓度( 6 0 9 l ) 才能 与p e g 形成双水相。实验还利用在这一体系多批次转化过程中细胞沉淀的现象， 采取在反应若干批次后更换细胞的方法，实现了双水相体系生物转化的连续化。 关键词：l 苯丙氨酸生物转化般水相体系分配系数 a b s t r a c t l p h e n y l a l a n i n e i sa s i g n i f i c a n to r g a n i c c h e m i c a le n g i n e e r i n gi n t e r m e d i a t e ， w h i c hi sw i d e l yu s e di nm a n yf i e l d ss u c ha sf o o d ，m e d i c i n e ，a n dc h e m i c a le n g i n e e r i n g i ti sa m a j o r f e e da d d i t i v et of o o d ，a n da l li n t e r m e d i a t ef o ra n t i c a n c e rm e d i c a m e n t f o r t h em o r e ，i ti sav i t a lm a t e r i a lt os y n t h e s i z ea s p a x t a m e s ，w h i c hm a d ei tw i d e l yn e e d e d i nt h ef u t u r em a r k e t a q u e o u st w o - p h a s es y s t e m i san e w - s t y l eb i o c o n v e r s i o n s y s t e m d u et oi t sm a n y a d v a n t a g e s ，a t p sh a s b e e nu s e di np r o d u c t i o no fa n t i b i o t i c s ，o r g a n i c a c i d s ，a n d p e p t i d e s i nt h i sp a p e r ，a t p sw a su s e da s ar e a c t i o ns y s t e m ，a n dt h ep o s s i b i l i t yo f u s i n ga t p si n t h e w a yo fs y n t h e s i z el - p h e n y l a l a n i n ec a t a l y z e db ye n z y m ew a s d i s c u s s e d t h ei n f l u e n c eo fa l lt h ef a c t st oe x t r a c t i o no ft h ec o m p o n e n t su s e di nt h e s y s t e m w a sr e s e a r c h e d ，a n do p t i m i s mc o m p o u n dw a ss e l e c t e d t h e s t a b i l i t y o f e n z y m ee m b o d i e d i ne c o l id u r i n gt h er e a c t i o np r o c e s sw a st e s t e da n dt h ep o s s i b i l i t y o f u s i n ga t p sa s ar e a c t i o ns y s t e mw a sr e v i e w e d i nt h ee n d ，t h et h e o r yo fa t p s c o m p o s e db yp e g p h e n y l p y r u v i c a c i ds o d i u ms a l t w a sr e s e a r c h e d t h ee x t r a c t i o ne f f e c t so fd i f f e r e n ta t p st os u h s t r a t e ，b a c t e r i a , a n dp r o d u c tu s e d i nl p h e n y l a l a n i n es y n t h e s i z ew e r ea l s od i s c u s s e d a na t p s c o m p o s e db y p e g i0 0 0 ( 2 0 ，w w ) n a 2 h p 0 4 ( 1 6 ，w w ) w a ss e l e c t e da s t h er e a c t i o ns y s t e m ，i n w h i c h t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n tf o rs u b s t r a t e p h e n y l p y r u v i e a c i dw a s 5 5 6 ，f o r p r o d u c t l - p h e n y l a l a n i n ew a s1 0 6 ，a n df o r b a c t e r i aw a s1i 2 i nt h i ss y s t e m ，t h es u b s t r a t ea n d b i o - c a t a l y z em a t e r i a lw e r em o s t l ye x t r a c t e dt o o n ep h a s ew h i l ep r o d u c tw a sp a r t l y e x t r a c t e dt ot h eo t h e r , t h eo p t i m i s mc o n d i t i o nw a s ：p ha t 8 5 ，t e m p e r a t u r ea t3 9 “ c ， c o n c e n 舡m i o no f s a l tn a c la t2 0 9 l ，a n dc o n c e n t r a t i o no f s u r f a c t a n t s 砒o 0 2 t h ec a t a l y z e a b i l i t yo fe c o l i d e c l i n e dq u i c k l yi nt r a d i t i o n a l a q u e o u ss y s t e m ， w h i l ei na t p s ，d u et ot h ep r o t e c t i o nt oc e l l sb yp e g b a c t e r i ac o u l db eu s e da s b i o - c a t a l y z ef o rm a n y t i m e s i ns i n g l e - b a t c hc o n v e r s i o n ，t h ep r o d u c t i v i t yi na t p sw a s j u s t al i t t l e h i g h e rt h a ni n t r a d i t i o n a l a q u e o u ss y s t e m ，w h i l eb e c a u s em u t i - b a t c h c o n v e r s i o ni na t p sh a dt h e a d v a n t a g eo fr e m o v i n gp r o d u c t sd u r i n gc o n v e r s i o n ， w h i c hc o u l dp a r t l yr e l e a s ep r o d u c ti n h a b i t a t i o n ，t h ep r o d u c t i v i t yi ni tw a si m p r o v e d 2 7 4 h i g h e r t h a ni na q u e o u ss y s t e m b e s i d ea t p sc o m p o s e db yp o l y m e r p o l y m e r , p o l y m e r s a l t ，an e w t y p eo f a t p s c o m p o s e db yp o l y m e r o r g a n i ca c i dw a sd i s c o v e r e d i tw a sf o u n dt h a tp e g a n dt h e s u b s t r a t es o l u t i o no fp h e n y l p y r u v i ca c i ds o d i u ms a l ti n h i g hc o n c e n t r a t i o nc o u l d d i r e c t l yf o r mat y p eo fa t p s ，t h u se n l a r g e dt h ef i e l do fa t p st h e o r y i tw a sa l s o p r o v e dt h a tp h e n y l p y r u v i ca c i d s o d i u ms a l ta n di n o r g a n i c c o m p o u n dc o u l db o t h c o m r i b m ef o r m i n go fa t p s u s i n gp h e n y l p y r u v i ca c i ds o d i u ms a l t a l o n e ，t h e c o n c e n t r a t i o nm u s tr e a c ha sh i g ha s 6 0 9 l b yu s i n gap h e n o m e n a lt h a tb a c t e r i a d e p o s i t e da f t e r s e v e r a lt i m e so fc o n v e r s i o ni nm u t i b a t c h c o n v e r s i o n ，t h ed e p o s i t b a c t e r i aw a sr e m o v e da n dn e wb a c t e r i aw a sa d d e d ，t h u s ，t h ec o n t i n u e sc o n v e r s i o n c o u l db er e a l i z e d k e y w o r d s l p h e n y l a l a n i n e ，b i o - c o n v e r s i o n ，a q u e o u st w o - p h a s es y s t e m ，p a r t i t i o n c o e 箭c i e n t 作者声明 本人郑重申明：本人恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的论文是我个人 在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以 标注和致谓 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，亦不 包括为获得南京工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 签名：酏，亡囱日期：呈翌! ：乏侈 关于论文使用授权的说明 本人完全了解南京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密的论文在解密后应遵守此规定。 签名：磊趟导师签名：眸日期：趱 关于知识产权的声明 本论文取得的研究成果( 包括提出的创新构思、得到的实验规律和科学结论 等) ，其知识产权全部归南京工业大学所有。本文作者只能以南京工业大学为第 一完成单位发表本论文的研究成果。其他个人及单位未征得南京工业大学的许 可，不得以任何方式使用本论文的研究成果。违反上述规定者将承担相应的法律 责任。 签名：丕：渔导师签名：咝 开期：趣竺耋。寥 第一章文献综述 1 1l 苯丙氨酸简介 1 1 1l 苯丙氨酸的理化性质 l 苯丙氨酸，又称a 一氨基化肉桂酸，学名2 一氨基一3 一苯基丙酸，c a s 登记 号为6 3 9 1 。2 ，分子式为c 9 h l l n 0 2 ，分子量为1 6 5 1 9 ，等电点为p h 5 4 8 ：在水溶 液中，l 一苯丙氨酸存在两个解离平衡，其p k 。l 和p k a 2 分别是1 8 3 和9 1 3 。苯丙 氨酸纯品为白色粉末，昧苦，微溶于醇，不溶于苯，熔点为2 3 8 “ c 。2 5 。c 时在水 中溶解度是2 9 7 9 l o o g 水f i l 。其结构式如下： c 0 0 h i 【、夕5n h 2 图1 ：l 苯丙氨酸结构式 f i g l ：s t r u c t u r eo f l - p h e n y l a l a n i n e 1 1 2l 一苯丙氨酸的功能与应用 1 1 | 2 1l 苯丙氨酸的功能 苯丙氨酸在自然界中广泛存在，但含量都不高。如在卵、乳和动物蛋白中含 量为5 6 ，植物蛋自中为1 ，单细胞中为3 5 。l 苯丙氨酸具有生 理活性，人和动物都不能合成，必须从外界摄取。它主要存在纤维蛋白或血红蛋 白中，影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，还参与消除肾与膀胱功能的损耗。 在生物体内，l 苯丙氨酸是转化酪氨酸的原料。l 苯丙氨酸和酪氨酸的缺乏与代 谢正常与否和人的健康有密切的关系。因此，l 苯丙氨酸成为一些氨基酸输液、 氨基酸胶囊和氨基酸营养品所必需的成分。 1 1 2 2l 苯丙氨酸的应用 l 一苯丙氨酸作为人体所需的八大氨基酸之，在医药、食品领域有广泛的应 用1 2 1 。 a 食品添加剂苯丙氨酸可以作为营养强化裁以及饮料添加剂等，添加于食 品中，除了起到强化苯丙氨酸的作用外，还与糖类起氨基羰基反应，改善食品 的风味，按我国g b 2 7 6 0 8 6 规定可作香料。 b 抗癌药物中间体苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体，许多研究者根 据癌细胞对氨基酸的特殊要求，以氨基酸为载体，把抗癌药物分子或基团载入肿 瘤区。达到既能抑制肿瘤生长，又能降低肿瘤药物毒性的目的。大量事实表明， 苯丙氨酸对抑制某些肿瘤的生长起到重要作用。所以，苯丙氨酸及其衍生物对合 成某些抗癌药物是及其重要的。 c 合成阿斯巴甜苯丙氨酸的最重要的用途之一足合成二肽甜味剂，阿斯巴 甜( a s p a r t a m e ) 。它是由l 天冬氨酸与l 苯丙氨酸结合而成的缩二氨基酸的甲 酯，具有很强的甜味剂特性，其甜度大约为蔗糖的1 5 0 2 0 0 倍，没有苦味，还 有特殊风味，而且发热量极低，很适合糖尿病患者使用。目前只有美国纽特公司 和日本味之素公司能够生产l 一苯丙氨酸，且产量远远不能满足市场需要，因此， 及时开发、改进和研制l 一苯丙氨酸将有良好的市场前景。 1 1 - 3l 苯丙氨酸的合成方法 l 苯丙氨酸的生产方法主要有直接发酵法、化学合成法、蛋白质水解提取法 和酶转化法等四类”3 。其中，直接发酵法产酸率低，且提取精制十分困难；化学 合成法的苯丙氨酸为d 、l 混合型，其光学拆分难度较大；蛋白质水解提取法杂 质成分复杂，分离提取是主要难点，且生产规模受到生产原料的制约；利用酶转 化法合成l 一苯丙氨酸，大多采用一步或两步酶促反应，l 一苯丙氨酸可积累到相 当高的浓度，其后提取工艺相对较简单。由于具有转化率高、产物易于提纯精制， 同时易于连续生产等优点，酶法生产l 一苯丙氨酸的研究近年来颇受重视。根据 前体物质和酶源的不同，l 一苯丙氨酸的酶转化法生产途径主要有以下四类：( 1 ) 以苯丙酮酸为前体物质，通过转氨酶的转氨作用合成l 一苯丙氨酸 4 】；( 2 ) 以苯丙 酮酸为前体物质，通过还原性氨化作用合成l 一苯丙氨酸；( 3 ) 以乙酰肉桂酸为 前体物质，通过转酰基和转氨基的两步酶促反应合成l 一苯丙氨酸；( 4 ) 以反式 肉桂酸为前体物质，通过苯丙酮酸解氨酶合成l 一苯丙氨酸。 在方法( 1 ) 中天冬氨酸在转氨反应过程中脱去氨基形成草酰乙酸，而草 酰乙酸在如加热或草酰乙酸脱羧酶存在的条件下，又可发生脱羧反应转化成丙酮 酸。这一反应为不可逆过程，从而该反应中底物可完全被转化。其反应历程如下： 啪洲2 c x c 0 0 h h 2 n 7 h l - a s p a r t i ca c i d 9 萨c 。一 a m i n o t r a n s f e r a s e 铲c 够洲 “：， l - p h e i t v 】a l a l l i n e + 曰曰 h o o c c c c o o h 一h 3 c - - c c o o h n 2 b 0 2 p h e u y l p y r u v a t e o x a l o a c e t i ca c i dp y r u v i ca c i d 此法的优点在于：( 1 ) 天冬氨酸转氨酶只能立体选择性地利用相关的。一酮 酸催化合成相应光学活性的氨基酸，因而不需要立体异构拆分等后处理过程。( 2 ) 天冬氨酸转氨酶有很高的转化速率。( 3 ) 转氨反应底物之一的苯丙酮酸的前体可 以很方便地利用化学合成法来制备。目前，国内采用此法以游离细胞制备l 一苯 丙氨酸已实现规模化生产 7 1 ，当苯丙酮酸底物浓度为o 2 m o l l 时，反应1 2 1 8 小时，l 苯丙氨酸的转化率为7 0 7 5 。然而，利用游离细胞制备l 苯丙氨酸 的成本仍然较高，必须对酶法合成工艺进行优化，以进一步降低生产成本。 e v a n 等1 5 以苯丙酮酸为原料，用荧光假单胞菌a t c c l l 2 5 0 的完整细胞( 具 有高的转氨酶活力) 催化生产l 一苯丙氨酸。在3 0 4 0 。c 、碱性条件下转化率最 大。在p h l 2 时的转化率比在p h5 时大6 倍以上。最适细胞浓度为1 0 2 0 m g m l ( 干) 。最初转化速度与苯丙酮酸的浓度成e 比。在反应过程中，如加入 吡哆醛磷酸盐，则完整的细胞在4 8 d 后还能维持6 3 以上的转化率。细胞用海 藻酸钙固定后，在种填充床反应器中连续生产l 一苯丙氨酸，6 0 d 内，产物浓度 达可1 5 9 l 以上。 徐虹等【6 悃两菌双酶法由苯丙酮酸生产l 一苯丙氨酸。大肠杆菌e p s - - 1 0 经 培养后产生高活力转氨酶和低活力的天冬氨酸酶，而e c o l i e a 一1 则产生高活力天 冬氨酸酶和活力很低的转氨酶，耦合e p s - - 1 0 中转氨酶和e a - - 1 中a s p 酶，由 苯丙酮酸和富马酸生成l 一苯丙氨酸，该体系最佳条件为：e a 一1 和e p 8 1 0 两 种细胞质量比例为0 6 ：1 , n ( p p a ) n ( f u ) = l ：1 2 ( m o l 比) ，当p p a 浓度为o 2 4 m o l l 时， 反应6 h ，可生成3 8 5 9 ll - 苯丙氨酸。 1 2 双水相技术的发展概况 1 2 1 双水相( a q u e o u st w o p h a s es y s t e m ，a t p s ) 简介 将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合，当聚合物浓度达到一定值时，体系 会自然的分成互不相溶的两相，两相中均含有水分，从而构成双水相体系】。1 9 5 5 年a l b e r t s o n 首先利用双水相技术来分离生物分子，他主要研究聚乙二醇( p e g ) 葡聚糖( d e x ) 系统和p e g 无机盐系统在分离纯化中的应用( g 。在随后的几十 年中，这项技术有了长足的发展。在双水相的分离模型研究中，主要提出了两类 模型。个是e d m o n d 等人提出的渗透维里模型，即e d m o n d o g s t o n 方程，另一 个是f l o r y 和h u g g i n s 根据热力学的基本原理提出的晶格模型。前者在预测聚合 物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度，而后者在离子的能量概念上可 以很好的拟合实验数据州。近几年来，双水相技术在动力学研究、双水相亲和分 离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都得到了应用。可应用于如氨基酸、多 肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等物质的分离，并成功的应用于蛋 白质的大规模分离。 1 2 2 双水相成相机理【2 2 1 现在普遍认为，形成双水相的原理是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物 分子空间的阻碍作用，使其无法相互渗透，不能形成均一相，从而产生相互分离 的倾向，符合相似相容性原则。而聚合物无机盐体系的相分离则可能与聚合 物所带电荷有关。从微观结构看，聚合物分子被周围的水分子强烈水化，这会诱 导周围的水分子有一定的取向，由于两种聚合物周围的水分子结构不相容，有较 明显的排斥作用，从而形成界面。 1 2 3 双水相体系萃取技术 当被分离的物质与双水相体系充分混合以后，经过静置分层，被分离的成分 就富集在双水相体系中的上相或下相，将此富集了被分离成分的相分离出来，再 经过处理以后就得到被分离成分。被分离的物质在两相中的分配服从n e m s t 分 配定律，即k = l 么其中k 为分配系数，c t 、c b 分别代表上下相中的被分离 ，乙b 物质的浓度 i l 。当相系统固定时，分配系数k 为常数，与溶质( 被分离物质) 的浓度无关。不同的物质在特定的体系中有不同的分配系数，例如各种类型的细 胞粒子、噬菌体等的分配系数大致上都大于1 0 0 或者小于o 0 1 ”1 ；酶、蛋白质等 4 生物大分子物质的分配系数大约在o ，1 1 0 之间；而小分子盐的分配系数在1 0 左右。由此可见，双水相体系对生物物质的分离具有很大的选择性。 7 0 年代中期，m n k u l a 和k h k r o n e r 等人首先用双水相系统从细胞匀浆液 中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取过程撺】。以后，双水相萃取技术在 蛋白质和酶等生物大分子的分离纯化方面以其独特的优势，受到国内外广泛的重 视。现在双水相萃取技术已经广泛地应用于多种蛋白质的分离纯化中。 与其他生化分离过程相比，双水相体系具有许多优点 1 6 , 1 7 1 ，如其界面张力低， 适合生物大分子的溶解和维持生物活性；在体系内的反应易于放大，操作易于连 续化；环境温和，设备简单，更加经济简便等。 1 2 4 影响被分离物质在双水相体系中分配的主要因素 溶质的分配，总是选择两相中相互作用最少或系统能量达到最低的那个相， 根据相平衡时化学位相等的原则，分配系数可用g e r s o n 提出的公式来表示1 2 1 】： - - l g k = a av + 8 由十1 3 式中a 表面积 y 一一两相表面自由能之差 6 一一一电荷数 a 西一电位差 1 3 一标准化学电位 般的，大分子的表面积a 都很大，y 微小的变化都会引起蛋白质大分 子的分配系数产生很大的变化；加入系统的盐，以及体系的p h 会影响相间电位 差a 由和蛋白质所带的电荷数5 ，因而也会对分配系数产生大的影响。 由于影响分配系数的因素很多，加上各个因素间又互相影响，因此定量的 将溶质的一些分子性质和分配系数关联起来是困难的。最佳的双水相操作条件还 是要依靠实验来获得。这些影响因素主要有1 1 1 , 1 3 ： 1 水相体系的组成成分( 即聚合物或盐的种类) 。同一种物质在不同的双水 相体系的分配相差很大。例如在0 干扰素( b i f n ) 的提取中，用般 的p e g i ) e x t r a n 体系不能将0 干扰素与主要的杂蛋白分离，必须是具有 带电基团或亲和基团的p e g 衍生物，如p e g - 磷酸酯与盐的系统才能将b 干扰素分配在上相，杂蛋白则完全分配在下相，从而使b 干扰素得到分 离： 2 ，聚合物的相对分子量大小。同一聚合物的疏水性随相对分子量的加大而 增加，溶质分配系数也随之发生变化。如用p e g ( n 弛) 2 s 0 4 体系分离蛋 自质时，当p e g 的相对分子量较小时，蛋白质富集在上相，相反则富集 在下相： 3 。系线的长度。相图系线长度趋于零时，上相和下相组成相同，分配系数 为1 0 。系线长度增加，上相和下相相对组成差别增大，被分离物质在两 相中的表面张力差也增大，从而影响到分配系数。如用p e g ( n h 4 ) 2 s 0 4 体系分离脂肪酶时，p e g l 0 0 0 质量分数为0 1 ；州i - 1 4 ) 2 s 0 4 质量分数为o 2 1 组成的体系，k 为1 7 ；而当p e g l 0 0 0 质量分数为o 1 2 、( n h 4 ) 2 s 0 4 质量 分数为0 1 2 9 时，k 为0 8 5 ： 4 电解质的影响。在双水相体系中加入电解质，由于阴、阳离子在两相中 的分配差异，形成穿过相暴面的电位，从而影响带电大分子物质在两相 中分配。如在p e g d e x t r a n 系统中加入n a c l 0 4 或时，可增加上相对 带正电荷物质的亲和效应，并使带负电荷的物质进入下相； 5 p h 的影响。p h 值的变化会导致组成体系的物质的电性发生变化，也会 使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。例如，在p e g 盐 组成的体系中，通常可在相当小的p h 变化范围内使蛋白质在其中的分配 系数有较大的变化： 6 外加电场的影响。当在两相分界的垂直方向上加上电场时，由于电位差 增加而使分配系数发生改变。如用p e g 8 0 0 0 d e x t r a n t - 5 0 0 体系分离肌红 蛋白，在外加4 8 1 v c m 的电场强度4 0 r a i n 后，分配系数k 及o 8 1 变为 3 8 7 ，上相回收率从4 4 7 增加到9 8 0 。 1 2 5 聚乙二醇无机盐双水相体系简介【1 9 】 聚乙二醇葡聚糖和聚乙二醇无机盐这两种双水相体系，已经有效地用于蛋 白质及金属离子的萃取分离。由于水溶性高聚物难以挥发，反萃取必不可少，而 且盐进入反萃取剂中，对随后的分析测定带来很大的影响。另外，水溶性高聚物 大多粘度较大，不易定量操作，也给后续研究带来麻烦。事实上，普通的能与水 互溶的有机溶剂在无机盐的存在下也可生成双水相体系，并已经用血清铜和血浆 铬的形态分析。基于与水互溶的有机溶剂和盐溶液的双水相体系具有廉价、低毒、 较易挥发且无需反萃取和避免使用粘稠水溶性高聚物等特点。人们对双水相体系 中不同种类盐分相能力及不同种类有机溶剂的分相情况展开了研究。王志华，马 会民等【2 0 】研究了异丙醇、乙醇、丙酮等与水互溶的普通有机溶剂的双水相体系， 并考察了不同种类盐如( n h 4 ) 2 s 0 4 、n a 2 c 0 3 、n a n 0 3 、n a 3 p 0 4 1 2 h 2 0 、n a 2 s 0 4 、 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 、n a c l 、n a a c 等的分相能力差异。根据分相后有机溶剂相的体 积变化，双水相体系存在3 种分相类型：i 型( v 镕 v 镕) 和 1 1 1 型( 兼具i 、i i 型) 。在实验中发现，一价阴离子的盐常常生成i i 型双水相， 如n a c i 、n a a c 和n a n 0 l ；而二价或更高价阴离子的盐常生成i 型双水相，如 ( n h 一) 。s 0 4 、k 2 h p 0 4 3 h 。0 。对于同种盐如( n h 。) ：s 吼，不同的有机溶剂分相效果不 同；相同体积的有机溶剂恰好分相时所需( n h 4 ) ：s 0 4 的量也不同，分相能力差异顺 序为异丙酮 丙酮 乙醇，与有机溶剂水合作用的强弱顺序相反。对n a c i ，顺序 为异丙醇 1 ，4 一二氧六环 丙酮。 1 3 双水相体系生物催化的进展 1 3 1 双水相生物催化的特点 生物催化是生物转化的核心和关键，其高效性和高选择性是实现生物转化的 必要手段。许多生物催化过程存在反应产物浓度低、反应过程受产物反馈抑制以 及生物催化剂重复使用困难等的缺点【2 3 】，制约了生物技术产业化发展的步伐。研 究开发高效的生物催化新技术具有重要的理论和实际应用价值。 双水相生物催化技术州根据双水相的分相特性，把反应物、产物或生物催化 剂分别分配于不同的相中，可消除产物或副产物对催化反应的抑制，提高催化反 应的效率，同时使产物的提取更加便利。还可简化产物后处理工艺、降低投资和 操作费用2 5 1 ，具备了传统的上游反应一下游提取工艺所无法比拟的优越性；而且 可以强化多种生物催化反应，特别适合于大规模生物转化。加强双水相生物催化 及其相关工程技术的研究，可以极大促进其在生物技术产业化发展过程中的应 用。 双水相作为生物催化的反应体系具有其他体系所没有的优势，主要体现在以 下几个方面 2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 8 l ： 1 ) 反应和分离过程温和：由于双水相体系的晃面张力远远低于水有机溶剂 两相体系的界面张力，在含水质量百分比高达7 5 9 0 的情况下，界面张力一 般为1 10 1 0 4n m i “，且整个操作过程在室温下进行，反应和分离的操作 过程十分温和，有利于酶和细胞催化活性的发挥：体系中高聚物不但对酶或细胞 没有毒性，而且还有一定的稳定作用。 2 ) 催化效率大为提高：生物催化剂往往会受到产物或副产物的反馈抑制， 从而影响产物的积累。将双水相体系引入生物催化过程，有利于消除产物抑制、 提高转化率1 5 , 6 j 和提高产物浓度。 3 ) 生物催化荆可以重复利用：生物催化剂和产物的分相分配，使酶和细胞 的重复使用成为了可能，这将大大降低生物催化剂的使用成本【2 9 】。 4 ) 实现生物反应与产物分离的耦合：通过与下游处理过程的集成化，产物 可以被连续的提取，从而减少下游处理步骤，实现了生物转化反应与产物分离的 耦合，使工艺流程缩短、分离效率得到提高，有利于生物催化体系的工业化放大。 1 3 2 双水相体系中的生物催化研究进展 双水相体系中的生物催化主要以酶或微生物细胞为催化剂来完成。在大多数 研究中，采用了将生物催化剂分配到下相而将产物分配到上相的反应模式：将生 物催化剂分配到上相，产物分配到下相的模式也较为常见【2 9 1 。 1 3 2 1 抗生素的酶法合成 魏东芝等0 0 1 用青霉素g 酰基转移酶为催化剂，在以p e g 4 0 0 硫酸镁组成的双 水相体系中合成头孢氨苄。酶反应3 5 个小时后仍然有8 0 6 的活力。产物的产 率可以达到6 0 ，而传统反应体系中产率只能达到2 1 。 朱建航等f 3 l 】以双水相生物转化法合成头孢菌素i v ，考察了p e g 分子量、盐 种类等参数对合成的影响，研究发现在p e g 4 0 0 硫酸铵体系中添加中性盐或表面 活性剂，可以使产物的分配系数大大增加。在p e g 4 0 0 ( 质量分数2 0 ) 和硫酸铵( 质 量分数1 7 5 呦体系中，加入甲醇( 质量分数5 ) 和n a c i ( 质量分数3 ) ，产物的 分配系数可以达到1 5 2 ，最终产率可达到9 4 2 ，表明了双水相体系可以作为水 溶性产物的理想生物催化反应体系。 营学军等f 3 2 1 用重组大肠杆菌青霉素酰基转移酶生物转化青霉素g 成6 - a p a 双水相体系的组成为p e g 2 0 0 0 0 d e x t r a nt 7 0 ，底物质量浓度为7 ，在p h7 8 、 3 7 的转化率达到了9 0 ，产物在上相的纯度可达到9 6 2 ，并可直接结晶得到 目的产物。 l i 等i ”1 用大肠杆菌a t c c 9 6 3 7 产青霉素酰基转移酶在以p e g 6 0 0 0 ( 质量分数 1 5 ) 磷酸盐组成的双水相中将青霉素g 转化成6 - a p a ，细胞主要分配在下相， 6 - a p a 、p a a ( 分配系数分别达到7 3 、8 5 5 ) 主要分配在上相，避免了6 - a p a 对青霉素酰基转移酶的抑制。经过1 0 批次转化后，青霉素g 的转化率仍然可达 到9 6 。 13 2 、2 有机酸的酶法制备 y u n 等。“。考察了在不同浓度配比的聚乙烯= 胺羟乙基纤维素( p e i h e c ) 组 成的双水相中利用l a c t o c o c c u s a c t i s6 5 i 菌合成乳酸的情况。当p e l h e c 浓度在质量分数比为4 1 时，乳酸产量为1 0 9 l ；而当p e i h e c 质量分数达 到5 t 3 时，乳酸产量为1 4 9 l ，相比之下，传统体系中乳酸产量仅有3 9 l 。 1 3 23 激素的酶法合成 k a u l 等3 5 1 尝试用双水相方法将泼尼洛松生物转化成氢化可的松。采用的 a r t h r o b a c t e rs i m p l e x 菌体在双水相体系中显现出更高的活性。为了节约成本，还 试用了r e p p a l p e s 代替p e g d e x t r a n 体系，获得了成功。 f e m a n d e s 删研究了用a r t h r o b a c t e rs i m p l e x 细胞脱氢6 - 甲基2 1 一乙基皮质 醇，体系中添加表面活性剂后提高了初始反应速率，但对最终的转化产率未见明 显的提高。 1 3 2 4 功能性多肽的酶法制备 m u r a k a m i 等f 3 7 】在p e g d e x 双水相体系中以嗜热菌蛋白酶水解玉米蛋白，水 解所得的活性肽混合物被选择性萃取到下相中，从而有效的控制了蛋白质水解的 程度。 s h a r m a p 8 1 用水溶性高聚物e u d r a g i ts - 10 0 固定化糜蛋白在p e g d e x t r a n 双水 相体系中催化酪蛋白水解，8 4 的产物分配到了d e x t r a n 相，反应后通过降低体 系p h 值( 从p h 7 6 3 8 ) 的方法可把酶从p e g 相中分离出来，再回调p h 值即可 重新溶解，实现重复使用。 s i m o n 3 明建立了从用微生物细胞中分离小包核体( i b s ) 的双水相体系，在 p h 9 4 条件下，p e g s 0 0 0 ( 质量分数1 0 ) 磷酸盐( 质量分数1 0 ) 形成双水相体 系，加入o 4 m o l 的n a c i ，产物收率可达到8 7 。 1 3 2 5 其他化合物的酶法合成 c e l a l l 4 哪使用真菌t r i c h o d e n m ai r i d eq m 9 4 1 4 产的纤维素酶水解纤维素制备葡 萄糖，反应的双水相体系为p e g d e x t r a n ，其中以p e g ( 质量分数5 ) d e x t r a n t 5 0 0 ( 质量分数7 呦组成的体系转化效率最高，体系表现出的酶活比未使用前提 高了2 4 倍。 l a r s s o n 等4 1 】用c c 一淀粉酶和葡萄糖糖化酶在双水相体系中水解淀粉制备葡萄 糖，并结合超滤技术，使该反应得以连续化进行。用于成相的高聚物和生物催化 剂都可以回收再利用。整个体系可运行8 天，葡萄糖产量达到1 6 0 9 l ，酶活力比 使用单一相缓冲液提高1 5 倍。 赵风生等”2 1 报道用含腈水解酶的p s e u d o m o n a sp u t i d aj p 一1 细胞将丙稀腈转 化成丙烯酰胺，采用的体系是p e g 6 0 0 0 ( 0 0 5g m l ) k ，h p 0 4 ( 0 2 0g m l ) ，0 3 0 m o u l 丙烯腈和o 1 0g m l 湿菌体在p h9 0 、2 5 。c 条件下转化率达到8 2 4 。在 反应过程中添加丙烯腈，不断分离转化丙烯酰胺并加以纯化，转化的丙稀酰胺最 高浓度可达1 1 m o l l 。 l i 等 4 3 1 用无规共聚物e o p o m g s 0 4 双水相中以a 一淀粉酶转化淀粉。该体系 对温度敏感，在反应进行后升高温度即可形成两相。麦芽糖产率可达到1 9 9 l ， 而在水溶液中的产率只有1 5 5 9 l 。 1 3 3 影响双水相生物催化的工程放大因素分析 1 3 3 1 操作模式的选择 双水相生物催化过程的操作模式有简单的批次转化模式和成相高聚物及生 物催化剂循环使用的连续操作模式【4 4 1 。 批次转化模式的最大优势在于简单，容易在传统的反应器中放大，产物可以 通过将含产物的相静置或沉降后转移获得，所需要的操作周期较短。其缺点在于 对小分子产物或其他在两相中分配较为平均的产物，在萃取相中产量较低。另外， 由于产物在反应混合液中停留的时间与批次转化操作的时间相等，不稳定或易分 解的产物就会有损失。同时，将酶完全分配到一相而将产物分配到另一相是相当 困难的，解决办法之一是用细胞代替酶来做生物催化剂 4 5 】；另一个方法是将双水 相体系与超滤膜相联合，把双水相体系作为一个预滤装置，减少底物颗粒、固体、 细胞等对超滤膜的损害。 可实现成相高聚物和生物催化剂循环利用的连续操作模式可以克服批次式 操作的不足，但这一高度集成化方法很复杂，对设备和操作要求相对严格。所以， 目前的报道大多数是关于批次转化，产物萃取相被新的萃取相间歇替换。产物相 连续替换，同时生物催化剂相循环利用也有报道f 4 ，而从萃取完产物的产物相中 1 0 回收再利用高聚物的报道却很少。 a n d e r s s o n 4 5 1 利用双水相体系开展了以青霉素酰基转移酶半连续化制备 6 - a p a 的研究。其上相每一步都由新的上相和底物替代。由于需要中和游离酸， 最初发现6 - a p a 浓度在每一次转化之后都增加，每一次都用更小体积的上相替 换。利用提取过6 - a p a 的上相代替新的上相可部分解决这个问题。 f o l k e f 4 7 1 使用双水相体系半连续式方法，以纤维素酶水解纤维素制备葡萄糖， 转化率可达到8 7 ，产率达到2 8 9 h l ，比常规批次模式双水相转化的速率提高 了将近1 0 倍。 1 3 3 2 反应设备的设计与选型 设备设计与选型对双水相生物催化很重要，主要有以下五方面的原因：1 ) 反应物、产物在相内传质的需要；2 ) 酶、细胞或产物在相间传质的需要；3 ) 分 相的需要；4 ) 从萃取相中分离产物的需要；5 ) 高聚物循环利用的需要【4 8 】。 在双水相体系中，由于双水相闻界面张力很低、界面表面积大、传质速率高， 所需要的输入功率小，采用搅拌式反应器进行反应，以中速搅拌通常即可以给生 物催化提供足够的传质需要“。但是，要分离双水相悬液，则需要很长的静置时 间。在批次式转化中，分相仅需要将转化液静置在反应器中即可：而连续式转化 中，则需要专门的分离设备。有一些文献报道了专门设备的设计1 4 8 】，但在高速率 下似乎都不太有效。另外，细胞会在两相界面沉积而影响到分相，故将细胞完全 分配到一相是非常重要的。 尽管在大规模双水相生