硕士论文：南极衣藻谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达与定量分析.pdf

目 录目 录 1 文献综述文献综述.1 1.1 南极微藻.1 1.1.1 南极微藻的研究背景.1 1.1.2 南极微藻的生长环境.1 1.1.3 南极微藻的生态学意义.1 1.1.4 南极微藻的应用前景.2 1.1.5 展望.3 1.2 谷胱甘肽的性质及生理功能.3 1.2.1 谷胱甘肽和抗氧化3 1.2.2 谷胱甘肽和信号转导4 1.3 谷胱甘肽还原酶.4 1.3.1 谷胱甘肽还原酶的生物学意义.4 1.3.2 gr 的分布及其原因4 1.3.3 植物中 gr 的功能研究5 1.4 研究目的及意义.5 2 谷胱甘肽还原酶全长基因的克隆谷胱甘肽还原酶全长基因的克隆.7 2.1 实验材料.7 2.1.1 藻种来源.7 2.1.2 质粒载体和受体菌.7 2.1.3 工具酶及试剂盒.7 2.1.4 主要溶液和试剂的配制.8 2.1.5 主要仪器.8 2.2 实验方法.9 2.2.1 藻的培养.9 2.2.2 总 rna 的提取.9 2.2.3 ice-l gr 基因的 race 克隆9 2.3 结果与分析.16 2.3.1 总 rna 的质量鉴定.16 2.3.2 cdna 一链的合成.17 2.3.3 ice-l gr 基因全长 cdna 序列的克隆17 2.3.4 gr 基因序列特征分析18 2.3.5 ice-l gr 基因的生物信息学分析 20 2.4 讨论.21 2.4.1 chlamydomonas sp. ice-l rna 提取成功的关键21 2.4.2 简并引物的合理设计及选择.21 3 谷胱甘肽还原酶基因的原核表达谷胱甘肽还原酶基因的原核表达.22 3.1 实验材料.22 3.1.1 藻种与培养基.22 3.1.2 质粒与受体菌.22 3.1.3 主要工具酶及试剂盒.22 3.1.4 主要试剂.22 3.1.5 主要仪器.24 3.2 实验方法.24 3.2.1 重组质粒 pet-gr 构建 .24 3.2.2 重组表达质粒的提取.27 3.2.3 重组表达质粒的双酶切鉴定.27 3.2.4 基因工程重组表达菌株的诱导表达.28 3.3 实验结果.29 3.3.1 ice-l gr 基因 orf 的扩增.29 3.3.2 质粒提取结果.29 3.3.3 pet-21a 空质粒双酶切和 pcr 产物双酶切29 3.3.4 菌落 pcr 筛选阳性克隆与重组质粒酶切结果30 3.3.5 表达产物的鉴定.31 3.3.6 gr 蛋白在大肠杆菌中表达条件的摸索31 3.4 讨论.34 4 衣藻衣藻 ice-l 在不同条件下的差异表达研究在不同条件下的差异表达研究35 4.1 试剂及仪器.35 4.2 实验方法.35 4.2.1 引物设计.35 4.2.2 实验设计.36 4.2.3 总 rna 的 dnase i 消化.36 4.2.4 扩增效率的确定.36 4.2.5 gr 的荧光定量 pcr.37 4.2.6 数据统计与分析.37 4.3 结果与分析.37 4.3.1 chlamydomonas sp. ice-l gr 基因在不同盐度下的表达分析.37 4.3.2 chlamydomonas sp. ice-l gr 基因在不同 cdcl2浓度下的表达分析.38 4.4 讨论.39 5 结论结论.40 5.1 南极衣藻 chlamydomonas sp. ice-l gr 基因克隆40 5.2 南极衣藻 chlamydomonas sp. ice-l gr 原核表达40 5.3 南极衣藻 chlamydomonas sp. ice-l gr real-time pcr 表达分析.40 参考文献参考文献.41 致谢致谢.52 附录附录.53 作者简介作者简介.54 导师简介导师简介.55 南极衣藻谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达与定量分析 摘 要 谷胱甘肽还原酶(gr)是生物体内重要的抗氧化酶。本研究对南极衣藻 gr 的全 长 cdna 进行克隆，并构建了该基因的原核表达载体。同时，分析了 gr 基因在不 同盐度和 cdcl2作用前后的表达变化。此外，还克隆了南极冰藻 -肌动蛋白基因 (ice-l actin genbank accession number：hm114222)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因 (ice-l gapdh genbank accession number：hm114223)的部分 cdna 序列。 以提取的南极衣藻 chlamydomonas sp. ice-l 总 rna 为模板，根据报道的多种 藻类及植物的谷胱甘肽还原酶保守区设计简并引物，应用 cdna 末端快速扩增 (race)技术成功克隆了 ice-l gr 基因(genbank accession number：gu395492)，并 对其进行了全面的生物信息学分析。ice-l gr 全长 1913bp，包含 90bp 的 5非编码 区(utr)和 365bp 的 3 utr；开放阅读框(orf)长 1458bp，编码 485 个氨基酸，终 止密码子为 uga， 分子量计算值(mw)为 52.155kda， 理论等电点(pi)为 5.56； ice-l gr 氨基酸序列与莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)、绿色鞭毛藻（ostreococcus lucimarinus)、海链藻(thalassiosira pseudonana)、石莼(ulva fasciata)、拟南芥 (arabidopsis thaliana)、 芥菜(brassica juncea)、 大豆(glycine max)、 及水稻(oryza sativa) 的 gr 氨基酸序列同源性较高。 在克隆gr全长的基础上，构建了其原核表达载体pet-gr，并将其导入大肠杆菌 bl21进行融合蛋白的表达， sds-page电泳结果显示， 获得目的蛋白符合预计分子量。 通过对诱导时间、iptg 浓度、温度的优化，最终确定gr蛋白在大肠杆菌中诱导表达 优化条件为：iptg浓度为1.0mmol/l，28诱导3h；且表达的蛋白均以包涵体的形式 存在。 应用实时荧光定量 pcr 技术(real-time pcr)， 以 ice-l -actin 和ice-l gapdh 基因为内参照，研究了 ice-l gr 基因在低盐度、高盐度和不同浓度 cdcl2(mol/l) 作用前后的表达变化。在偏离最适生长盐度下，盐度 11、22、66 在第 24h 表达量最 大，盐度 99 在 12h 达到最大表达量；重金属 cdcl2作用后，低 cdcl2浓度诱导表达 上调，20、40mol/l 在第 12h 最大量表达，60、80mol/l 在第 18h 表达量最大。 本论文的研究结果为探讨南极冰藻谷胱甘肽及其相关酶基因的作用机理和调控 机制奠定了坚实的基础；丰富生物谷胱甘肽还原酶基因的普遍性和多样性；对于全 面了解和认识南极生物谷胱甘肽相关酶基因的结构、功能、特性，有效地阐明南极 微生物对各种胁迫的适应性都具有重要的理论指导意义，而且能为抗逆领域特别是 抗逆基因工程提供新的思路和新的基因。 关键词关键词：南极衣藻，谷胱甘肽还原酶，基因克隆，原核表达，表达分析 cloning and expression analysis of glutathione reductase gene in chlamydomonas sp. ice-l from antarctica abstract the full-length glutathione reductase gene of antarctica microalgae (ice-lgr) was cloned, and its recombinant of prokaryotic expression vector was constructed in this paper. expression level of ice-l gr under low salinity, high salinity and cadmium chloride was analyzed. partial cdna sequence of -actin gene (ice-l actin) and glyceraldehyde -3 - phosphate dehydrogenase gene (ice-l gapdh) were cloned as well. rna was extracted and separated from chlamydomonas sp. ice-l at first.and then, primers for pcr were designed according to two conserved regions of glutathione reductase reported in many other species. ice-l gr (genbank accession number: gu395492) was successfully cloned by rapid amplification of cdna ends (race) technique, and characterized by bioinformatics analysis. the full-length of ice-l gr cdna contains 1913 bp nucleotides with a 90bp 5 untranslated region (utr), 365bp of 3 utr and an open reading frame (orf) of 1458 bp, comprising 485 amino acid residues with a theoretical molecular weight(mw) of 52.155 kda and an estimated isoelectric point(ip) of 5.56.the deduced amino acid sequence shows high identities with gr from chlamydomonas reinhardtii, ostreococcus lucimarinus, thalassiosira pseudonana, ulva fasciata, arabidopsis thaliana, brassica juncea, glycine max and oryza sativa. a recombinant of prokaryotic expression vector pet-gr was constructed and transformed to e.coli. bl21 to express ice-gr protein. sds-page sesults indicated that the molecular weight of the target protein was similar to theoretic molecular weight. the optimum expression condition was 1.0mmol/l concentration of iptg, 28 induced temperature, and 3 hours induced time. ice-l gr protein was expressed as inclusion body. the expression patterns of ice-l gr under the challenge of low salinity, high salinity and cadmium chloride stress were examined by real-time pcr analysis.the expression reached a higher level after 24h in the salinity of 11, 22, 66; in the salinity of 99 group, expression level reached the maximum at 12h. low concentration of heavy metal cdcl2 upregulated gr expression. in 20 and 40umol/l groups, gr gene expressed most abundantly at 12h, but expression reached the peak at 18h in 60 and 80 umol/l group. results obtained from this study provide valuable information on further investigating the molecular mechanism of ice-l gr, and make biological universality and diversity of glutathione reductase gene more rich. there is also an important theoretical significance to comprehensively understand the structure, function and features of antarctic glutathione- related enzyme genes. and it is helpful to clarify effectively adaptative mechanism of antarctic microbes various stress. furthermore, the study can offer new ideas and new gene for genetic engineering breeding on stress-tolerance species. key words: chlamydomonas sp. ice-l, glutathione reductase, gene cloning, expression analysis 缩 略 词 缩略词 英文全称 中文全称 e.coli escherichia coli 大肠杆菌 amp ampicillin 氨苄青霉素 race rapid amplification of cdna ends 快速扩增 cdna 末端 depc diethyl pyrocarbonate 焦炭酸二乙酯 bp base pair 碱基对 h hour 小时 cdna mrna complementary dna messenger rna 互补 dna 信使 rna kd kilodalton 千道尔顿 lb luria-bertini medium lb 培养基 min minute 分钟 od optical density 光密度 pbs phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 pcr polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 rpm round per minute 每分钟转数 sds sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠 taq thermus aquaticsus 水生栖热菌 s second 秒 iptg isopropyl-d-thilgalactoside 异丙基-d-硫代半乳 糖苷 x-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-d-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-d- 半乳糖苷 rnase ribonuclease 核糖核酸酶 rt reverse transcription 反转录 eb ethidium bromide 溴化乙锭 aa nj amino acids neighbor-joining 氨基酸 临位相接法 orf open reading frame 开放阅读框 oligo oligodeoxythmidylate 寡核苷酸 1 文献综述 1.1 南极微藻 1.1.1 南极微藻的研究背景 两极地区地理和气候环境很特殊，干燥、酷寒、强辐射、低光照和高盐度是其 环境的主要特点。特别是近几十年来随着臭氧层的破坏日益严重，两极地区紫外线 辐射强度大幅增高，致使一般生物无法生存1-2。 1585 年 davis 在北极第一次发现雪藻(chlamydomonas nivalis wille)，揭开了人 们研究极地微藻的历程。1963 年，bunt 和 wood3首先报道了海冰中有色物质的研 究，发现由于微藻的大量繁殖,可使海冰表面呈棕色。此后，科学家开始对海冰中的 藻类发生兴趣，并进行了大量的观察和研究4-6。 国内外早期对南极微藻的研究多集中在生态学方面 1-10。 1996 年以来， 缪锦来 等开始从事南极微藻的实验室研究，在微藻的极端条件适应机制与活性物质等方面 进行了大量的工作11-15。 1.1.2 南极微藻的生长环境 南极微藻(又称南极冰藻，简称冰藻)是生长在南极海冰、海冰边缘或海水中的 一种极端微生物，它们既包括南极特有的藻类，也包括来源于其他水域适应了南极 酷寒条件而生存下来的种类。严酷的极地环境造就了南极冰藻特殊的生物学特征 16。南极的海冰为半固体状态，中间存在大量网状的通道和盐囊，冰藻就生活在这 些通道和盐囊中，当浮冰被别的冰块或者雪浸没在海水中,富营养的海水就流入浮 冰，促进冰藻的生长17-18。但当冰晶形成时排出的盐水会释放到这些孔洞之间，且 随着温度的降低，孔洞变小，盐度升高；而海冰融化时冰藻生活环境的盐度接近淡 水值。正是由于南极海冰特殊的物理特征，冰藻形成了不同于一般生物的特征。 极地微藻可以很好地适应极端环境，如低温、营养缺乏、极端酸性、强紫外线 辐射、变动的光照和盐度等2,13,19-20。在这种极端环境中，极地微藻有一套有效的抗 胁迫体系保护自身的光合系统、生物膜系统和酶系统，以保证微藻细胞生理活动正 常进行。因此，研究极地微藻的抗冻、抗氧化和抗辐射特性具有十分重要的理论意 义和实际应用价值。 1.1.3 南极微藻的生态学意义 南极冰藻在南极海冰区生态系统中起着重要作用21，在南大洋海冰区的初级总 产量中，南极冰藻的直接贡献额超过 20%22，是晚春和早秋碳源不足时期的有效补 充，并且是多种次级消费者的食物来源。同时，冰藻能够分泌许多有机物，并且其 残体分解也可产生大量的可溶性物质(主要是糖类)，都是其它异养生物的食物来源。 1 当海冰融化时，这些有机和无机营养物质被释放出来，为其它生物的生长提供大量 的物质和能量基础，使浮游动植物大量繁殖。南极冰藻也是南大洋食物链中关键物 种南极磷虾的重要食物来源23。因而，南极冰藻在维持南大洋食物链中起着至关 重要的作用24。 除了生态重要性以外，南极冰藻己经成为新技术的核心，是研究极地乃之宇宙 中其它冰雪星球上生物体的模式生物 25-27。 1.1.4 南极微藻的应用前景 1.1.4.1 饵料 冰藻是南极地区初级生产力的承担者之一。冰藻有较高的营养价值，其中 9 种 冰藻的蛋白质含量为干重的 30%50%28；另据报道，100g 硅藻有机物可产生的热 量比等量巧克力产生的还要高29。 磷虾是南大洋中最重要的生物资源30， 浮游植物， 特别是冰藻，是磷虾的主要食物来源。在我国，利用广阔的海洋，大力发展海水养 殖业，带动了饵料工业的发展。但是到目前为止，多数水产动物幼体阶段的生长发 育主要是依靠投喂活饵料，而贝类幼体乃至成体的生长发育始终要依靠单胞藻和微 小的饵料生物，饵料生物培养成功与否，是限制养殖业发展的主要因素31。每年春 季，育苗厂育苗时，均要培养幼苗使用的藻类饵料。此时海水的温度较低，需要对 培养饵料的海水加温，才能满足藻类生长的需要，这极大增加了育苗的成本。姜英 辉等11,32通过对冰藻的驯化培养，可使冰藻在 010的温度范围内生长繁殖，比生 长速率可达到 0.274/d，且冰藻的蛋白质含量可占冰藻干重的 30%以上。因此，冰藻 由于其较高的营养价值和低温生活的习性， 可以在我国北方地区于冬末和早春季节， 在温度比较低的情况下大规模培养，为养殖经济动物提前人工育苗提供经济饵料， 有利于水产养殖业的发展。 1.1.4.2 抗冻蛋白 植物在低温条件下，往往形成某些特殊的有机物质(如脯氨酸、羟脯氨酸和甘油 等)，在植物的抗冷性中发挥了重要作用。同时，某些无机离子能够通过渗透调节及 特殊的结合状态来降低胞内冰点，达到抗冷的作用。姜英辉等11在冰藻培养中发现 一株冰藻的培养液能够在-6-8低温条件下不结冰，-10以下结冰状态时冰藻也 可以维持生命力。然而，在冰藻中有哪些特殊的成分，以及如何发挥抗冷作用尚未 见报道。 冰藻胞外分泌物具有的抗冷冻效果，可作为天然的抗冷冻剂应用于化妆品，使 化妆品具有抗冷保湿的效果；同时，冰藻富含的羟脯氨酸，有抗纤维化的功效，可 作为天然抗皱剂添加化妆品中。在医学上，抗冻剂也有其应用的可能性，如血液制 品和其它生物制品的低温保藏33。 2 1.1.4.3 其它生物活性物质 为适应极地低温、低光照的恶劣环境条件，冰藻光合作用和生物代谢系统中的 酶在低温下保持较高的活性。主要包括产生和激活新的酶或对已有的酶进行修饰， 从而维持冰藻的正常生长和代谢34。在冰藻中可以获得具有应用价值的低温酶类。 缪锦来等对强辐射和高盐度下几种南极冰藻的保护酶系统(如过氧化物酶、 过氧化氢 酶和超氧化物歧化酶等)的变化进行了研究， 为南极微生物抗氧化系统的研究打下了 良好的基础。 近年来对微藻的研究表明，微藻中存在着丰富的结构独特的有机化合物，如多 糖、抗生素、色素等，更为引人注意的是这些代谢产物具有多种多样的生物活性， 具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和提高免疫力等活性35。 1.1.5 展望 由于南极独特的气候及地理特征，形成了一个酷寒、强辐射、低光照的环境， 生存于其中的冰藻必然对这种独特的环境具有特殊生理上的适应性，从而可以生存 繁衍。正是由于冰藻这种特殊的生理特性，必然成为研究低温生物学的良好试验材 料；此外，冰藻也是新型活性物质的潜在来源。合理地开发南极的低温藻类资源， 不仅可以从应用上丰富我国现有的微生物资源，从中开发出有价值的生物活性物质 和产品，更可为基础研究提供新型的研究材料和新思路。 目前，国际上对极地微藻的研究主要集中在藻的分类、生活史、繁殖方式、生 态和地理分布，以及细胞超微结构等方面。国内近几年虽然对胁迫条件下藻类的适 应机制等方面的研究取得了一些进展，但因相应研究工作起步较晚，进一步深入研 究尚有广阔的发展空间。 1.2 谷胱甘肽的性质及生理功能 还原型谷胱甘肽（gsh）作为一种水溶性、小分子量的抗氧化剂，它是细胞中 主要的非蛋白巯基库，是细胞中维持正常氧化还原状态的重要组成部分，参与许多 重要的生理生化过程。植物细胞的叶绿体、细胞质、线粒体等细胞区域都含有较高 浓度的谷胱甘肽36。 1.2.1 谷胱甘肽和抗氧化 gsh 是一种主要的自由巯基， 可作为抗氧化物质通过酶促或非酶促反应清除活 性氧37。参与植物的生长、发育和胁迫防御反应等38-44。谷胱甘肽可以直接还原 o2-和 oh 45，又可作为酶的底物，通过抗坏血酸谷胱甘肽循环途径、grx （glutaredoxins）、gpx(谷胱甘肽过氧化物酶)等酶促反应清除活性氧46-47。许多胁 迫条件下 gsh 保护蛋白巯基免受氧化，防止蛋白的变性37,48。重金属胁迫下 gsh 参与植物螯合剂的形成49-50。在谷胱甘肽-s-转移酶（gst）催化作用下，gsh 可以 与外源有害物质如除草剂等结合，起到保护作用51。 3 1.2.2 谷胱甘肽和信号转导 许多试验证明植物中谷胱甘肽参与信号转导。 谷胱甘肽的含量和/或比率可参与 植物的信号转导52-56；谷胱甘肽库的氧化还原状态调控质体基因的表达57-59；谷胱 甘肽直接与蛋白中的 cys 残基结合，从而改变调控蛋白的活性52,60-65。有报道显示 拟南芥叶片中醛缩酶和丙糖磷酸异构酶发生谷胱甘肽化66。蛋白组学研究认为拟南 芥中胁迫可诱导蛋白的 s-glutathiolation 67。近年来有资料报道 ros 引起细胞质 ca 离子浓度的升高可能和谷胱甘肽有关68-71。 1.3 谷胱甘肽还原酶 1.3.1 谷胱甘肽还原酶的生物学意义 植物体内细胞的多种生理生化反应都可产生活性氧(reactive oxygenspecies， ros)。正常生长条件下，植物细胞中 ros 维持在较低的水平。然而，低温、高温、 盐胁迫、强光照、重金属、紫外光辐射、空气中的 o3和 so2、机械损伤等环境胁迫 可引起 ros 的大量增加，若不及时清除，会对植物细胞产生严重伤害。植物体内存 在清除 ros 的抗氧化系统，其中谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，gr）是谷 胱甘肽抗氧化系统的主要酶之一。它在 nadph 存在的情况下，催化氧化型谷胱甘 肽（gssg）还原为 gsh，以对抗氧化胁迫。防止氧化型谷胱甘肽、蛋白 ssg 和其 它二硫化合物的积累，对细胞膜、核酸、脂类、血红蛋白和酶的稳定是必需的72。 因此 gr 对 gsh 的再生以保持正常的 gsh/gssg 比例，维持植物细胞的氧化还原 平衡有重要意义，在植物抗氧化系统乃至整个生长发育过程中发挥重要作用73-76。 此外，谷胱甘肽还原酶对抗坏血酸的循环再生也是不可缺少的。 1.3.2 gr 的分布及其原因 gr 广泛存在于真核生物和原核生物中77-79。高等植物 gr 首先是在豌豆中发 现的，大量研究发现它有多种同功酶，还能形成四聚体的特殊结构77。小麦是最早 被证明胞内具有谷胱甘肽还原酶的生物之一80。 gr 既存在于植物和藻类的叶绿体，也存在于它们的胞液中。有资料表明，几 乎所有的活性氧清除酶都在非光合组织中存在，胞液中的 gr 提高也会增加对胁迫 的抵抗力，可见，gr 不仅仅是对光合组织起到保护作用，对整个细胞也都具有不 可缺少的作用86。 植物中的 gr 酶编码基因可能为一个基因家族77,81。红云杉中已经发表的 2 种 gr 酶基因在 n 末端存在较大差异，表明其来自两个不同的基因82。在烟草中也发 现两种 gr 酶编码基因83。而豌豆叶绿体和线粒体 gr 酶是同一基因的不同修饰产 物83-85。 4 1.3.3 植物中 gr 的功能研究 谷胱甘肽还原酶（gr）可参与抗坏血酸谷胱甘肽循环途径，清除活性氧，其 反应底物谷胱甘肽又具有非常重要的作用，因此 gr 酶是植物体重要的抗氧化酶 74,86。许多报道中证明 gr 酶在植物抗氧化中的重要作用，随着活性氧的产生，gr 酶活性将相应升高。可以明确的是，gr 与生物抗环境胁迫有关，诸如 -射线、热 胁迫、冷胁迫、高压氧胁迫、空气污染、重金属、强光、镁缺乏以及干早等因子87。 低温88-98、空气污染99、高光强下的缺锰100、重金属101-102等胁迫会引起 gr 酶活 性的升高。 胁迫条件下， 植物抗性品种比其敏感品种往往具有较高的 gr 酶活性103。 抗低温的玉米比敏感性品种具有更高的 gr 酶活性104。抗低温小麦、水稻具有较高 的 gr 酶活性105-106。 盐胁迫条件下， 抗盐番茄比盐敏感番茄具有较高的 gr 酶活性 107。但是这些生理测定资料中较高的 gr 酶活性不是唯一的因素，胁迫引起的 gr 酶活性升高往往伴随着其他抗氧化酶如抗坏血酸过氧化物酶(apx)、 超氧化物歧化酶 (sod)等酶活性的升高。同样，抗性品种在胁迫条件下具有较高的 gr 以外的其他 抗氧化酶的活性108。gr 活性的提高极可能与其基因的表达上调有关，因此只有从 分子生物学角度才可以有效地阐明 gr 的作用方式。 gr 的转基因研究可以改变 gr 酶的活性，因此能很好地研究其作用109。在植 物叶绿体中过量表达 gr 可以提高植物的抗逆能力。烟草叶绿体中过表达 gr 可以 增强植株对抗甲基紫(methylviologen, mv )和 so2引起的光氧化110-114。杨树的叶绿 体中过量表达 gr 提高转基因植株的抗 mv 和光抑制的能力115。 印度芥菜叶绿体中 过表达 gr 能缓解重金属镉在体内的积累116。 但是在植株的细胞质中过表达 gr 不 能提高植株的抗逆能力114,116-117。 目前，谷胱甘肽还原酶已从多枝赖草(leymus multicaulis ) 118、豌豆(pisum sativum )119、拟南芥(arabidopsis thaliana )120、大豆(glycine max )121、水稻(oryza sativa )122、芥菜(brassica juncea )123、烟草(nicotiana tabacum )124、蓝藻(anabaena pcc 7120)125 、白菜(brassica campestris ) 126、番茄（lycopersicon esculentum） 127 等生物中得到克隆和鉴定，但在南极冰藻中还未见报道。有文献表明，gr 在南极 衣藻适应极端环境中具有重要地位128，故非常有必要对其基因进行克隆分析。 1.4 研究目的及意义 南极地理和气候环境特殊，为了在南极生存，冰藻必需有特殊的机制来适应这 些极端环境。极地微藻有一套有效的抗胁迫体系保护自身的光合系统、生物膜系统 和酶系统，以保证微藻细胞生理活动正常进行。因此，研究极地微藻的抗冻、抗氧 化和抗辐射等特性具有十分重要的理论意义和实际应用价值。 5 南极冰藻 chlamydomonas sp. ice-l 作为单细胞真核生物， 既具有单细胞易于操 作的特点，又具有与高等植物相似的细胞结构，便于实验室研究，此特征使其成为 研究极端环境生物学的良好的模式生物。 许多研究工作也表明，谷胱甘肽还原酶在南极微藻适应各种胁迫时具有重要作 用。但这些研究仅从谷胱甘肽水平、相关酶活力大小及酶分子的特性等方面进行了 探讨，关于南极微生物谷胱甘肽还原酶基因的研究，尚未见相关报道，因此有必要 对此进行深入研究。 本实验的目的就是以南极冰藻 chlamydomonas sp. ice-l 为材料， 克隆并表达其 gr 酶基因，期望从分子水平进一步完善极地生物对极端环境的适应机制，加强对 南极生物谷胱甘肽相关酶基因的结构、功能、特性等的认识，丰富生物谷胱甘肽相 关酶及其基因的普遍性和多样性，以有效地保护南极基因资源，为该基因在抗逆遗 传育种中的进一步应用提供科学依据。 6 2 谷胱甘肽还原酶全长基因的克隆 随着分子生物学的飞速发展，基因工程技术已进入成熟阶段，利用 cdna 末端 快速扩增（rapid amplication of cdna ends，race）技术快速得到 cdna3和 5端从 而得到全长序列，为研究基因的结构功能奠定基础。与传统获得基因全长的方法相 比较，race 技术具有快速、高效克隆新基因的特点。本章在上述研究的基础上， 利用 race 技术获得南极衣藻谷胱甘肽还原酶基因的全长序列，并对其序列进行分 析研究。 2.1 实验材料 2.1.1 藻种来源 本实验所用南极衣藻（chlamydomonas sp. ice-l）属于绿藻门(chlorophyta)、 绿藻纲(chlorophycea)、团藻目(volvocale)、衣藻科(chlamydomonadaceae)、衣藻属 (chlamydomonas)，由国家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物质重点实验室惠 赠。 2.1.2 质粒载体和受体菌 质粒载体：pmd18-t (图 2-1), 购自 takara 公司。大肠杆菌 dh5 菌株由本实 验室保存。 图 2-1.pmd18-t vector 结构图谱 fig2-1.structure map of pmd18-t vector 2.1.3 工具酶及试剂盒 (1)trizol 试剂：美国 invitrogen 公司； (2)depc：上海生工生物工程技术服务有限公司； 7 (3)dntps、extaq 酶、rtaq 酶及 reverse transcriptase m-mlv(rnase h-)：takara 公司； (4)uniq-10 柱式 dna 胶回收试剂盒：上海生工； (5)qiaquicktm pcr purification kit：qiagen 公司。 2.1.4 主要溶液和试剂的配制 (1)lb 液体培养基： 成品lb培养基25克， 蒸馏水定容至1000ml， 分装， 高压灭菌， 4 保存。 (2)lb 固体培养基： 在lb 液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%， 高压灭菌， 4 保存。 (3)50tae（1000ml）：242gtris，57.1ml 冰乙酸，10ml 0.5m edta(ph8.0)，电泳 时稀释为1tae。 (4)0.1m 氯化钙： 1.47g cacl22h2o （或1.1g无水cacl2） 溶于水后定容至100ml， 0.22m 滤器过滤， 4保存。 (5)氨苄青霉素储存液：以无菌双蒸水配成浓度为100mg/ml 的溶液，分装， -20c 保 存。使用时每100ml 培养基加入100l，终浓度为100g/ml。 (6)iptg 储存液：将8g iptg 粉末（sigma 公司产品）溶于10ml 双蒸水中，过滤除 菌后分装，-20c 保存备用。 2.1.5 主要仪器 (1)3k30 台式高速低温离心机：德国 sigma 公司； (2)摇床：上海博迅实业有限公司医疗设备厂； (3)-80低温冰箱：丹麦 heto 公司； (4)gds-8000 凝胶图象分析仪：美国 gene 公司； (5)uv-2550 紫外分光光度计：日本 shimadzu 公司； (6)dyy-iii-8b 恒压恒流电泳仪：北京六一电泳仪厂； (7)shz-b 电热恒温水槽：上海博迅实业有限公司医疗设备厂； (8)elgapure 超纯水器：英国 elga 公司； (9)基因扩增仪： bio-rad 公司； (10)sim-f140 制冰机：日本 sanyo 公司； (11)cha-s 电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂； (12)超净工作台：上海汇龙仪表责任有限公司； (13)galanz-wp700 微波炉：顺德市格兰仕微波炉电器有限公司； (14)hzqf160 全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司； (15)phs3c 型精密 ph 计：上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂； 8 2.2 实验方法 2.2.1 藻的培养 2.2.1.1 培养基 chlamydomonas sp. ice-l 的培养液采用 provasoli 培养基: 以每升消毒海水加 10ml 营养母液，煮沸灭菌 5min，于冰箱冷却后待用。营养母液由储备液 n、p、ii、 iii 以 1.4:1.4:5:5 配成(provasoli,1968)。储备液成分见附录表 1。 2.2.1.2 培养条件 南极冰藻分别在三角瓶中培养，放在可控温光照的培养箱中，以 20%为接种量， 培养温度 6-8，光强为 1300-1900 lx，光暗周期为 12 h 光/12 h 暗，不充气，每天 摇动 4-5 次，每隔 14 天，藻体转移到新的培养基中来维持细胞的指数生长。 2.2.2 总 rna 的提取 采用 invitrogen 公司的 trizol 试剂提取总 rna，参照试剂盒说明书,稍有修改。 具体操作步骤如下： (1)取培养至对数生长期的藻液 1ml 于 1.5ml ep 管中，6000rpm 离心 3min 弃 上层培养液，收集藻体。 (2)加入 1ml trizol 至含藻体的 ep 管中， 移液器吹打数秒， 混匀， -80冷冻 4h， 取出后常温水浴使之迅速融化。 (3)加人 200l 氯仿， 剧烈振荡混匀 30s， 再缓慢加入 200l naac， 冰浴 10 min， 4、12000rpm 离心 15 min。 (4)小心吸取上清(注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体 dna 污 染)，加等体积酚/氯仿充分混匀，4、12000rpm 离心 10min。 (5)酚/氯仿重复抽提直至界面干净。 (6)吸取上清，加入等体积异丙醇混匀，- 20沉淀 1 h。4、12000rpm 离心 10 min。 (7)以 700ml 75乙醇洗涤沉淀，4、12000rpm 离心 5 min。 (8)可重复步骤(7)一次。尽可能吸走上清，防止 rna 丢失。 (9)以 20l depc 水溶解 rna 沉淀，取 5l 在 1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检 测，其余 -80保存备用。 2.2.3 ice-l gr 基因的 race 克隆 2.2.3.1 引物设计 根据报道的谷胱甘肽还原酶氨基酸序列进行比较分析,发现该酶在不同藻类及植 物中有两个高度保守序列：tpvalme和aeefvtm。以编码保守区的核苷酸序列设 计扩增的上游引物p1， 由于氨基酸对应密码子的简并性， 所设计引物为简并引物。 p1： 5-sac vcc vgt kgc gct kat gga-3作为3race上游引物；3oligo(dt) 锚定引 物5-aag cag tgg tat caa cgc aga gta ct(30)v n-3作为合成cdna一链的 9 引物；3pcr锚定引物：5-aag cag tgg tat caa cgc aga gt-3作为3race 的下游引物，引物由上海生物工程公司合成。 2.2.3.2 3race 克隆 3race克隆的原理主要依靠mrna中3端的poly（a）结构进行pcr克隆，其原 理示意图如下（图2-2）。 图 2-2：3race 原理示意图 fig 2-2：principle of 3race 2.2.3.2.1 cdna 一链的合成一链的合成 取一0.2ml无菌pcr管，置于冰上，依次加入： 总rna 10l oligo dt锚定引物 2l 70温浴10 min,迅速冰浴5 min,稍离心。 cdna合成缓冲液 4l dntp mixture(10 mmol/l) 1l rnase 抑制剂 1l 反转录酶 1l depc水 1l, 42温育 60min；70温育 10min 灭活反转录酶。-20保存待用。 2.2.3.2.2 3race-pcr 扩增扩增 以南极冰藻总 rna 的反转录产物为模板进行 pcr 扩增。 3cdna末端的pcr扩增步骤: 取一0.2ml无菌pcr管，置于冰上，依次加入： 10ex taq bufer 5l 10 dntp mixture (10 mmol/l) 1l cdna一链产物 1l p1(10mol/l) 2l 3pcr锚定引物 2l takara ex taq 0.5l 无菌水 38.5l 充分混匀，短暂离心后，立即进入以下循环： 94 5min 30 cycles 94 30s 52 45s 72 60s 1 cycle 72 10min 反应结束后，取5l pcr产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。 2.2.3.2.3 pcr 产物的纯化回收产物的纯化回收 pcr产物的切胶回收使用uniq-10柱式dna胶回收试剂盒进行， 具体操作按试剂 盒说明书进行： 通过1.0琼脂糖凝胶电泳将目的dna片段与其它dna片段尽可能分开，然后 用干净手术刀切下含需回收dna的琼脂块，放入1.5ml离心管中； 称量凝胶的重量，以1mg1l换算凝胶的体积； 按照凝胶的体积，加入4个胶体积的binding buffer ii； 置于55水浴中10min，使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次； 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的uniq-10柱中，室温放置2min， 8000 r/min室温离心1min； 取下uniq-10柱，倒掉收集管中的废液，并放回同一收集管中，加入500l wash solution，8000 r/min室温离心1min； 重复步骤； 取下uniq-10柱，倒掉收集管中的废液，并放回同一收集管中，12000r/min室 温离心2min； 将uniq-10柱放入一干净1.5ml离心管中，在柱子膜中央加40l elution buffer，放置5min； 12000 r/min室温离心1min， 离心管中的液体即为回收的dna片段， 保存于-20 备用。 11 2.2.3.3 5 race-pcr 扩增 2.2.3.3.1 特异性引物的设计特异性引物的设计 根据3race获得的ice-l gr基因的3端序列， 应用primer premier 5.0 软件设计3 条基