含菌量测定法.doc

计数器计数法纽鲍尔（neubauer）血球计数板计数操作方法如下：(1)取清洁的血球计数板，将清洁的专用盖玻片放在血球计数板上有刻度的位置。(2)将芽孢率达80%的发酵原液加入转子用磁力搅拌器振荡45min，从中取出10ml至装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，加转子在磁力搅拌器上振荡30min，再从中取出5ml至装有45ml无菌水的100ml三角瓶中，加转子在磁力搅拌器上振荡20min，再从中取出1ml至装有9ml无菌水的试管中，在漩涡振荡器上振荡2min。依次将培养的菌液用无菌水进行适当的稀释，以每小格有3-5个细菌为宜。(3)摇匀稀释的菌液，用无菌滴管吸取少量菌液，从盖片的边缘滴一小滴(不宜过多)，使菌液自行进入平台的计数室。加菌液时注意不得使计数室内有气泡，静置约5 min。在低倍镜下找到方格网后，转换高倍镜进行观察和计数；观察80个小格，以它的平均数乘以4000000，就是每毫升菌悬液中芽孢的数量。(4)计数(1625规格的计数板)细胞个数（个/ml）=80个小格内细菌数菌液稀释倍数4106/80任务微生物农药检测承担农业部或各省技术监督部门指定的微生物产品质量监督抽查检验，优质产品的评选和复查检验。受有关部门委托，对申请办理微生物农药登记的产品质量进行检验及对新产品、新品种、科研成果进行鉴定检验。承担各部门的委托检验和仲裁检验。进行微生物农药质量的研究，对外承担微生物农药产品的质检服务，承担和参与相关国家标准、行业标准及企业标准的制定及试验性工作。对微生物农药产品中杂质及在农作物上施用后产生药害的物质进行鉴定和检测。对地方和企业农药质量检验机构进行技术指导、技术服务和人员培训，解决有关微生物农药质量检验的问题。食(药)用菌检测承担农业部门或其他相关部门指定的行政执法和对食(药)用菌菌种、产品及制品，食(药)用菌培养料及辅料，食(药)用菌栽培环境的质量监督检验及优质荣誉食(药)用菌产品的评选、复查、跟踪检查。受农业部或其它部门委托，对实施证书管理(如生产许可证、质量认证、进出口登记、推广许可证、产品登记等)的食(药)用菌产品进行检验，对重要新产品、新品种投产和科技成果的鉴定进行检验。承担农业系统食(药)用菌产品质量考核检验和产品质量分级检验;承担有关食(药)用菌产品的质量仲裁和其他委托检验;负责对有关企业和地方同类检验机构进行技术指导、技术咨询、技术服务和人员培训。研究食(药)用菌领域新的检测技术和方法，承担或参与相关国家标准、行业标准及企业标准的制定和试验性工作。对外承担有关菌种(均一性、真实性、结实性等)、感官指标(形状、大小、虫蛀菇、杂质含量等)、理化指标(水分、灰分及各种营养成分、多糖、粗蛋白、微量元素等各种有效成分)、卫生指标(重金属残留、农药残留等各种有害成分)和微生物指标(细菌总数、霉菌总数、各种致病菌等)的质检服务。1.微生物农药农药在农、林业防治病害，除去杂草中起了巨大作用，特别是化学农药，但当前全世界化学农药年产量超过200万吨，有500多种在农业中使用，造成环境严重污染，生态遭到破坏，害虫抗药性大增，人畜常中毒伤亡。1992年世界环境与发展大会的决议中指出：要在全球范 围内控制化学农药的销售和使用，到2000年生物农药的产量将占农药总量的60%。微生物农药在生物农药中占有重要地位，也是各国竞相发展的产业，它是利用微生物本身或其代谢产物防治病、虫、杂草的制剂。已知的昆虫微生物病原体1000多种，细菌10多种，真菌750多种，其余为病毒、线虫、原生动物等，这些病原体都可作为防治害虫的资源开发利用。已商品化的微生物农药主要包括抗生素、细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、细菌与病毒混合杀虫剂和微生物除草剂等。(1)细菌杀虫剂苏云金芽孢杆菌杀虫剂，简称bt杀虫剂。它是当今使用最多和最广泛的生物杀虫菌，对鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目中的200多种昆虫都有毒杀作用，而且各亚种、各菌株所毒杀的昆虫对象不完全相同，有的对某种昆虫的杀灭的专一性强，毒力也高。它广泛地被用来防治农、林、果树、贮藏室和一些医学的害虫。bt杀虫剂之所以成为国际上目前产量最大，应用面最广，深受欢迎的农药，除其杀虫效果好外，更重要的是对人、畜无伤害，安全；对植物也不产生药害，不影响农作物、树木、瓜果、烟、茶等的色、香、味；也不伤害害虫的天敌和有益的生物，能保持使用环境的生态平衡；对土壤、水源、空气环境不造成污染，有利于社会经济的持续发展。苏云金芽孢杆菌的杀虫机理主要是靠其芽孢和毒素。苏云金芽孢杆菌在菌体的一端形成芽孢，另一端形成近菱形的蛋白质晶体，即伴孢晶体。不同的苏云金芽孢杆菌菌株的伴孢晶体所含的晶体蛋白种类和数量有很大差异，一般都含有1-5种杀虫晶体蛋白，其分子量 在27-140kd之间，这些晶体蛋白本身并不能杀虫，它只是毒素的前体。当昆虫吞食伴孢晶体后，在肠道中的碱性条件下，伴孢晶体被分解出毒素的前体，或称为原毒素(protoxin)，再在肠中特异性的碱性蛋白酶作用下，水解出有活性的不同分子量的毒性多肽，被称为苏云金芽孢杆菌的内毒素。内毒素特异性地结合在肠道的上皮细胞的糖蛋白受体上，在细胞膜上产生一个直径约为10-20埃的孔，或形成病灶，造成钠离子和钾离子的调节泵失去作用，钾的运输和atp的合成中断，细胞代谢停止，昆虫死亡(图15-14)。有的苏云金芽孢杆 菌还产生另一种称为-外毒素的毒素，也被称为苏云金素，它是一种非特异性的小分子腺嘌呤核苷酸衍生物，相对分子质量约为700。-外毒素比-内毒素热稳定性好，可忍耐121，15分钟，可以溶于水，作用机理和致病症状也不相同，-外毒素是rna聚合酶的竞争性抑制剂，干扰与昆虫发育有关的激素的合成，导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹。苏云金芽孢杆菌的芽孢被昆虫吞食后，在肠道中萌发成营养体，大量增殖，并穿透肠壁进入血液繁殖，使昆虫为败血症死亡(图15-14)。苏云金芽孢杆菌杀虫剂的生产，可以用深层液体(或固体)好氧发酵，相对于生产抗生素、氨 基酸、维生素等的发酵工艺要简易、粗放得多。后处理也较容易，液体发酵一般是用发酵液喷雾干燥，或将发酵液制成液体制剂，固体发酵更为简便，大都是发酵后，即进行干燥、粉碎、检验、产品。农村还可推广家庭室内地面固体发酵法生产bt杀虫剂，其要点是：将麦麸 70%，黄豆饼粉20%、谷壳9%、碳酸钙1%，加水，干料水=10.8-1.2，用熟石灰水调ph9 左右，培养基的含水量以手捏成团，触之能散为宜。培养基所用原料可因地制宜，还可以用米糠、棉籽饼粉、花生饼粉、玉米粉、蚕蛹粉、草炭粉、肥土等制备培养基。用蒸煮法灭菌培养基后，接种bt菌种，将其松散地摊放在垫有一层塑料薄膜的室内地面上，培养基厚1厘米左右，上面也罩以塑料薄膜，使发酵温度自动控制在25-32为宜，48小时左右，可获得含活芽孢数约100亿/克左右的bt杀虫剂，即可用于棉田、蔬菜、瓜果、森林等防治害虫。图15-14苏云金芽孢杆菌致死昆虫的主要机理模式图bt杀虫剂不足之处是：1.杀虫效果受环境影响大。如15以下不宜使用；阳光中的紫外线能 使伴胞晶体的杀虫蛋白失效，24小时破坏蛋白质中60%的色氨酸。2.各种bt菌株仅对其敏感的昆虫有效，杀虫谱窄，一株菌种生产的杀虫剂一般不能防治多种虫害。3.昆虫对bt杀虫剂逐渐产生可遗传性的抗性。4.必须经过吞食过程进入昆虫体内才能杀死昆虫，很难杀死钻入植物体内和根部的害虫，而且只能在昆虫发育的某一阶段才有好的使用效果。这些不足之处，可以用各种各样的方式补救，例如：在制剂时添加防紫外线破坏的保护剂，加入蔗糖提高昆虫嗜食性，添加几丁质酶加强昆虫肠壁破坏，加入k2co3、cacl3等阳离子加速伴孢晶体降解，增加杀虫剂的效力；生产菌种不断筛选和更换；与少量化学农药混合使用，增强对昆虫的敏感性。但最重要的是用现代生物学技术对苏云金芽孢杆菌进行基因改造，使重组bt菌株具有杀灭多种害虫的内毒素或-外毒素基因，或具有某些保护、增效物质产生的基因，并高效表达，生产出受环境影响小、杀虫谱广、防昆虫抗性的强效bt杀虫剂。 目前国内外这方面的研究很火热，而且也有了工程菌株生产的bt杀虫剂。将苏云金芽孢杆菌的毒素基因转入其它微生物或植物，这不仅仅是解决bt杀虫剂需要昆虫吞食等方面的不足的问题，而是农药和防治害虫战略方面的重大变革。将苏云金芽孢杆菌基因克隆到荧光假单胞菌的染色体dna上，这种菌在玉米根周围土壤中繁殖，杀死土壤中伤害作物根系的昆虫很有效。美国mycogen公司将这种重组的荧光假单胞菌发酵增殖，然后用加热或浸碘的方法灭活菌体，但这种革兰氏阴性菌灭活后其细胞膜和壁可形成微囊，将有活性的毒蛋白包裹在其中，提高了抗紫外线等环境对其损伤的能力，其有效杀虫时间比普通的重组菌杀虫剂延长了两周以上。mycogen公司现已获准上市销售杀蔬菜害虫、马铃薯甲虫和玉米螟的三种这类工程菌杀虫剂。转基因抗虫植物，至1998年4月止，各国批准大田释放的已达1046项，占批准的转基因作物的23.8%。我国也批准了十多项转基因抗虫植物进入大田释放。转基因植物中起抗虫作用的绝大多数都是苏云金芽孢杆菌的毒素基因，而且在作物中表达好，使作物抗虫效果较显著。 其它细菌杀虫剂还有金龟子芽孢杆菌(bacillus popilliae，即日本甲虫芽孢杆菌)杀虫剂，该菌是金龟子幼虫(蛴螬)的专性病原。蛴螬吞食金龟子芽孢杆菌后，在中肠内萌发，生成营养体，穿过肠壁进入体腔，迅速繁殖，破坏各种组织，并可感染其它蛴螬，使金电子幼虫大量死亡。该种杀虫剂能使50余种金龟子幼虫致病，而且药效能保持9年之久，是一种成功地用于防治金龟子虫害的长效微生物农药。金龟子芽孢杆菌只能在蛴螬体内形成大量孢子，在一般人工培养基上很少形成孢子，因而该杀虫剂的生产，目前仍主要是靠感染活蛴螬大量产生芽孢来进行。球形芽孢杆菌(b.sphaericus)某些菌株对蚊幼虫有毒杀作用，主要是由其伴胞晶体中的毒素蛋白使昆虫致死，毒素蛋白是由51和42kd两种蛋白组成，此毒素为二元毒素，只有这两种蛋白共同参与才具有杀蚊活性。球形芽孢杆菌杀蚊剂的生产工艺与苏云金芽孢杆菌杀虫剂的相似，已有批量产品，是一种灭蚊除病害，有益于健康的微生物卫生防疫制剂，很值得推广。(2)真菌杀虫剂典型的代表是白僵菌杀虫剂。白僵菌(beauveria bassiana)是一种广谱性寄生真菌，广泛地使昆虫致病，由该菌引起的病占昆虫真菌病约21%，能侵染鳞翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目、同翅目的众多昆虫及螨类。白僵菌接触虫体感染，适宜条件下其分生孢子萌发，分泌几丁质酶，溶解昆虫表皮，侵入体内增殖，并分泌毒素(白僵菌素)和草酸钙 结晶，破坏寄主的组织，使代谢机能紊乱，最后因虫体上生出白色的棉絮状菌丝和分生孢子梗及孢子堆，整个虫体水分被菌吸收变成白色僵尸，菌因此而得名。用白僵菌生产杀虫剂的原料、工艺都与苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产大同小异，也可用深层液体好氧培养或固体培养。该杀虫剂在防治松毛虫、玉米螟、大豆食心虫、高梁条螟、甘薯象鼻虫、马铃薯甲虫、果树红蜘蛛、枣粘虫、茶叶毒娥、稻叶蝉、稻飞虱等农林害虫，效果较显著。绿僵菌(metarrhizium anisopliae)制成的杀虫剂也是一种广谱真菌杀虫剂，它侵染昆虫的途径、致病机理和生产方式都与白僵菌杀虫剂相似，但要求的培养温度、湿度较严格。该菌剂防治斜纹夜娥、棉铃虫、地老虎、金龟子等害虫，效果较好。(3)病毒杀虫剂它是基于许多病毒能使害虫致病死亡，并且对人、畜和作物安全，杀虫作用具有流行性和可持续性而制作的。1973年，联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)推 荐昆虫杆状病毒用于大田防治害虫。国际上已试制20多种病毒杀虫剂，但大规模工业生产成为商品病毒杀虫剂的只有几种，如：美洲棉铃虫npv(核型多角体病毒)杀虫剂、舞毒蛾npv杀虫剂、黄杉毒蛾npv杀虫剂、松柏锯角叶蜂npv杀虫剂、赤松毛虫cpv(质型多角体病毒)杀虫剂等，可喜的是，我国有一定生产规模的而且应用效果较好的病毒杀虫剂有：中国棉铃虫npv杀虫剂、油桐尺蠖npv杀虫剂、斜纹夜蛾npv杀虫剂、松毛虫npv杀虫剂和菜粉蝶gv(颗粒体病毒)杀虫剂。在我国用这些杀虫剂防治害虫面积已达几百万亩，用于防治棉花、蔬菜、茶、果树和森林的害虫都取得了显著效果，使用后均能形成流行病扩散。病毒杀虫剂的生产工艺主要有：选留虫种、成虫交配产卵、幼虫饲养、病毒感染增殖、病死虫收集、制剂加工、产品检测和分装。病毒杀虫剂发展较缓慢的重要原因之一，就是病毒的增殖目前还是在活虫体中进行，昆虫的饲养、饲料的配制，工艺过程的自动化等较难控制和实现，人工合成饲料、组织细胞培养生产技术当前还是试验研究阶段。病毒杀虫剂另一些方面的不足，如：杀虫范围窄，一种杀虫剂仅针对一种或少数几种害虫；杀虫慢，需几天或十多天才见效；多受环境温度、阳光、气候的影响，毒力较低等。解决这些影响病毒杀虫剂发展的问题，方法也是多种多样的，但最重要的还是利用dna重组技术改造和构建用于杀虫剂的病毒。当前，各国都在竞相研究开发基因工程病毒杀虫剂，有的对病毒基因进行修饰或加工，以增强病毒的活性，提高其稳定性，有的引入外源毒蛋白基因，拓宽其杀虫谱，有的引入能扰乱昆虫正常生活周期的基因，提高其杀虫效力。而且已获得不少可喜成果，正在向生产新一代的具最佳杀虫效果的基因工程病毒杀虫剂逐步迈进。(4)其它微生物农药抗生素是人用的重要医药，也是农用的重要农药，如表15-12所列。它不仅能防治各种农、林的微生物疾病，也能防治虫害和除去杂草，如：5ppm以上放线菌酮能使水浮萍枯死，12.5ppm茴香霉素(anisomycin)能使稗草幼根40-60%受抑，且水田和旱地都可安全使用。利用杂草的病原体制成微生物除草剂也是大有可为的，我国鲁保一号是利用专性寄生于菟丝子的半知菌类黑盘孢目盘长孢属(gloeosporium)的真菌制成，在防治主要的农田杂草菟丝子的效果达到70%-95%。澳大利亚利用粉苞苣柄锈菌(puccinia choudrillina)防治灯心草粉苞苣，美国用盘长孢状刺盘孢(colletotrichum gloeosporioides)除去一种大田杂草。4.4 微生物农药 4.4.1 田间试验 4.4.1.1 田间试验申请表 4.4.1.2 产品化学及生物学特性摘要资料 4.4.1.2.1 有效成分生物学特性 有效成分的通用名称、国际通用名称，分类地位和品系、微生物在自然界的存在形式等。 4.4.1.2.2 原药 有效成分鉴定试验程序(如形态学、生物化学、血清学、分子遗传学)和含量，其他成分（如杂菌）及含量，主要物化和生化参数，其他产品技术要求。 4.4.1.2.3 制剂 剂型、有效成分含量、其他组成成分的具体名称及含量、主要物化和生化参数、质量控制项目及其指标、类别(按用途)、有效成分分析方法等。 4.4.1.3 毒理学资料摘要 4.4.1.3.1 原药 急性经口毒性、急性经皮毒性、急性吸入毒性、眼睛刺激性、致敏性、致病性试验。 4.4.1.3.2 制剂 急性经口毒性、急性经皮毒性、急性吸入毒性试验及中毒急救措施等。 4.4.1.4 药效资料 4.4.1.4.1 作用方式、作用谱、作用机理或作用机理预测分析; 4.4.1.4.2 室内活性测定试验报告； 4.4.1.4.3 混配目的说明和室内配方筛选报告（对混配制剂）; 4.4.1.4.4 试验作物、防治对象、施药方法及注意事项等。 4.4.1.5 其他资料 在其他国家或地区已有的田间药效、残留、环境影响试验和登记情况资料或综合查询报告等。 4.4.2 临时登记 4.4.2.1 原药临时登记 4.4.2.1.1 临时登记申请表 4.4.2.1.2 产品摘要资料 包括产品化学及生物学特性、毒理学、环境影响、境外登记情况等资料的简述。 4.4.2.1.3 产品化学及生物学特性资料 a 有效成分的识别：有效成分的通用名称、国际通用名称，分类地位和品系、微生物的自然存在形式等; b 原药的物化性质； c 产品质量控制项目及其指标 a 有效成分和含量； b 其他成分（如杂菌）及含量; c 产品其他控制项目及其指标。 d 与产品质量控制项目相对应的检测方法和方法确认 检测方法通常包括方法提要、原理、仪器、试剂、操作条件、溶液配制、测定步骤、结果分析、允许误差和相关图谱等。 检测方法的确认包括方法的精密度、图谱原件等，并给出检测方法最低检出浓度。 采用现行国家标准、行业标准，可以不提供精密度数据和最低检出浓度试验资料。 e 控制项目及其指标确定的说明 对控制项目及其指标的制定依据和合理性做出必要的解释。 f 批次产品全项分析报告(包括有效成分的鉴定报告，如形态学、生物化学或血清学)； g 产品质量检测与方法验证报告 提供法定质量检测机构出具的产品质量检测和方法验证报告。 质量检测报告项目应当包括4.4.2.1.3c中规定的所有项目。方法验证报告应当附相关的典型图谱原件，并对方法的可行性进行评价，加盖检测单位公章。 h 生产工艺 包括原材料的名称、代码、生产流程图（包括主产物、副产物）等。 i 包装、运输和贮存注意事项、安全警示、验收期等。 4.4.2.1.4 毒理学资料 a 有关确认有效成分不是人或其他哺乳动物的已知病原体的证明资料; b 基本毒理学资料 a 急性经口毒性试验； b 急性经皮毒性试验； c 急性吸入毒性试验； d 眼睛刺激性/感染性试验； e 致敏性试验、有关接触人员的致敏性病例情况调查资料和境内外相关致敏性病例报道； f 致病性 经口致病性； 吸入致病性； 注射致病性（细菌和病毒进行静脉注射试验；真菌或原生动物进行腹腔注射试验）; c 补充毒理学资料 如果发现微生物农药产生毒素、出现明显的感染症状或者持久存在等迹象，可以视情况补充试验资料，如亚慢性毒性、致突变性、生殖毒性、慢性毒性、致癌性、免疫缺陷、灵长类动物致病性等。 4.4.2.1.5 环境影响资料 提供以下环境试验报告。根据农药的特性或用途的不同，可以适当减免部分试验报告。试验表明该原药对上述环境生物为高毒或具有致病性的，还需对该种微生物在环境中的繁衍能力进行试验。 a 鸟类急性经口毒性试验； b 鱼类急性毒性试验； c 水蚤急性毒性试验； d 藻类急性毒性试验； e 蜜蜂急性经口毒性试验； f 蜜蜂急性接触毒性试验； g 家蚕急性毒性试验。 4.4.2.1.6 标签或者所附具的说明书 提供的产品标签样张，内容要求同3.2.1.6。 4.4.2.1.7 产品安全数据单（msds） 4.4.2.1.8 其他资料 a 在其他国家或地区已有的毒理学、环境影响试验和登记情况资料或综合查询报告等； b 在环境中释放变异情况及其风险性说明； c 其他。 4.4.2.2 制剂临时登记 4.4.2.2.1 临时登记申请表 4.4.2.2.2 产品摘要资料 包括产地、产品化学及生物学特性、毒理学、药效、环境影响、境外登记情况等资料的简述。 4.4.2.2.3 产品化学及生物学特性资料 a 有效成分生物学特征，内容包括：有效成分通用名称、国际通用名称，分类地位和品系、微生物在自然界的存在形式等。 b 原药基本信息:有效成分和含量，其他成分（如杂菌）及含量。 c 产品组成:加工制剂产品中所有组成成分的具体名称、含量及其在产品中的作用。对于限制性组分，如渗透剂、增效剂、安全剂等，还应当提供其化学名称、结构式、基本物化性质、来源、安全性、境内外使用情况等资料。 d 加工方法描述:主要生产设备和加工过程。 e 鉴别试验 产品中有效成分等的鉴别试验方法。 f 理化性质 提供制剂产品下列参数的测定方法和测定结果：外观(包括颜色、物态、气味等)、密度或堆密度、粘度、可燃性、腐蚀性、爆炸性、闪点以及与其他农药的相混性等。 g 产品质量控制项目及其指标 a 有效成分含量 已有国家标准、行业标准的产品，按相应标准规定有效成分含量。 尚未有国家标准、行业标准的产品，有效成分含量由标明含量和允许波动范围组成。标明含量是生产者在标签上标明的有效成分含量。允许波动范围是客户或第三方检测机构在产品有效期内按照登记的检测方法进行检测时，应当符合的含量范围。具体参照3.3.2.3.7a执行。 b 相关杂质含量:规定相关杂菌、杂质的最高含量。 c 其他限制性组分含量:根据实际情况进行规定(如紫外线保护剂、保水剂等)。 d 其他与剂型相关的控制项目:见附件1。附件1中未列出的剂型，可参照联合国粮农组织(fao)、世界卫生组织（who）制定的规格要求。创新剂型的控制项目及其指标可根据有效成分的特点、施用方法、安全性等多方面综合考虑来制定。 e 贮存稳定性及温度、贮存条件对产品生物活性的影响：根据产品特性进行低温稳定性（适用于液体制剂）、热贮稳定性（适用于固体、液体制剂）、冻融稳定性（适用于微胶囊制剂）和其他条件对产品质量的影响试验。 h 与控制项目及其指标相对应的检测方法和方法确认 检测方法通常包括方法提要、原理、仪器、试剂、操作条件、溶液配制、测定步骤、结果分析、允许误差和相关图谱等。 检测方法的确认包括方法的精密度、图谱原件等，并给出检测方法最低检出浓度。 采用现行国家标准、行业标准，可以不提供精密度数据和最低检出浓度试验资料。 i 控制项目及其指标确定的说明 对控制项目及其指标的制定依据和合理性做出必要的解释。 j 产品质量检测与测定方法验证报告 提供法定质量检测机构出具的产品质量检测和方法验证报告。 质量检测报告项目应当包括4.4.2.2.3g中规定的所有项目。方法验证报告应当附相关的典型图谱原件，并对方法的可行性进行评价，加盖检测单位公章。 k 包装、运输和贮存注意事项、安全警示、有效期。 4.4.2.2.4 毒理学资料 a 有关确认有效成分不是人或其他哺乳动物的已知病原体的证明资料。 b 基本毒理学资料 a 急性经口毒性试验； b 急性经皮毒性试验； c 急性吸入毒性试验； d 眼睛刺激性试验； e 皮肤刺激性试验； f 皮肤致敏性试验。 4.4.2.2.5药效资料 a 室内活性测定试验报告（田间试验阶段已提供的，可以提供复印件）； b 混配目的说明和室内配方筛选报告（对混配制剂，田间试验阶段已提供的，可以提供复印件）； c 药效报告 杀虫剂、杀菌剂提供在我国境内4个以上省级行政地区、2年以上的田间小区药效试验报告。 除草剂、植物生长调节剂提供在我国境内5个以上省级行政地区、2年以上的田间小区药效试验报告。 局部地区种植的作物(如亚麻、甜菜、油葵、人参、橡胶树、荔枝树、龙眼树、香蕉、芒果树等)或仅限于局部地区发生的病、虫、草害，可以提供3个以上省级行政地区、2年以上的田间小区药效试验报告。 对在环境条件相对稳定的场所使用的农药，如仓贮用、防腐用、保鲜用的农药等，可以提供在我国境内2个以上省级行政地区、2个试验周期以上的药效试验报告。 d 农药田间试验批准证书（复印件）； e 其他 a 作用方式、作用谱、作用机理或作用机理预测分析； b 抗性研究，包括对靶标生物敏感性测定、抗药性监测方法和抗药性风险评估等； c 对田间主要捕食性和寄生性天敌的影响； d 产品特点和使用注意事项等。 4.4.2.2.6 残留资料 根据农药特性和使用方法，按照评审委员会意见提供在我国进行的2年以上的残留试验报告。对应用于不同作物的农药产品，在不同自然条件或耕作制度的省级行政地区的残留试验数量和资料要求见3.3.2.6。 4.4.2.2.7 环境影响资料 提供以下环境试验报告。根据农药特性、剂型、使用范围和使用方式等特点，可以适当减免部分试验报告。 a 鸟类急性经口毒性试验； b 鱼类急性毒性试验； c 蜜蜂急性经口毒性试验； d 蜜蜂急性接触毒性试验； e 家蚕急性毒性试验。 4.4.2.2.8 标签或者所附具的说明书 提供产品标签样张，内容要求同3.3.2.8。 4.4.2.2.9 产品安全数据单（msds） 4.4.2.2.10 其他资料 a 在其他国家或地区已有的毒理学、药效、残留、环境影响试验和登记情况资料或综合查询报告等； b 其他。 4.4.3 正式登记 4.4.3.1 原药正式登记 4.4.3.1.1 正式登记申请表 4.4.3.1.2 产品摘要资料 包括产地、产品化学及生物学特性、毒理学、环境影响、境外登记情况等资料简述。 4.4.3.1.3 产品化学及生物学特性资料 同临时登记规定,见4.4.2.1.3。 4.4.3.1.4 毒理学资料 a 有关确认有效成分不是人或其他哺乳动物的已知病原体的证明资料。 b 基本毒理学资料 a 急性经口毒性试验； b 急性经皮毒性试验 c 急性吸入毒性试验； d 眼睛刺激性/感染性试验； e 致敏性试验、有关接触人员的致敏性病例情况调查资料和境内外相关致敏性病例报道； f 致病性 经口致病性； 吸入致病性； 注射致病性（细菌和病毒进行静脉注射试验；真菌或原生动物进行腹腔注射试验）。 g 细胞培养试验（病毒、类病毒、某些细菌和原生动物要求此项试验）。 c 补充毒理学资料 如果发现微生物农药产生毒素、出现明显的感染症状或者持久存在等迹象，应当补充试验资料，如亚慢性毒性、致突变性、生殖毒性、慢性毒性、致癌性、免疫缺陷、灵长类动物致病性等。 d 人群接触情况调查资料 4.4.3.1.5 环境影响资料 提供以下环境试验报告。根据农药的特性或用途不同，可以适当减免部分试验。试验表明该原药对上述环境生物为高毒或具有致病性的，还需对该种微生物在环境中的繁衍能力进行试验。 a 鸟类急性经口毒性试验； b 鱼类急性毒性试验； c 水蚤急性毒性试验； d 藻类急性毒性试验； e 蜜蜂急性经口毒性试验； f 蜜蜂急性接触毒性试验； g 家蚕急性毒性试验。 4.4.3.1.6 标签或者所附具的说明书