毕业设计（论文）-不同浓度6-BA、GA3对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化率的影响.doc

各专业完整优秀毕业论文设计图纸学号：20090410492009041049哈尔滨师范大学学士学位论文 题 目 不同浓度6-ba、ga3对农杆菌介导的大 豆子叶节遗传转化率的影响学 生 指导教师 年 级 2009级专 业 生物技术（生物制药）系 别 生物工程与技术系学 院 生命科学与技术学院哈 尔 滨 师 范 大 学学士学位论文开题报告 论文题目 不同浓度6-ba、ga3对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化率的影响学生姓名 指导教师 李新玲 副教授年 级 2009级专 业 生物技术（生物制药）2012年 8月说 明本表需在指导教师和有关领导审查批准的情况下，要求学生认真填写。说明课题的来源（自拟题目或指导教师承担的科研任务）、课题研究的目的和意义、课题在国内外研究现状和发展趋势。若课题因故变动时，应向指导教师提出申请，提交题目变动论证报告。课题来源：自拟题目课题研究的目的和意义：大豆是我国重要的油料作物之一，是人民生活中的植物蛋白和油份的重要来源，也是主要的工业原料。大豆是目前公认的较难进行遗传转化的植物，主要是因为大豆的再生率较低，高效大豆再生体系的建立是大豆遗传转化的基础。虽然我国已克隆了具有自主知识产权的抗除草剂基因，但大豆的遗传转化受很多因素的影响，遗传转化率不高，减缓了利用遗传转化方法进行大豆品种改良的速度。本实验利用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统，对共培养、丛生芽、芽伸长等组织培养条件和植物激素配比进行优化分析，旨在探索提高大豆遗传转化效率的可能性，为建立高效的大豆遗传转化体系提供理论依据，以获得能够抗除草剂的大豆植株品种。国内外同类课题研究现状及发展趋势：大豆转基因研究始于1984年，自1988年hinchee等用农杆菌侵染大豆子叶节获得转基因大豆植株以来，大豆的遗传转化研究受到广泛的重视，农杆菌介导法也成为大豆分子育种和基因功能研究的重要手段。1988年meurer等报道了农杆菌转化大豆子叶节的影响因素，发现用超声处理过的子叶节较对照容易转化。1999年zhang等以bar 基因作为筛选标记基因，农杆菌法转化大豆子叶节频率达3%。2003年olhoft等相继报道了在培养基中添加硫醇类化合物和l-半胱氨酸可以防止由农杆菌侵染导致的组织坏死现象，从而提高转化频率。2006年paz等以无菌水浸泡16h的子叶节为外植体进行转化，遗传转化效率达到了1.4%7.8%。2010年yamada 等通过用微型金属毛刷对子叶节外植体造成机械损伤以及在侵染液中加入0.02%的silwetl-77使遗传转化效率从1.0%提高到4.4%。目前，大豆再生所用的外植体主要有子叶节，无菌苗的茎尖，未成熟胚子叶，上胚轴和初生叶，子叶，成熟胚的胚尖等。大豆子叶节是遗传转化中应用最普遍的外植体，是大豆遗传转化应用最广泛的方法。2007年李文霞等以大豆品种黑农35的子叶节为材料，研究6-ba对子叶节再生三个阶段即无菌苗萌发、丛生芽诱导、丛生芽伸长的影响。2010年杜升伟等研究优化了包括种子消毒方法、生长调节剂用量和抗生素种类在内的影响农杆菌介导大豆子叶节遗传转化效率的多个因素。2011年孙明杰等研究了大豆子叶节高频愈伤组织诱导及其植株再生，以萌发以萌发7d的大豆子叶节切断及其切片为外植体，研究了萌发培养基、不同激素及其配比对大豆子叶节愈伤组织诱导与分化的影响。2011年武小霞等对大豆子叶节再生中植物生长调节剂浓度及基因型筛选进行了研究，以黑农35为实验材料，对大豆子叶节再生过程中种子的灭菌方法、萌发培养基中植物生长调节剂的浓度、丛生芽分化、生根培养与驯化等过程中植物生长调节剂的浓度进行了研究。课题研究的主要内容和方法，研究过程中的主要问题和解决办法：课题研究的主要内容：利用农杆菌侵染大豆子叶节，研究在共培养和芽诱导等阶段，6-ba、ga3激素水平的不同，对不定芽萌发率的影响，目的是提高大豆转化效率，优化大豆遗传转化体系，更好更高效的获得携带抗除草剂基因的大豆品系植株。课题研究的方法：农杆菌介导的大豆遗传转化法研究过程中的主要问题：对共培养、丛生芽、芽伸长、生根四个阶段组织培养条件和植物激素配比进行优化分析。拟解决的关键问题：旨在优化大豆的遗传转化体系，提高外源基因的转换效率，为提高大豆遗传转化提供理论依据。解决办法：查阅相关资料，阅读相关书籍和期刊，向老师请教及利用网络资源进行查询，并查找研究人员做过的有关实验，最后整理成文字，完成论文。课题研究起止时间和进度安排：2012年7月2012年8月：查阅相关资料，确定实验方案；研究不同激素水平对大豆遗传转化效率的影响。2012年9月2012年12月：观察大豆生长情况，整理统计实验数据，补充实验内容，完善实验结果。2013年1月2013年3月：整理实验数据，撰写论文。2013年4月2013年5月：修改论文并最终定稿。课题研究所需主要设备、仪器及药品：所需设备及仪器： 通风橱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机及pcr仪、酸度ph计等。药品：b5培养基、酒精及各类激素等。外出调研主要单位，访问学者姓名： 无指导教师审查意见：论文立题新颖，资料丰富，论证充分，有较强的实际应用价值，可以开题。指导教师 （签字） 2012年 8 月 教研室（研究室）评审意见：同意开题。_遗传学_教研室（研究室）主任 （签字） 2012年 8 月院（系）审查意见：_生命科学与技术学_院（系）主任 （签字） 2012年 8 月学 士 学 位 论 文 题 目 不同浓度6-ba、ga3对农杆菌介导的大 豆子叶节遗传转化率的影响学 生 翟赵静指导教师 李新玲 副教授年 级 2009级专 业 生物技术（生物制药）系 别 生物工程与技术系学 院 生命科学与技术学院哈尔滨师范大学2013年5月不同浓度6-ba、ga3对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化率的影响翟赵静摘 要：大豆是目前公认的较难进行遗传转化的植物，因为大豆的再生率较低，高效大豆再生体系的建立是大豆遗传转化的基础。利用农杆菌侵染大豆子叶节，研究在共培养和芽诱导阶段，培养时间、6-ba、ga3激素水平的不同，对不定芽萌发率的影响，目的是提高大豆转化效率，优化大豆遗传转化体系，更好更高效的获得携带抗除草剂基因的大豆品系植株。关键词：6-ba；ga3；农杆菌；大豆子叶节；遗传转化 大豆转基因研究始于1984年，自1988年hinchee等1用农杆菌侵染大豆子叶节获得转基因大豆植株以来，大豆的遗传转化研究受到广泛的重视，农杆菌介导法也成为大豆分子育种和基因功能研究的重要手段。1988年meurer等2报道了农杆菌转化大豆子叶节的影响因素，发现用超声处理过的子叶节较对照容易转化。1999年zhang等3以bar 基因作为筛选标记基因，农杆菌法转化大豆子叶节频率达3%。2003年olhoft等4相继报道了在培养基中添加硫醇类化合物和l-半胱氨酸可以防止由农杆菌侵染导致的组织坏死现象，从而提高转化频率。2006年paz等7以无菌水浸泡16h的子叶节为外植体进行转化，遗传转化效率达到了1.4%-7.8%。2010年yamada等5通过用微型金属毛刷对子叶节外植体造成机械损伤以及在侵染液中加入0.02%的silwetl-77使遗传转化效率从1.0%提高到4.4%。目前，大豆再生所用的外植体主要有子叶节、无菌苗的茎尖、未成熟胚子叶、上胚轴和初生叶、子叶、成熟胚的胚尖等。其中，大豆子叶节是遗传转化中应用最普遍的外植体，是大豆遗传转化应用最广泛的方法。2007年李文霞等 67以大豆品种黑农35的子叶节为材料，研究6-ba对子叶节再生三个阶段即无菌苗萌发、丛生芽诱导、丛生芽伸长的影响。2010年杜升伟等8研究优化了包括种子消毒方法、生长调节剂用量和抗生素种类在内的影响农杆菌介导大豆子叶节遗传转化效率的多个因素。2011年孙明杰等9研究了大豆子叶节高频愈伤组织诱导及其植株再生，以萌发7d的大豆子叶节切断及其切片为外植体，研究了萌发培养基、不同激素及其配比对大豆子叶节愈伤组织诱导与分化的影响。2011年武小霞等10研究人员对大豆子叶节再生中植物生长调节剂浓度及基因型筛选进行了研究，以黑农35为实验材料，对大豆子叶节再生过程中种子的灭菌方法、萌发培养基中植物生长调节剂的浓度、丛生芽分化、生根培养与驯化等过程中植物生长调节剂的浓度进行了研究。本文利用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统，对共培养、丛生芽、芽伸长等组织培养条件和植物激素配比进行优化分析，旨在探索提高大豆遗传转化效率的可能性，为建立高效的大豆遗传转化体系提供理论依据,以获得能够抗除草剂的大豆植株品种。1 材料与方法1.1 实验材料植物材料：黑农37、黑农44、黑农64、小粒豆 菌株：ep；rcp4等萌发基本培养基：b5培养基共培养培养基：b5培养基芽诱导培养基：b5培养基牙伸长培养基：b5培养基生根培养基：b5培养基1.2 实验方法农杆菌介导的大豆子叶节转化方法：挑选粒大、饱满、无病斑的成熟大豆种子（黑农37、黑农44、黑农64、小粒豆）；采用氯气灭菌消毒4-6h，100ml次氯酸钠与4ml浓盐酸反应，产生的氯气对大豆进行灭菌；取出已经灭好的大豆种子，在超净工作台内将种子吹至无明显的气味后，接种到发芽培养基上；种子萌发5-7天后，对幼苗进行进一步的处理，去掉种皮，保留叶及子叶下方的下胚轴，用解剖刀将两片子叶沿下胚轴方向平行切开，去除顶芽，分别在子叶节处横着划3-4刀，竖划3-4刀，以平分去除顶芽；用已制备好的农杆菌菌液浸染已去除顶芽的子叶节；将去除顶芽且经农杆菌充分侵染的子叶节转入共培养基中，研究在不同激素浓度梯度（6-ba、ga3），对丛生芽诱导率的影响；共培养3-5天后，转入芽诱导培养基中，研究不同共培养时间对丛生芽率的影响；在不同激素浓度下（6-ba）的芽诱导培养两周左右，研究不同激素及筛选剂水平下的丛生芽萌发率；通过生长状况与形态特征，切取长势良好的丛生芽，转入芽生长培养基中，以便丛生芽更好的生长，吸取新鲜充足的养分，研究不同激素(iaa,ga3)水平及筛选剂水平下，对丛生芽生长的影响；当目标丛生芽长到3-5cm之间时，将从基部切下，研究1mg/mliba中蘸1-2min后与直接转入培养基中对丛生芽生根率的影响；待根长至约2-3cm时，移栽到混合土中，散射光下覆膜保湿进行精心照料培养，25，约3-5天后转入正常光下培养；待植株生长健壮，向植株上涂抹除草剂，观察，可正常生长的，方可初步鉴定为所获目的植株。 2 结果与分析2.1 共培养阶段不同激素浓度配比情况实验共设置了4组不同的激素浓度梯度：第一组：1.7mg/l6-ba，100mg/lga3；第二组：2.0mg/l6-ba,150mg/lga3；第三组：不加6-ba，200mg/lga3；第四组：不加6-ba，250mg/lga3。以此来分析共培养阶段大豆子叶节丛生芽分化的情况。图1 1.7和2.0 mg/l 6-ba对丛生芽分化的影响图2 四种不同浓度的ga3对子叶节生长的影响结果表明，在共培养阶段，添加1.7或2.0 mg/l 6-ba均可有效促进丛生芽的分化，诱导的愈伤组织紧致，生命旺盛，但二者差异并不显著（图1）。而培养基中添加了250mg/lga3后，有效促进子叶节的伸长，提高丛生芽诱导率，丛生芽诱导率均在50%以上（图2）。2.2 丛生芽诱导阶段激素配比情况实验共设置了4组不同的激素浓度梯度：第一组：0.4mg/l 6-ba，20mg/l bia；第二组：0.8mg/l 6-ba，40mg/l bia；第三组：1.7mg/l 6-ba,不加bia；第四组：2.0mg/l 6-ba，不加bia。以此来分析不同激素浓度对丛生芽诱导率的影响。图3 四种不同浓度的6-ba对丛生芽诱导率的影响结果表明，在丛生芽诱导阶段，6-ba浓度在0.4-2.0mg/l范围内，随着6-ba浓度的升高，丛生芽诱导率也随之升高，最适生长浓度在1.7-2.0mg/l（图3，图4）。0.8mg/l 6-ba1.67mg/l 6-ba 2.0 mg/l 6-ba0.4mg/l 6-ba图4 芽诱导阶段培养基中激素配比图片abdc图5 芽诱导时期产生的愈伤组织及其褐化和玻璃化现象图5的a和b为芽诱导阶段产生的愈伤组织，此种状态为培养较为理想的愈伤组织，培养基浓度适宜，培养温度以及湿度合适，培养基水分适合丛生芽诱导阶段的生长。但在培养过程中也会出现褐化和玻璃化现象（图5的c和d）。产生褐化的原因有很多，可能是培养的外植体老化）、外植体伤口太大、消毒时间过长或是消毒液没有冲洗干净、培养温度过高、季节原因、培养时间过长等；产生玻璃化的实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化。不同作物种类或品种，玻璃化的发生频率各不相同。另外，丛生芽诱导阶段培养基中水分不可过大，否则将会抑制丛生芽的生长。2.3 芽伸长阶段激素配比情况通过配置不同浓度激素配比的培养基，对四种大豆进行培养，目的是研究不同激素配比对丛生芽牙伸长的影响，旨在选用芽伸长最适浓度的激素配比。培养基如下，第一组：不加iaa，250mg/l ga3，100mg/l bia；第二组：200mg/l iaa，100mg/l ga3，200mg/l bia。图6 芽伸长阶段ga3和iaa浓度配比对芽伸长的影响结果表明，在芽伸长阶段，在培养基中同时添加100mg/l ga3和200mg/liaa的芽伸长率比单一添加250mg/lga3略高（图6，图7）。iaa对芽伸长也有一定的促进作用，当同时添加适量浓度ga3和iaa时，两种激素相互作用促进芽的生长。而只添加ga3时，随浓度大，但激素种类单一，对芽伸长的影响不够明显。 图7 芽伸长情况时的图片2.4 生根阶段方法比较实验采取了2种不同的生根方法，第一种是直接向培养基中添加1.0mg/liba；第二种是用1.0mg/liba蘸取2min。以此来分析不同方法对生根的影响。结果表明，在生根阶段用1.0mg/liba 或用1.0mg/liba蘸取2min对生根影响不是非常明显，但一般采用前者，即向培养基中直接添加1.0mg/liba。因为此法相对操作简单，且激素浓度在培养基中分布均匀。 2.5 不同浓度筛选剂对大豆生长各阶段的影响如图8所示，大豆生长各阶段时加入不同浓度筛选剂对大豆的生长状态有很大影响，当筛选剂浓度过大时，大量子叶节过早发黄老化，不利于目的子叶节的收获。因此在实验过程中筛选剂的浓度应在不同生长阶段选择适宜浓度。 图8 筛选剂浓度对比3 讨论3.1共培养阶段6-ba、ga3浓度对丛生芽诱导率的影响在遗传转化再生体系中，共培养阶段培养基中添加激素种类和浓度时影响丛生芽分化和植株再生的重要因素。理论上来讲，6-ba和ga3浓度越高，丛生芽诱导率越高，每个外植体的丛生芽数目也越多，转化效率也就越高。而丛生芽越多，芽之间的抑制作用也就越强，导致丛生芽不易生长，也没用明显的主茎。本研究中经过农杆菌浸染，共培养的大豆，在2.0 mg/l 6-ba及250 mg/lga3时，丛生芽的生长状况最好。3.2丛生芽阶段各因素对丛生芽诱导率的影响在实验过程丛生芽阶段培养时，愈伤组织易出现褐化，一般采用较嫩幼新生的外植体且适当降低培养基的浓度，调节培养箱内的光照，或适当微调底培养基的ph。愈伤组织出现玻璃化现象时，一般会适当调节激素6-ba跟ga3的浓度配比，以抑制玻璃化想象的产生。3.3基因型对大豆子叶节丛生芽诱导率的影响选择一个合适的受体基因型，一方面应考虑到所选择的基因型的农艺性状，另一方面取决于该基因型组培时的再生能力，最后还要通过实验检测它被农杆菌侵染后的再生能力。关于基因型之间存在的这种差异的原因，有研究认为是由细胞生理状态不同造成的，如细胞壁结构，细胞内激素水平，细胞致伤后的生理反应等，但具体原因机理尚未说明，有待进一步研究。3.4筛选剂在实验中的使用本研究利用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统，对共培养、丛生芽、芽伸长等组织配养条件和植物激素配比进行优化分析，旨在探索提高大豆遗传转化效率的可能性，为建立高效的大豆遗传转化体系提供理论依据。为抑制由于筛选剂浓度过高导致的外植体过早发黄老化，在实验过程中一般添加100ul/l的bia筛选剂对目标品种进行筛选。参考文献: 1 olhoft p m，bernal l m，grist l b，et al a novel agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybeanglycinemax ( l.) merrillusing primary-node explants from seedlingsj.in vitro cellular developmental biology-plant,2007,43:536-549.2 franklin g，carpenter l，davis e， et al factors influencing regeneration of soybean from mature and immature cotyledonsj.plantgrowth regulation,2004,43: 73-79.3 tomlin e s，branch s r，chamberlain d，et al screening of soybean(glycine max l merrill) lines for somatic embryo induction and maturation capability from immature cotyledonsj.in vitro cellular developmental biology plant,2002,38: 543-548.4 olhoft p m，bernal l m，grist l b，et al a novel agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybeanglycine max( l ) merrill using primarynode explants from seedlingsj.in vitro cellular developmental biology plant,2007,43:536-549.5 paz m，martinez j c，kalvig a，et al improved cotyledonary nodemethod using an alternative explant derived from mature seed for efficient agrobacterium-mediated soybean transformationj.plant cell reports,2006,25: 206-213.6卜云萍,李明春,胡国武等. 大豆子叶节组培再生系统与农杆菌介导的基因转化系统的比较研究. 南开大学学报(自然科学版) ,2003, 36(1):103-108.7 李桂兰,乔亚科,杨少辉等. 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究. 作物学报, 2005, 31(2) : 170-176.8 林树柱,曹越平,卫志明等. 6-ba 诱导大豆子叶节和茎尖出芽的研究. 上海交通大学学报( 农业科学版) , 2005, 23( 2) : 138 142.9 王全伟, 张海玲, 白晶, 徐香玲.大豆科学, 2008,27(2): 36-40.10 刘北东,朱延明,李海明.大豆子叶节再生影响因素的研究.大豆科学, 2002, 21(2):88-92.11 周思军.大豆抗虫基因转移及其转化系统优化研究d.哈尔滨: 东北农业大学,2000.12 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the efficiency of soybean transformation, optimization of soybean genetic transformation system, and gain a better, more efficient of herbicide resistance genes to carry strain of soybean plants.key words: 6 ba; ga3, agrobacterium; soybean cotyledon section; genetic transformation论文评阅人意见论文（设计）题目不同浓度6-ba、ga3对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化率的影响作 者翟赵静评阅人王晓萍评阅人职称教授意 见大豆是我国重要的油料作物之一，是人民生活中的植物蛋白和油份的重要来源。但大豆是目前世界上公认的较难进行遗传转化的植物，其遗传转化受很多因素的影响。传转化率不高，减缓了利用遗传转化方法进行大豆品种改良的速度。本实验利用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统，对共培养、丛生芽、芽伸长等组织培养条件和植物激素配比进行优化分析，旨在探索提高大豆遗传转化效率的可能性，为建立高效的大豆遗传转化体系提供理论依据，以获得能够抗除草剂的大豆植株品种。该论文立题有意义、重点突出、条理清晰，论述具有一定的逻辑性和系统性，阐述的内容具有一定的深度和专业水平，显示出作者具有较强的专业基础知识、一定的独立撰写科研论文的能力以及实际分析和解决问题的能力。本文已达到了学校对学士学位毕业论文的基本要求，是一篇较好的本科毕业论文。评阅人签字评阅意见论文评阅人意见论文（设计）题目不同浓度6-ba、ga3对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化率的影响作 者翟赵静评阅人王全伟评阅人职称副教授意 见以大豆子叶节为外植体，利用农杆菌介导法获得转基因大豆已成为大豆分子育种和基因功能研究的重要手段。本研究在农杆菌介导的大豆遗传转化体系中，对共培养、丛生芽、芽伸长、生根四个阶段组织培养条件和植物激素配比进行了优化分析。对优化大豆的遗传转化体系，提高外源基因的转换效率，提高大豆遗传转化提供了理论