硕士学位论文-氨基酸的反胶束水合萃取研究.pdf

鬃 渐 扛 工 澎 六 李 硕士学位论文 论文题 目氦基酸笠区脸束丛宣茎皿亚究 作者姓名 指导教师 裘 俊 红 教投 学科专业 所在学院 提交 日期 二七年五月 浙江工业大学硕士学位论文 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人 郑重声明所提交的学位论文是本人在导师的指导下,独立进行研究工 作所取得的研究成果 。除文中己经加以标注引用的内容外,本论文不包含其他个 人或集体 己经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料 。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均 已在文中以明确方式标明。 本人承担本声明的法律责任 。 作 者 签 一 枷衣 日 期 呼 小 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅 。 本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 。 本学位论文属于 、保密口,在年解密后适用本授权书 。 、 不 保 密 女 请在以上相应方框内打 “了 ” 作 者 签 名枷礴, 导 师 签 “ 舰 日 期 夕 落介少日 眺 了年石 月乙 日 浙江工业大学硕士学位论文 氨基酸的反胶束水合萃取研究 摘要 反胶束体系是一种类生命环境介质,反胶束萃取技术是一种新型的、 有发展前途的生物物质分离技术,广泛应用于生物物质活性控制及提取方 面的研 究 。 水合物生成对反胶束体系内生物质活性控制及提取具有重要意 义,国外水合物界在这方面一直做着探索性的研究 。 国内还未有相关研究 成果公开发表 。 基于以上考虑,本文通过研究反胶束体系中水合物的生成 特性以及水合物生成对包含在异辛烷反胶束体系中氨基酸的提取效 果,探讨了水合物形成对反胶束体系含水量的调节机理和氨基酸的提取机 理,为开展水合物法生物质活性控制及反胶束水合萃取研究提供了理论依 据 。 通过电导率法对反胶束体系含水量及稳定性测试,探讨了各因素对含 水量的影响,并结合合理假设及理论推导建立 了反胶束体系临界含水量与 盐度相关联的数学模型 。 这对研究反胶束体系的性质及反胶束生物物质活 性控制与提取具有指导意义 。 纯水体系和反胶束体系中乙烯水合物对比实 验表明 两种体系中水合物生成动力学特性差异较大,反胶束体系中水合 物生成的溶解 、 成核和生长三个过程持续时间短,温度和压力变化曲线有 一近乎九十度的转折 。 氨基酸的反胶束水合萃取实验表明 水合物的生成对体系含水量具有 调节作用,且初始压力和温度对含水量调节起决定性作用,属于显著性因 浙江工业大学硕士学位论文 素 。 调 节机理可表述为最初成核发生在反胶束 “ 水池 ” 内,成核消耗 了 反胶束 内的部分自由水反胶束在碰撞过程中总是不断打开和重组,且水 合物晶 核或晶体密度大于异辛烷,于是反胶束的不断打开和重组及时释放 了反胶 束内形成的水合物晶核和晶体,即以水合物晶核和晶体的形式最终 转移了反胶束的部分 自由水随着水合物晶核和晶体沉降过程的不断进 行,反胶束含水量也不断降低,即反胶束含水量通过水合物生成得到了调 整 。 氨基酸能通过静电或疏水作用增溶在反胶束体系的“ 水池 ” 内,并可 以伴随水合物的生成从反胶束体系中析出,且提取效果明显 。 这一过程属 于界面控制,水相盐度 、酸度和压力对提取效果影响较大 。 关键词反胶束,水合物,氨基酸,异辛烷 浙江工业大学硕士学位论文 , 一, 一 一 , , , , 一 浙江工业大学硕士学位论文 , , , , 一 一, , “, , , , , 浙江工业大学硕士学位论文 目录 要摘 前 七, 言, 第一章 文献综述, , 弓言 , 水合物理论研究 热力学研究 , 动力学研究 水合物应用研究 , 潜在能源 ,近临界和超临界萃取 生物酶活性控制及提取, 海水脱盐淡化 气体混合物分离 二, 反胶束技术及应用, 反胶束的形成和特性, , , 反胶束技术应用 , 氨基酸分析检测方法 甲醛滴定法 。二, 荀三酮 比色法 水分分析方法 卡尔 费休法 气相色谱法 , 第二章 反胶束体系含水量及稳定性测试 , , 弓言 , 反胶束体系选择 试剂与仪器, , 试剂, 仪器, 实验部分 , , 反胶束的制备与电导率的测定 各因素对反胶束体系的影响 结果与讨论, 反胶束体系含水量与电导率的关系 表面活性剂浓度对增溶水量的影响 , 盐度对反胶束体系的影响, 酸度对反胶束体系的影响, ,二, 反胶束临界含水量数学模型, 本章小结 , 第三章 反胶束体系中乙烯水合物提取实验 浙江工业大学硕 学位论文 引言 实验参数选择, 试剂与仪器, 试剂 , , 仪器, 实验部分 , , 乙烯水合物动力学实验, 反胶束体系水合物提取实验 , , 样品含水量和氨基酸含量分析, 含水量分析 , , 氨基酸含量分析, ,二, 结果与讨论 纯水和反胶束体系乙烯水合物动力学对比试验 氨基酸的水合物反胶束提取实验, , 本章小节 , , , 第四章 结论与建议 , 结论, 存在的问题与建议 , , 参考文献, , 致谢, , 攻读硕 士期间发表的学术论文 , 浙江工业大学硕士学位论文 月青 笼 形水合物,简称水合物,是指由一些低分子量的气体和某些挥发性液体,如 一 轻 烃,、环氧乙烷 、四氢吠喃和卤代烷烃等在接近冰点温度 和压力 的条件下与水或冰形成的一种非化学计量型笼形结构晶体 。 这些形成水合 物的气 体和液体统称为水合物形成物 。 水合物是一种较为特殊的包络化合物,由主客 体两种 分子组成 。 在气体水合物中,水分子主体分子通过氢键作用形成具有一定 尺寸大 小空穴的晶格主体,较小的气体分子则被包容在空穴中,从而形成外观类似冰 霜的固体 。其中气体分子和水分子之间的作用力为叭力 。 自世纪初发现水合物至今已有近年的历史,但对水合物的研究长期以来一 直未引起人们的重视 。 只是在近二 、 三十年中,由于蕴藏在大陆冻土带和海底沉积层 中储量 惊人的天然气水合物被相继探明以及显示出重要工业应用前景的水合物技术 不断涌现,水合物的巨大潜在价值得到了充分体现,人们对水合物的认识才上升到新 的高度 。 水合物研究也从长期仅被少数学者关注跨越到受许多人的高度重视 。 许多发 达国家 已经把天然气水合物作为传统能源的重要替代品,把基于水合物生成和分解的 水合物技术作为高新技术的重要发展方向,纷纷制定了相应的发展战略和大型的国家 研究开发计划 。 我国政府也把水合物正式列为国家研究开发计划 。 国家 自然科学基金 重大研究计划“ 西部能源利用及其环境保护的若干关键问题 ” 中把 “ 天然气水合物的 形成机理与释放机制 ” 作为西部能源工程的重要科学问题之一 。 水合物技术在近临界和超临界 、 混合物分离 、 海水淡化 、 放射性气体的地下贮存 、 生物酶活性控制及提取回收和高级材料特别是微束半导体胶质的制备等领域也具有 广阔的应用前景 。目前在己发现一百多种能形成水合物的物质中,已得到验证可在反 胶束溶液中生成水合物的物质包括甲烷 、丙烷 、乙烯 、氟利昂等 。 随着社会对环保要求的 日益提高,生物工程技术的快速发展 以及对新能源的开发需 求,水合物技术在生物工程上应用己引起越来越多的科学家和工业界人士的关心 。 另一方面,反胶束技术作为一种新型的生物分离技术,可用于非极性体系中极性 物质的分离,也可用于酶的固定化 。 近年来,国内外对反胶束的研究主要集中在研究 其物理化学性质 、 反胶束形成热力学以及在酶 、 蛋白质等生物物质的分离过程中的应 用 。 其中蛋白酶反萃取方法的改进以及反胶束萃取的工业化模拟也成为近年来的研究 浙江工业大学硕士学位论文 热点。大多数酶对所处环境很敏感,在较高温度 、或情况下不稳定 、易变 性失活 】。 尤其是对那些大分子蛋白酶,采用常规调节值和离子强度的反萃取方法 不仅易 造成变性,而且反萃取率也很低,难以达到安全 、经济 、高效分离的要求,所 以必须 寻求新的分离途径 。同时,非水环境中,即反胶束体系中酶的催化性能应用, 使得反 胶束中酶的活性控制研究也受到关注 。 由于水合物分离技术对低温溶液特别有 效,且 水合物形成消耗水减小反胶束尺寸可改变反胶束中酶的活性,也可以促进反萃 取过程 进行,将它应用于反胶束溶液内生物酶活性控制及提取是很自然的,国外水合 物界一直在这方面做着一些探索性的研究 。 国内还未有相关研究成果公开发表 。 基于 这几点考虑,本论文通过水合物反胶束体系提取氨基酸的实验研究,希望能为以后开 展水合 物法生物物质活性控制及提取研究提供一些理论依据 。 为 了做好水合物法生物物质活性控制及提取研究的前期工作,须保证实验条件适 合生物 活性物质生存,所选择的水合物形成物能在此条件范围内生成水合物 。 本论文 选择乙烯作为实验中的水合物形成物 。因为在同等实验条件下乙烯较甲烷 、乙烷等易 形成水合物,且在它的常规区 、 近临界区和超临界区都可以生成水合物,水合物生成 的温度和压力条件又较温和,适合大多生物活性物质生存 。 本实验室已对纯水体系中乙烯水合物生成动力学进行 了系统的研究,包括常规条 件 、 近临界条件和超临界条件下的乙烯水合物生成动力学生成特性冈。本论文主要研 究浓度,水相酸度及盐度对反胶束含水量的影响反胶束体系中水合物生成动 力学,水合物的形成对反胶束体系含水量的调节机理以及对氨基酸的提取效果 。 浙江工业大学硕士学位论文 第一章 文献综述 引言 水 合物的生成可看成是一个伴有气一液非均相反应的结晶过程,水合物形成气和 水反应 生成水合物晶体并从液相中析出 、”, 式中。,为水合数,即水合物结构中水分子和气体分子之比。其具体过程由气体溶解 、 成核 、生长等步骤组成,微观机理复杂,实验测试非常困难 。因此,开展水合物生成 动力学 的研究存在着相当大的难度,尤其是反胶束体系中的水合物生成动力学还很不 成熟 。 在 自然界中,水合物大多存在于大陆冻土带和海底沉积层中,形成水合物的气体 组成以甲烷为主,与天然气相似,故常称为天然气水合物,俗名可燃冰,可以作为传 统能源 的替代品。 水合物理论研究的不断进步推动水合物应用技术的快速发展,应用 技术的开发又进一步为工程实践奠定基础 。 目前,国外水合物技术在生物工程应用研究主要涉及反胶束体系中水合物生成热 力学 、酶活性控制冈和酶提取回收盯 三个方面 。国内尚没有此方面的相关报道 。 本文 的文献综述部分主要介绍水合物热力学和动力学理论 、 水合物应用技术和反胶束体系 特性及应用方面一些研究情况,还归纳并评价了几种常用氨基酸分析方法和水分分析 方法 。 水合物理论研究 水合物的理论研究可分为生成 、 分解及抑制研究,也可从动力学和热力学的角度 来阐述 。 下面主要从热力学和动力学的角度对水合物生成的实验和理论研究成果进行 了系统评述 。 热力学研究 水合物晶体的形成过程常被看作一个化学反应,也类似于结晶过程 。 液相中水合 物的形成使体系的无序程度下降 、 墒降低,系统的温度会升高 。 作为水合物研究的基 本手段,相平衡测定为水合物的应用提供基本物性数据,到 目前,己有大量文献报道 浙江工业大学硕士学位论文 了水合 物热力学相态的实验数据 。也有一些模型和方法可用于预测水合物 的生成条 件,其 中最早也是最经典的当推年和提出的统计热力 学模型 。该模型基于球形空穴假设和 加气体吸附理论 。等基于此模型 提出了 一种预测水合物生成条件的方法 。 随后,和运用 幻势能 对此模 型进行了修正,将其拓展为能够预测多组分气体混合物体系的水合物生成条 件 。后 来,和以及等分别对一方法作了不同 程度的改进 。 国内陈光进和郭天民 川也提出了一个考虑水合物实际生成情形的热力学 模型 。事实上,水合物热力学相态的研究已达到了相当成熟的程度,并取得了令人满 意的成 果 。 动力学研究 一个完整的水合物生成过程通常包含气体溶解 、 成核晶核的形成和生长晶 核生长成晶体三个阶段 。 晶核的形成是指在被水合物形成气过饱和的溶液中形成一 种具有 临界尺寸的稳定晶核 。由于从物系中产生一个新相晶核比较困难,因此该 阶段大多比较缓慢,一般都需要一个持续较长时间的诱导期,因此这一步亦是水合物 形成的控制步骤 。晶核形成时体系的自由能达到最大 。晶核一旦形成,体系将 自发地 向自由能减小的方向发展,从而步入生长阶段 。 在这一阶段中,晶核将 比较快速地生长成宏观规模的水合物晶体 。 虽然水合物的生成并没有经历旧化学键断裂和新化学键形成的过程,但考虑到生 成物即水合物是一种非化学计量的化合物,开展水合物生成动力学研究因而可 以遵循 化学动力学的研究思路,研究重点是水合物生成机理,这对建立其动力学模型具有指 导意义 。 和,在上世纪年代初首次提出了一个比较简单的水合物 生成机理 。 通过把气体水合物形成过程分成初始成簇过程 、晶核形成过程和水合物生 长过程,建立了一个由水单体浓度 、晶核浓度 、 气体浓度和气液界面面积所决定的半 经验速率方程 。 和曾提出一个描述水合物从冰中成晶的机理,主要用于解释某些 简单水合物诱导期的形成 。 在一机理的基础上,和提 出了一个新的水合物生 成机理当气体分子溶于水时,水分子将围绕气体分子定向排列形成不稳定簇 。不稳 浙江工业大学硕士学位论文 定簇听 具有的亚临界尺寸决定了它们必然通过面的共享聚集成亚稳团聚体 。 由于亚稳 团聚体 的尺寸仍未超过某一临界尺寸,所以某些团聚体仍可能变为不稳定簇,另一些 团聚体 则继续聚集成稳定的晶核 。 比和彬针对从水相中生成甲烷水合物晶体的过程提出一个由 个准基 元反应 组成的生成机理溶解 、 形成晶核 、晶核在非催化条件下缓慢生成水合物晶体 以及在 水合物晶体 自催化作用下由晶核或直接由水跟溶解气反应生成水合物晶体 。 以上这些机理普遍存在两点不足之处第一,他们在从微观的角度来探讨水合物 生成机 理时,忽视了水的微观结构以及水分子团簇在水合物生成过程中的作用, 对水合物的生成环境这一较为复杂却又决定着水合物生成机理的关键问题缺乏考虑 第二,他们假设的中间物具有较大的随意性,对中间物稳定存在的可能性缺乏从结构 和能量 两方面的考虑 。 本文作者导师 对水合物生成动力学开展了系统的研究工作,曾提出包含下列四 个步骤 的纯水体系中甲烷水合物的生成机理 气相中部分甲烷分子溶解于液相,水分子围绕溶解的甲烷分子定向排列形成 不稳定分子簇 不稳定分子簇相互间通过顶点与顶点的连接形成单晶 单晶相互连接形成晶核 晶核生长成水合物晶体 在 以上研究的基础上,胡春等 又将甲烷水合物生成过程发展成包括个拟化学 反应步聚的机理模型 。这两个模型能够很好的解释纯水体系中甲烷的生成动力学 。 正是因为水合物生成是一类宏观上涉及气液固三相 、 微观上涉及主客体分子相互 作用的复杂结晶过程,而且需要在较高压力和较低温度的条件下进行,从而给水合物 生成动力学的理论和实验研究带来 了许多困难 。 这就是水合物生成动力学远未成熟的 主要原因,它仍然是水合物研究的热点 。 水合物应用研究 随着水合物研究的日益深入,水合物应用领域不断拓展,新的水合物技术相继形 成 。主要有以下几大领域水合物作为潜在的未来能源水合物储存和运 输天然气水合物分离技术水合物技术应用于生物工程 。 其中水合物分 浙江工业大学硕士学位论文 离技术 又细分为近临界和超临界萃取 、 海水脱盐淡化 、 气体混合物分离 、 有机水溶液 提浓等几个方面。 自年,等 吸现在反胶束溶液中能形成气体水合物以 来,国外学者发表了一系列有关水合物技术应用于生物工程的研究报道在反胶束溶 液中水 合物形成热力学特性及对反胶束特性影响的基础上,提出水合物法生物酶活性 控制及 提取的可行性,并进一步通过实验得到了论证 。 此外,水合物储运天然气 、放 射性气 体 、有毒气体的技术也在积极探索中。水合物在高级材料制备、汽车驱动 、 冷机蓄冷等方面也有应用 。 为减轻温室效应,日本学者,翔建议将大气中的二氧化碳 以固体水合物的形式储存到深海中,以减缓温室效应 。下面择要介绍 。 潜在能源 众所周知,煤 、 石油 、 天然气等传统能源正在走向枯竭 。 人类的巨光己专注于搜 寻和开发替代能源 。 蕴藏在大陆冻土带和深海沉积层中的天然气水合物就是一种重要 的潜在能源 。这种能源的储量虽然 目前仍无法正确测算,但一致的看法是储量巨大 。 据国外专家保守估计,天然气水合物中甲烷资源量约为,是 目前己探明的 矿物燃料总量的两倍 。 我国的东海 、台湾以东海区及青藏高原的冻土层,都具备天然 气水合物的形成条件,并且已有相关资料报道部分海域确实有天然气水合物存在 。 目前,水合物作为一种替代能源,应用前景非常广阔,但大规模的工业开发进展 缓慢,主要原因是开发这种资源的技术难度很大,缺乏行之有效的方法 。 近临界和超临界萃取 等脚 用一种化合物 同时作为水合物形成物和萃取剂回收溶液中的有用物 质如图 一,实验研究了水合物生成对超临界和近临界流体萃取效率的影响 。研 究发现,水合物的生成显著改善了萃取过程的有效分配系数和选择性,使有效分配系 数增大 倍以上,并且随压力升高有效分配系数还将增大 。实验中使用的水合物形成 物包括超临界乙烯和近临界。 美国专利侧 介绍了利用生成水合物提取稀水溶液中溶质的方法,其中 的三种典型分离过程为在、条件下利用乙烯水合物处理质量分数为 的丁醇溶液在、条件下利用水合物处理质量分数为的丙烯 酸溶液在、常压下利用水合物处理岁 的丁醇溶液 。 浙江工业大学硕士学位论文 液液相中水水水水合物物 气气相相 萃萃取相相 液液相溶质质 萃萃余相相 图 一 近临界和超临界水合萃取过程 近 临界和超临界水合萃取作为一种水溶液分离技术,不仅避免了水合物晶体和溶 液完全分离的困难,而且大大增加了萃取过程的有效分配系数和选择性 。 但要使其实 现工业化,现有的基础理论研究成果还远不足以支撑 。 必须强化基础理论特别是超临 界状态下的水合物生成机理以及伴有水合物生成的超临界萃取机制的研究 。 本文作者 导师正在从事此方面的研究 。 生物酶活性控制及提取 水合物技术在生物工程应用研究主要是针对包含生物酶反胶束溶液而进行,主要 涉及反胶束体系中水合物生成热力学 、酶活性控制和酶提取回收 。 年,等】发现在反胶束溶液中能形成甲烷水合物,为生物酶活性控 制及提取开辟了一条新途径 。 年,等通过实验又进一步验证了在反胶束溶液中利用 甲烷水合物生成 控制酶活性的可行性 。 特别是对那些在微水环境中起催化作用的酶,可通过水合物生 成来控制反胶束含水量琳 即水与表面活性剂分子比,从而控制酶活性处于最佳状态 。 等 曾利用水合物的生成从生化溶液中回收蛋白质 。等也发 现某些气体水合物的生成有助于回收反胶束内酶 。基本原理如图一 所示 。 利用水合物法提取蛋白酶时,主要是使反胶束溶液与某种气体接触,气体进入反 胶束内并与反胶束内的水生成水合物,在反胶束体系下水合物生成转移了部分反胶束 所包覆的水,使反胶束体系的含水量降低,表现为反胶束尺寸减小反胶束体系的含 水量降低,一定程度上直接导致生物酶部分沉淀,从反胶束溶液中提取到生物酶同 时由于生成的水合物密度比有机相密度大下沉到釜底,不会夹杂在有机相中造成与反 浙江工业大学硕士学位论文 胶束体 系难分离现象 。 最后经过加压过滤不仅得到提浓蛋白酶而且反胶束滤液也可反 复循环 使用 。 一一一一一一一一一一一一一一一 互 一 井一一 声声户户户水 合 物 形 成 气气气一 介 万万今今今今 告告告告告告告告告告告 , , ,蒸 云 井井 扣扣扣扣扣 今今奋奋 置于环境中水合物被分解, 蛋白酶 以高浓度形式回收 图 一 水合物法回收蛋白酶原理过程的示意图 反胶束内酶的回收率不仅与水合物形成气的种类有关,而且与酶的类型及反胶束 含水量密切相关 。大多数酶对环境很敏感,在较高温度 、或情况下不稳 定易变性失效。而水合物的生成条件温和,能耗低,分离效率高,对环境无害,这 使得生物酶水合物法提取在某些方面具有一定的优势 。 在发酵过程和制药过程中都可 以利用生成水合物的方式进行分离工作 。 水合物法生物物质活性控制及提取的理论基础是反胶束体系下水合物生成的热 力学和动力学理论 、 伴随水合物生成反胶束内生物物质活性控制及萃取机理 。由于这 几方面的理论仍不成熟,使得水合物法生物物质提取技术的理论基础十分薄弱 。 需要 进一步开展研究工作来填补这一领域的某些空白,丰富己有的理论,为水合物法生物 物质活性控制及提取技术的开发提供坚实的理论依据 。本文宗旨亦在于此 。 海水脱盐淡化 水合物法海水淡化技术,是研究最早 、 授予专利最多的水合物应用技术 。 它利 用较易生成水合物的气体与海水中的水生成固体水合物,固液分离后,分解水合物即 可得到淡水 。该技术的最大优点是能耗低 、设备简单 、紧凑,但在设计淡化装置时对 水合物形成物有一定的要求最好能形成高水气比水合物且相变热低在 较低的压力和较高的温度下形成水合物,形成水合物的速度较快在水或盐水 中溶解度低无毒,价廉易得,无爆炸危险 。从海水浓缩液中分离水合物晶体 的难度较大,同时还会夹带一些浓缩液,而这些浓缩液的脱除也比较困难 。 就 目前科 浙江工业大学硕士学位论文 技水平 而言,该项技术还难以实现大规模的工业应用 。 水合物法海水淡化技术只在一 些缺水 的国家和地区如沙特阿拉伯实现了工业化 。 气体混合物分离 利 用不同水合物形成物在水合物生成压力上的差别,通过控制压力使易生成水合 物的组 分发生相态变化从气态到固态,从而实现气体混合物的分离 。据文献【 切 介绍,前苏联专利报导了利用水合物法分离气体的方法在、 下,使 气体混合物通过含水合物促进剂的水溶液,一些轻质气体 如乙烯 与水形成固 体水合 物,从而达到分离气体的目的 。 美国专利四 开发了一种分离轻烃类 气体的设备 。 在此设备中,热水或热盐水与烃类水合物接触使其分解,水从设备中流 出时将 烃类气体以气泡的形式夹带出来 。 美国哥伦 比亚大学等四在年召开 的第一届国际天然气水合物会议上,提出了一种新型气体分离装置利用生成水合物 可将从中分离出来 。美国专利【 划介绍了从天然气中分离特定烃的方 法此方法尤其适用于轻烃和二氧化碳的分离 。 国内马昌峰等研究开发了一种从含 氢气体分离浓缩氢的新技术 。 反胶束技术及应用 反胶束的形成和特性 正常胶束 吻珑是表面活性剂分子在极性溶剂,如水中形成的一种亲水 基团头朝外,疏水基团尾朝内的具有非极性内核的多分子聚集体 。 反胶束 是指表面活性剂分散于连续非极性溶剂中,并且浓度超过某临界 值时临界胶束浓度,自发形成一种稳定的大小 为纳米级的聚集体,其结构以反胶束为例示意于图 一 。其中表面活性剂亲 水头朝内,形成球状的极性核核中能溶解一定数量的水,形成宏观上 透 明均一 、热力学稳定的微乳状夜,而微观上则是一个个纳米级大小的小 “水池 ” 即 。反胶束中增溶的水与表面活性剂分子数之比,即含水量一般用 矿 表面活性剂表示,它是表征反胶束大小的一个较好的标志 。另外反胶 束的大小还与水相酸碱度 、 离子强度 、 溶剂和表面活性剂的种类和浓度以及温度等因 素有关 。 浙江工业大学硕士学位论文 岁竺 粗 、尹,二 分子 女 亲水头 疏水头 以 麦 声获 水中的胶束非极性溶剂中的反胶束 图 一 正反胶束的结构示意图 关于正反胶束的形成机理,目前普遍认可的是、和等提出 的几何 填充模型阅 。 该模型认为界面双重膜的两边分别是极性的亲水基头与水 、 非极 性的烷 基链与油构成的均匀界面 。 在水侧界面,极性头水化形成水化层,而在油侧界 面,油分子是穿透在烷基链中的。 几何填充模型考虑的核心问题是表面活性剂在界面 上的几何填充,用一个参数即所谓的填充系数风 来说明问题,其中,为表面活性剂 分子中烷基链的体积,为平界面上每个表面活性剂极性头的最佳截面积,为烷基 链的长度 为充分伸展的链长之一。于是界面的优先弯曲就取决于此填充系 数,而此填充系数又受到水和油分别对极性头和烷基链溶胀的影响 。当风时, 界面是平的,一 形成的是层状液晶相当头时,烷基链的横截面积大于极性头的 横截面积,界面发生凸向油的优先弯曲,导致形成反胶束反之,当 戊 口 风时,有 利于形成正常胶束 。 对于简单的水一油一表面活性剂体系,如果表面活性剂具有截面积较大的极性头 和面积较小的烷基链 如单链离子型表面活性剂,则其将趋于形成正常胶束 。加入少 量的助表面活性剂,则和 几乎不受影响,而 值增大,于是填充系数增加,当其大 于 时,即可形成正常胶束 。这就解释了为什么对于单链离子型表面活性剂,形成正 常胶束只需要较低的醇 表面活性剂比,而形成正常胶束则需要较高的醇 表面活性剂 比 。如果表面活性剂的烷基链相对于极性头较大如叹丁二酸一 一乙基 己基磺酸 钠,则表面活性剂本身的填充系数即大于,无需填加助表面活性剂,即可形成反胶 束 。 通常形成反胶束体系的有机溶剂为脂肪烷烃,表面活性剂根据其极性基头性质的 不同,可分为以下四种类型非离子型如脂肪醇聚氧 乙烯醚,阳离子型 如二辛基二甲基氯化馁,阴离子型如,两性离子型如卵磷脂。 表 一 列出了一些作为反胶束萃取常用的表面活性剂及相应的有机溶剂 。 浙江工业大学硕士学位论文 表一 常用的表面活性剂及相应的有机溶剂 表面活 性剂有机溶剂 磷脂酸胆碱 磷脂酸 乙醇胺 认 一 烃类一,异辛烷,环己烷,四氯化碳,苯 环 己烷 辛烷 己醇 环 己烷 苯,庚烷 苯,庚烷 己醇 异辛烷,己醇 辛烷,三氯甲烷 辛烷 水在反胶束中以两种形式存在自由水与结合水 。许健和等侧 】通过核磁共振和红 外光谱试验研究了水在异辛烷反胶束体系中的性质,指出反胶束水中的氢键比 普通水中的要少,并且随着含水量的降低而越来少,这主要是因为在较低含水量 的反胶束中,几乎所有的水分子均参与了中的水化,轻基的极性由此增强, 氢核更加裸露,形成的还受到的束缚,因此反胶束中的水与普通水相比, 亲核性大为增强,而流动性大为降低 。 水化完成后,多余的水分子才会用于形成氢键, 随着值的增大,的水化层逐渐饱和,开始出现 自由水分子,且比例越来越大 。 反胶束技术应用 反胶束作为一种新型环境介质有许多应用,如胶束催化 、 胶束增溶分广光度法 等,特别是近年来兴起的反胶束蛋白质萃取和反胶束酶催化技术,引起了生物工程界 的广泛重视 。 年,瑞士的等人首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含有表面活性剂 的有机溶剂中,并首次提出了用反胶束萃取蛋 白质的概念,但当时并未引起人们的广 泛注意 。 直到年代,科学家才 一 开始进行反胶束萃取蛋白质的研究 。 这种萃取技术具 有成本低,溶剂可反复利用,萃取效率高,条件温和不会引起生物活性物质变性,选择 性高,使用范围广,操作简单等优点 。目前已广泛应用于蛋白质的分离和纯化,并逐渐 延伸至其他生物工程产品,如氨基酸 、抗生素 、 核酸等的分离 。 下面主要介绍反胶束 浙江工业大学硕士学位论文 在萃职 分离蛋白质和氨基酸方面的应用研究 。 萃取分离蛋白质 反 胶束萃取分离蛋白质技术的具体应用 目前主要有以下几方面 纯化和分离蛋白质 从植物中同时提取油和蛋白质 从发酵液提取胞外酶 直接提取胞内酶 反胶束萃取用于蛋白质的复性 蛋 白质可以采用种形式增溶于反胶束体系【注入法,向含有表面活性剂 的有机 相中注入含蛋白质的水溶液 。溶解法,对于水不溶性蛋白质,将含水的反相 微胶束有机溶剂与蛋白质固体粉未一齐搅拌,形成含蛋白质的反胶束相转移法, 将含有 蛋白质的水溶液与含表面活性剂的有机相接触,在缓慢搅拌下,部分蛋白质移 入有机相中,直到萃取平衡状态 。前两种方法主要应用于与反胶束体系中酶的催化反 应有关 的领域,而且对于疏水性较强的酶,常采用溶解法而反胶束萃取分离蛋白质 主要是 以相转移,也就是液一液萃取的形式进行的。 在热力学方面,根据热力学基本理论,蛋白质从水相萃入反胶束相中达到平衡 状态时所对应的系统的自由能变化应为最小 。 由于对引起蛋白质萃取前后系统 自由能变化的认识不同,从而有不同的热力学模型 。 等人采用所谓的 “壳一核 ” 模型研究蛋白质萃取过程的热力学,假设反胶 束为球形,反胶束内表面光滑且电荷沿内表面均匀分布 。考虑了静电作用及蛋白质 由 水相进入反胶束相中的理想混合引起的自由能变化 。 其中静电作用 自由能一项通过分 别求解未萃入蛋白质前的 “ 空 ” 反胶束与含蛋白质的 “ 实 ” 反胶束及水相蛋白质胶体 溶液的一方程获得 。该模型的缺点是假设 “ 空 ” 和 “ 实 ” 的反胶束 具有相同的大小,且不随离子强度及的变化而改变 。但是许多实验表明,正是反胶 束的大小随离子强度等的变化才导致了蛋白质分配平衡特性的改变 。 等人提出了一个简化的热力学模型来预测 “ 空 ” 和 “ 实 ” 的反胶束的大小 。 该模型假设系统的 自由能的贡献主要来 自于蛋 白质和反胶束的内表面 的静电作用及 由蛋白质进入反胶束中引起的反胶束体积变化而致的嫡变及 自由离子的重新分配引 起的嫡变 。 根据该模型能够较好的解释离子强度及对萃取过程的影响,但模型中用 浙江工业大学硕士学位论文 到的一 些特性参数 目前无法获得 。 等人也提出了一个热力学模型,研究了萃入蛋白质前后反胶束的大小与 离子强 度,蛋白质的净电荷及尺寸,蛋白质的浓度及含水量等因素的关系 。 模型假设系 统的自 由能变化由三部分组成 蛋白质与表面活性剂及表面活性剂与表面活性剂之间 的静电 作用“ 空 ” 和 “ 实 ” 的反胶束在有机介质的理想混合 相邻的表面活性剂尾部 的空间 相互作用 。 根据该模型,反胶束在萃入蛋白质前后其体积可能变大或变小,这要 根据二 者间的相互作用情况而定 。 反胶束内部及蛋白质与反胶束间的静电作用是使蛋 白质溶 解的主要推动力由于处于反胶束中的蛋白质的屏蔽作用可有效地降低静电作 用 自由能,从而使带有与反胶束内表面同种电荷的蛋白质也有可能被溶入反胶束中 。 以上这些热力学模型都是在假设反胶束呈球形,每个反胶束内只能包埋一个蛋 白 质分子 的前提下推导的 。 由于反胶束的细微结构及蛋白质与反胶束间相互作用的复杂 性,至今 为止,还没有一个一致公认的较为准确的热力学模型 。根据现有模型,只能对 蛋白质 的萃取 反萃过程的行为给予定性的或半定量的预测 。 在 动力学方面,普遍认为利用反胶束萃取蛋白质时,蛋白质的表面电荷同反胶束 的内表 面电荷间的静电作用,是蛋白质增溶于反胶束溶液传质过程的主要推动力 。适 当增强这种静电作用有助于蛋白质在反胶束中的溶解 。同时,蛋白质分子与双亲分子 间的疏水性作用也是其中的一个重要因素,有时甚至成为主要因素 】 。这种静电作 用和疏水性作用,导致在分离性质相近的蛋白质时,缺乏足够的选择性,使得 目标蛋 白质的选择性系数很低 。目 前,亲和反胶束萃取技术一 ,已应用于改善 目标蛋白质分离的选择性,并提高了 蛋白质的萃取率 。 这种方法首先将少量的生物亲和配体增溶 或固定 于反胶束溶液中, 再利用亲和配基与 目标蛋白质的专一性作用,分离 目标蛋 白质刊 。所采用的配体必须 具有亲水性配基 与蛋白质进行结合 和疏水链 用于两相间蛋白质一亲和配体复合物 的传递,这种配体可以是底物的类似物,也可以是产物的抑制剂 。 蛋白质增溶于反胶束溶液的传质过程,主要存在两种观点【一种观点认为反胶 束与蛋白质分子在两相界面直接作用,完成质量转移过程,同时伴随水和离子的增溶 团一,另一种观点认为,蛋白质分子首先与游离的双亲分子 未参与形成反胶束的 在 两相界面结合,形成蛋白质一双亲物质复合物【一 。等冈 把整个过程分为如 下几个步骤 浙江工业大学硕士学位论文 双亲分子与蛋白质分子在两相界面形成蛋白质一双亲物质复合物 卜【 一 。 若形成尸一 。 的双亲分子数 目足够多,即尸一 。 疏水性较强,尸一 。 将从界 面进入 有机相,并存在下列平衡 尸一 水 相卜 尸一 。 有 机 相 若 形成尸一 。 的双亲分子数目相当有限,尸一 。 的疏水性不能使其溶于有机相, 则可能会出现另外两种情况尸一具有一定的双亲特性,会引起乳化现象,否则会在 两相界 面沉淀 。 尸一 。 溶于有机相后,与更多的双亲分子结合,形成增溶了蛋白质的反胶束, 同时伴 随水和离子的增溶过程 一 。 戈 。 。 “一 尺 材 上式。 。 为反胶束中双亲分子的聚集数 目 目前,对于注入法 、液一 固萃取法,普遍认为蛋白质是以第一种机制来实现增溶过 程的,而对于液一 液萃取法,大多数人认为蛋白质的增溶过程与两相界面存在游离的双 亲分子有关 。 利用反胶束萃取蛋白质是一个协同过程,当改变水相的条件如、 离子强度等 时,可实现蛋白质 由有机相到水相的反萃取 。但是反萃取过程一般相当慢 与萃取过 程相比,这主要是由于在传质过程中存在相当大的传质阻力【 。 陆强等口 的试验表明, 选择正向萃取率最低时的值,离子种类和浓度等条件,反萃取率可达。 萃取分离氨基酸 氨基酸可以通过静电或疏水性作用增溶于反胶束中 。 具有不同结构的氨基酸处于 反胶束体系的不同部位,疏水性氨基酸主要存在于反胶束界面,亲水性氨基酸主要溶 解在反胶束的极性水池中 。利用氨基酸与反胶束作用的差异,可以选择性分离某些氨 基酸 。等娜从发酵液中分离了苯丙氨酸等卧 采用三辛基甲基氯化钱 己醇 正庚烷反胶束体系,对种氨基酸,即天氛氨酸、苯丙氨酸 、色氨酸印巧的萃取条件进行了研究,结果表明,即使等电点十分相近的 浙江工业大学硕士学位论文 苯丙氨 酸和色氨酸,也可以完全分离 。 等研究了异亮氨酸在一异辛烷反胶束体系中的萃 取过程,并用双膜理论来表征过程的传质系数如图 一 所示 水相 有机相 相界面 双膜理论中相界面附近的浓度示意图 一曰 图 根据双膜理论,在萃取过程中氨基酸分子由主体水相扩散到相界面,在相界面处, 氨基酸分子被表面活性剂分子包裹,然后被充满的反胶束粒子从相界面扩散到主体有 机相 。因此氨基酸从水相到有机相的传递过程,可以由下列方程描述 ,一 、。 一 吼。 。, ,一 、 几 、,一 粤 。, 、“一 ,一 、 。二几 口 二,一 几。二 一 一 一 一 卫 一 且 戈 口 啥 皿 式中传质通量, ,水相传质系数, 肠自由扩散系数, 有机相传质系数, 、 界面增溶速率系数, 氨基酸 水相 浙江工业大学硕士学位论文 相界面 分配系数 有机相 平衡状态 总传质 阻力和传质速率分别为 丸气 。 。 一 一 班 一 圳一气 一 素 几 一 式中总传质系数,一 界面面积与有机相体积 比,一 试验中水相和有机相体积相等,并假设增溶了氨基酸和未增溶氨基酸的反胶束传 质速率相同。水的传质过程由以下方程描述 一 试 一 刹 叼 一 一 ,水的浓度, 人 水的传质通量, 、式得 , 一 中式由 二 。 一 。二 。 一 六 “ 。才 一 了一、 ,生一弓 匕一口 弋, 气 一 ” 一 通过测定时间和相关浓度可以求得和。 陈少欣和林文蜜在研究用反胶束提取脂肪酶的动力学过程中,以及陆强 、 李 宽宏等在研究反胶束提取牛血清蛋白的动力学过程中,也采用了双膜理论模型, 他们的实验结果证明双膜理论可以较好的应用于反胶束的提取动力学过程 。 氨基酸分析检测方法 氨基酸是蛋白质的基本组成单位,由于氨基酸分析在蛋白质化学 、 生物化学 、 食 品科学 、 临床医学等领域的研究中起着重要的作用,因此,对氨基酸分析方法的研究 浙江工业大学硕士学位论文 与改迁 得到人们高度重视 。年等首先将离子交换树脂应用于氨基酸分析 中,并且研制出世界上第一台利用离子交换树脂和柱后荀三酮衍生检测法进行分析的 氨基唆 自动检测仪 。 其后,人们不断地发展新的氨基酸分析方法,到世纪八十年代 毛细管 电泳技术与电化学测定方法相结合,电导检测和化学发光分析检测技术成为氨 基酸分析的新发展趋势 。 按 检测方法,氨基酸的检测可以分为化学分析法 、电化学法 、分光光度法 、 气相 和液相 色谱法等 。 化学方法主要有凯氏定氮法 、甲醛滴定法 。 这两种方法都可以用于 氨基氮 的测定,其中前者准确度比较高,但是操作步骤多、分析过程复杂,试剂消耗 量大,测定周期长 。后者准确度稍差,但是简单快速,在发酵工业中得到广泛应用 。 电化学方法,由于具有操作简单 、 灵敏度高,检测时间短等优点,越来越受到人们的 关注 。这种方法采用适用于不同氨基酸的选择电极,可对不同氨基酸进行测定,目前 应用比较多的是电导检测和安培检测的法,其中毛细管电泳安培检测法是最灵敏的检测 方法之一 。 朱珠等采用碳纤维素微电极,用蔡一,一 二梭基醛将氨基酸转化 成电活性物质,用毛细管电泳安培法对 种氨基酸进行了分离检测,取得了非常满意 的效果。电化学分析法的主要不足之处在于,可逆性较差 、背景干扰较大,而且具 有电化学活性的氨基酸很少,需要进行衍生化反应 。 分光光度法是利用氨基酸与某些 试剂发生衍生反应,生成具有可见光或者紫外光吸收的化合物,或者能产生荧光的化 合物,从而可以利用分光光度计测定 。 通常能使氨基酸在可见光区有吸收的衍生试剂 有茹三酮、 磺酞氯二甲胺偶氮苯等能使其在紫外光区 域有吸收的衍生试剂有异硫氰酸苯酷等能使其产生荧光的衍生试剂有邻苯 二甲醛、丹酞氯等 。气相色谱和液相色谱法是高效能、高 灵敏度 、操作简单的分析 、分离方法,尤其是近年来发展起来的高效液相色谱技术 ,为氨基酸的分析提供了广阔的前景 。 结合本试验的特点和实验室现有条件,下面重点介绍化学法中的甲醛滴定法和分 光光度法中的荀三酮比色法 。 甲醛滴定法 甲醛滴定法的原理是氨基酸具有酸性的一和碱性的一,它们相互作 用使氨基酸成为中性的内盐 。加入甲醛时,一与甲醛结合,其碱性逐渐消失 。这 浙江工业大学硕士学位论文 样就可 以用碱来滴定一基,并用间接的方法测定氨基酸的含量 。 其反应式如下 日 牛 中 和 曰日 日曰 一、 汗 日 日 、,、 ,、,、 曰口一, , , 甲醛滴定法所用的甲醛为中性甲醛指示剂为百里酚酞滴定剂是氢氧化钠 标准溶 液 。全中和一时溶液的值为一。当样品中只有一种氨基酸时, 从滴定 结果可以算出该氨基酸的含量,如果样品中有多种氨基酸则结果为氨基酸总 量 。 荀三酮比色法 该方法的原理是氨基酸在一定条件下与荀三酮反应,生成蓝紫色的化合物, 可 以比色定量,反应方程式如下 丫 久扮 己 、。 。 了、厂 一 己 、 尸 日 二一一 二 月 卜, 火 心 卢 工丫火 了 尹、 日 甲 日 一一改。 。 氨基酸 荀三酮水合荀三酮 厂、 丫 气,。 一 比万 狡 卢 之 。 。 日,“ 、 奋 产、 还原荀三酮 浙江工业大学硕士学位论文 、己 沂 厂、, ,卜 六 叼绍 还原苛三酮 水合苟三酮 。二 甲 丁 卜 一 一叹人了 尸 蓝紫色化合物 吕诀 、 夕 目 二卜 二二通 爷 火之夕 、 水合郎三酮 苟三酮 御 臀 浑 、 火 尹 气 扩 一飞 人尸 。 己 蓝紫色化合物 这种方法同样测量的是氨基酸总量,但是精度 比甲醛滴定法要高很多,可达 一 一, ,而且生成的衍生物稳定性较好 。 水分分析方法 水分分析方法一般可分为两大类,即物理分析法和化学分析法 。 属于物理分析法 的有干燥失重法 、蒸馏法 、吸附法 、相对密度法 、露点法 、电分析法 、光分析法和气 相色谱法等 。 属于化学分析法的有气体发生法 、 生成酸或碱的方法 、 酸配法 以及卡尔 费 休法等 。 一些经典的方法,如干燥失重法和蒸馏法等,由于操作繁琐,分析时间长,灵敏 度较低和环境湿度干扰较大等原因,已逐渐被仪器分析方法,如电分析法和气相色谱 浙江工业大学硕士学位论文 法等听 代替 。 这些仪器分析方法操作简便 、灵敏度高、再现性好,并能连续测定,自 动显示 数据 。 卡尔 费休法属经典方法,但经过近年改进,提高了准确度,扩大了测 量范围,已被列为许多物质中水分测定的标准方法。下面着重介绍卡尔 费休法 、 和气相 色谱法 。 卡尔 费休法 卡 尔 费休法简称费休法,是年卡尔 费休提出的测定水 分的容 量分析方法,属于碘量法,是测定水分最为准确的化学方法,现在的一些水分 自动分 析仪器也是基于该方法研制而成的 。本文的实验部分的水分分析即采用该方 法 。 卡 尔 费休试剂由碘 、 二氧化硫 、 有机碱及溶剂等组成,溶剂一般为醇类,如甲 醇 、乙二醇 、 一 甲氧基乙醇或它们的混合物等 。 只要卡尔 费休滴定仪的滴定杯中有 游离水存在,卡尔 费休试剂中的游离碘就会参与反应 。滴定的总反应为 式中指有机碱,如毗淀 、咪哇等,指醇类 。 通常配制费休试剂时只有碘应严格依照化学计量,其他组分则是过量的,一般采 用的摩 尔比为碘二氧化硫毗咤甲醇。试剂对水的滴定度约在 一,而在测定痕量水时可低于。 费休试剂 由于其强的反应性能, 容易引起一些副反应,同时也易为环境湿度所污染,所以必须经常标定 。多久标定一 次,取决于所选的卡尔 费休试剂 、 滴定仪的密闭程度以及所需的准确程度 。 测定时 最好每天都要标定卡尔 费休试剂 。 其标定方法一般有纯水标定 、 含水甲醇标准溶液 标定和稳定的结晶水合物问标定三种 。 纯水一般为去离子水或符合标准的 水 。 大多数的实验室都采用纯水来标定卡尔 费休试剂 。费休法的滴定终点,对于无 色试液可用 目视法判断 。带有颜色的试液,则需用永停滴定法门或电位滴定法周 判断终点 。目视法是经常用来判定终点的方法,对滴定毫克量的水分能获得满意的结 果 。 滴定时,试剂中的碘在溶液中呈浅黄色,当终点达到时,则变为棕黄色 。对于稍 有颜色的试液进行滴定时,可预先配制碘的甲醇溶液作为终点的标准色进 行对照 。 多年来,费休法广泛地应用于各种液体,固体及一些气体样品中水分的测定,均 给出满意的结果 。在很多场合下,常被作为水分,特别是级痕量水分的标准分 浙江工业大学硕士学位论文 析方法,用 以校正其他的测定方法 。 许多分析工作者曾对此方法进行 了较为全面的研 究,征 反应的化学计量 、 试剂的稳定性 、 滴定方法 、当点的指示以及针对各种类型样 品的应 用和仪器操作的自动化等方面均有显著的改进,使这一方法日趋成熟