《核酸生产》PPT课件.ppt

项目二、核酸生产 任务1、核酸制备方案 生物制药1111 樊贝贝 目录 核酸知识复习 核酸类药物特性 动物肝脏DNA的提取 酵母RNA的提取 核酸类药物检测 核酸知识复习 核糖（核糖 脱氧核糖）核糖（核糖 脱氧核糖） 核苷 核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤） 碱基 碱基 核酸 核酸 核苷酸核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶） （DNADNA、RNARNA） 磷酸 磷酸 DNADNA和和RNARNA是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。 DNADNA主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（2%2%）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中； RNARNA主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（10%10%）存在于核仁、核浆和染色体）存在于核仁、核浆和染色体 中。中。 核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如 动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。 核酸类药物特性 又称核苷酸类药物。由某些动物 、微生物的细胞中提取出的核酸(包括 核苷酸和脱氧核苷酸)，或者用人工合 成法制备的具有核酸结构(包括核苷酸 和脱氧核苷酸结构)同时又具有一定药 理作用的物质，称为核酸药物或核酸类 生化药物。广义的核酸药物可包括核苷 酸药物、核苷药物及含有不同碱基化合 物的药物。核酸药物具有多种药理作用 ， 按其作用特点可分为： (1)抗病毒剂，代表药物有三氮 唑核苷、无环鸟苷和6可糖腺苷等 ，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病 毒及其他病毒； (2)抗肿瘤剂，代表药物有用于 治疗消化道癌的氟尿嘧啶以及用于 治疗各类急性白血病的阿糖胞苷 (3)干扰素诱导剂，代表药物为聚肌胞，临床上 用于抗肝炎病毒、疱疹病毒等； (4)免疫增强剂，主要用于抗病毒及抗肿瘤的辅 助治疗； (5)供能剂，用于肝炎、心脏病等多种疾病的辅 助治疗。药用腺苷三磷酸(ATP)原粉可从酵母 RNA为原料制备，也可通过人工合成及发酵 生产。 核酸类药物 动物肝脏DNA的提取 目的： 了解分离提取DNA的一般原理，掌握从 动物肝脏中提取DNA的方法 原理 在浓氯化钠（1-2molL-I)溶液中，脱氧核糖 核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解 度很小。在稀氯化钠（0.14molL-1）溶液 中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖 核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同 浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和 核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺 酸钠）处理，DNA(或RNA)即与蛋白质分开 ，可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去， 而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适 量乙醇，DNA即析出。 为了防止DNA（或RNA）酶解，提取时加 EDTA（ethy-lenediamine tetraceticacid， 乙二胺四乙酸）。 器材及试剂 器材 新鲜猪肝（一次用不完一定要冷冻保存） 匀浆器 离心机5000rmin-1 量筒 50ml（1）、10ml（1） 水浴锅 纱布 真空干燥器 试剂 5molL-1NaCl溶液：将292.3gNaCl溶于水 ，稀释至1000ml。 0.14molL-1NaCl-0.0015molL-1EDTA-Na 溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于蒸 馏水中，稀释至1000ml。 25%SDS溶液：溶于25g十二烷磺酸钠于 100ml45%乙醇。 0.015molL-1NaCl-0.0015molL-1柠檬酸三 钠溶液：氯化钠0.828g及柠檬酸三钠 0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 氯仿异戊（丙）醇混合液：氯仿：异戊 （丙）醇=24:1（v/v） 1.5molL-1NaCl-0.15molL-1柠檬酸三钠溶 液：氯化钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于 蒸馏水，稀释至1000ml。 3molL-1乙酸钠-0.001molL-1EDTA-Na溶 液：称取乙酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶 于蒸馏水，稀释至1000ml。 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙 醇。 抽提 猪脾脏 预处理 冷冻，绞碎 组织浆液 预处理 0.1M NaCl-0.5M 柠檬酸混合液， 离心 沉淀 1.71M NaCl 上清液 （DNP） 沉淀 （DNP） 溶解液 0.14M NaCl 沉淀物 白色纤维状 DNA 10% NaCl 上清液 （DNA） 氯仿-异戊醇95%乙醇 真空干燥 工艺路线 具体操作方法 1.取猪肝2030g，用适量0.14molL-1NaCl- 0.10molL-1EDTA溶液洗去血液，剪碎，加入 3050ml0.14molL-1NaCl-0.10molL-1EDTA溶 液，置匀浆器或研钵中研磨，研磨一定要充分 ，待研成糊状后，用单层纱布滤去残渣，将滤 液离心10分钟（4000rmin-1）弃去上清液，沉 淀用0.14molL-1NaCl-0.10molL-1EDTA溶液洗 23次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。 2.向上述沉淀物加入0.14molL-1NaCl-0.10molL- 1EDTA 溶液，使总体积为37ml，然后滴加 25%SDS溶液3ml，边加边搅拌。加毕，至60 水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变得粘稠并略 透明，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白 质分离。 3.加入5molL-1NaCl溶液10ml。是NaCl最终浓度 达到1molL-1，搅拌10分钟，加入月一辈体积的 氯仿-异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，静置 分层，取上、中两层液离心10分钟（4000rmin-1 ）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.52倍95% 乙醇，DNA沉淀即析出，用玻璃棒顺着一个方向 慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。 4.将DNA粗品置于27ml0.015molL-1NaCl- 0.0015molL-1柠檬酸三钠溶液中，再加入 3ml1.5molL-1NaCl-0.15molL-1柠檬酸三钠溶 液，搅匀，加入一倍体积氯仿-异戊（丙）醇 混合液，振摇10分钟，离心（4000rmin-1， 10分钟），倾出上层液（沉淀弃去），加入 1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心 ，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步 骤重复一次。 5.将上步所得沉淀溶于27ml0.015molL-1NaCl- 0.0015molL-1柠檬酸三钠溶液中，然后以线 状徐徐加入2倍95%乙醇，边加边搅，取出丝 状DNA，依次用75%、80%、95%及无水乙 醇各洗一次，真空干燥。保存待用。 酵母RNA的提取 目的 学习稀碱法提取RNA的技术 原理 组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即 溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白 质则留在酚层中，向水层加入乙醇后， RNA即以白色絮状析出，此法能较好的除 去DNA和蛋白质。 酵母 器材与试剂 器材 干酵母粉、鲜酵母、PH试纸、 天平、烧杯、量 筒、抽滤瓶，吸管、布氏漏斗、离心机 试剂 0.2NaoH溶液、2gNaoH溶于水并稀释至100mol。 乙酸、95%乙醇、无水乙醚。氨水、10% 的硫酸溶液、 5%的硝酸银溶液 、苔黑酚三氯化铁试 剂 工艺路线 酵母菌体 提取液抽提清液 RNA粗品RNA精品 稀NaOH，提取中和，分离 洗涤、干燥 pH2.5 操作步骤 1、RNA的提取：置4g干酵母粉于100mL的烧杯中 ，加入0.2%的氢氧化钠溶液40mL 2、沸水浴加热30分钟，不停搅拌 3、加入乙酸数滴，使提取液呈酸性 4、离心1015分钟（4000rmin-1） 5、取上清液，加95%乙醇30mol，边加边搅拌，加 毕，静置，待完全沉淀，过滤。 6、滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml)，继续 用无水乙醚洗2次，洗涤时可用细棒小心搅拌沉淀 。乙醚虑干后，滤渣即为粗RNA,可作鉴定。 核酸类药物检测 1、DNA含量测定 DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所 以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通过测定 磷酸或戊糖的量来测定DNA的量，前者称为定磷法 ，后者称为定糖法。 （1）定磷法 磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸 收峰在660nm。 （2）定糖法二苯胺法 酸性条件下，DNA与二苯胺共热，生成蓝色化合物 ，吸收峰595nm。 2 2、RNARNA含量测定含量测定 （ （1 1）定磷法）定磷法660nm660nm； （ （2 2）定糖法）定糖法地衣二酚（苔黑酚）法。地衣二酚（苔黑酚）法。 盐酸水解盐酸水解RNARNA，使核糖游离出来，并生成，使核糖游离出来，并生