电泳法和高效毛细管电泳法.ppt

第10章 电泳法和高效毛细管电泳法 (Electrophoresis and High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 毛细管电泳是带电粒子在电场力的 驱动下，在毛细管中按其淌度或分 配系数不同进行高效、快速分离的 电泳新技术，也称为高效毛细管电 泳。 20世纪3040年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius） 建立了移动界面电泳，将电泳发 展成分离技术 获得1948年诺贝尔化学奖 1981,J.W.Jorgenson,K.D. Lukacs实验上和理论上为毛 细管电泳的发展奠定了基础 。 10.1.2 毛细管电泳的原理 1 装置 毛细管 数据处理 电极 检测器 电极 试样 缓冲液 缓冲液 高压电源 （可高至30KV） 第10章电泳法和高效毛细管电 10.1.3 分离模式 1 毛细管区带电泳 2 胶束电动毛细管色谱 3 毛细管凝胶电泳 4 亲和毛细管电泳 5 毛细管电色谱 6 毛细管等电聚焦电泳 7 毛细管等速电泳 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 1 毛细管区带电泳（CZE） 也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其 它各种操作模式的母体 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 2 胶束电动毛细管色谱 胶束电动毛细管色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术 胶束电动毛细管色谱 MECC:是以胶束为假固定相的一种 电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合 加入高于胶束临界浓度的 表面活性剂 胶束电动色谱的应用特点: 使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离 中性化合物. 比高效液相色谱更为高效. HPLC 分离柱效为500025000理论板数/m MECC 可达到50000500000理论板数/m 比高效液相色谱更为高速.MECC分离时间通常小于 30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 3 毛细管凝胶电泳 CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方 式 用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构 ，按分子的大小分离 毛细管凝胶电泳的特点： 综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点 ， n电泳峰尖锐，柱效极高 n短柱上实现极好的分离 n试样容量为1012g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短 已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等 强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用 于DNA序列快速分析。 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 5 毛细管电色谱 CEC:以电渗流驱动流动相， 开管和填充两种，通常填充或涂布固定相 比高效液相色谱具有更高的柱效 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 6 毛细管等电聚焦 CIEF: 建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差 异基础上的分离方法，通过建立pH值梯度。 蛋白质的等电点(pI): 指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。 进样等电聚焦检测 n先将脱盐的试样（蛋白质）以1的浓度与两性电解 质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于 阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极 电解质如NaOH中。 n施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的 位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内 停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很 窄的不同pH区域内聚焦. n在阳、阴极电解液中加入盐如NaCl或NaOH,破坏pH梯度 ，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移 、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 毛细管等电聚焦的实验方法: 毛细管等电聚焦特点: n等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一 过程可用于浓缩试样组分。 n具有极高的分辩率，可以分离等电点相差 0.01pH的两种蛋白质. 注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 第10章 毛细管电泳 10.1.3 分离模式 7 毛细管等速电泳 分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同 ，等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解 质溶液和终结(后继）电解质溶液，分离后的各组分 区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。 等速电泳所要求的条件: 1. 特殊的电解质系统: 在毛细管等速电泳中,用有效淌度比样品中任何离 子的有效淌度都大, 并具有一定缓冲能力的离子作为 前导电解质 ( leading electrolyte ), 加入到末端 (检测端) 电解槽和毛细管中, 用有效淌度比样品中 任何离子的有效淌度都小, 并具有一定缓冲能力的离 子作为尾随电解质 ( terminating electrolyte ) 加入起始端电解槽中. 样品加在前导电解质和尾随电 解质之间. 系统中要加入对离子, 以满足电中性的要 求. 区带电泳和等速电泳使用的电解质溶液的不同 在区带电泳中，整个系统都用同一种电解质 充满，这种电解质被称为背景电解质或支持 电解质。它运载电流并有一定的缓冲能力。 在等速电泳中，不加入这样的背景电解质。 2. 背景电流要小到足以克服区带电泳效应 在毛细管等速电泳中, 由于没有一个背景电解 质支持电流 (毛细管等速电泳要求溶剂的自身 电导可以忽略不计 ), 各区带互相连接. 毛细管等速电泳一般用恒流操作模式. 分离开始后, 在电压的作用下, 各组分由于淌度 的不同被分离. 系统通电后, 样品中迁移速度最大的离子运动最快 , 但慢于前导电解质. 迁移速度最小的离子运动最慢, 但快于尾随电解质 , 具有不同淌度的离子得到分离。 恒稳态时所有区带具有相同的移动速度. 第10章 毛细管电泳 10.2.3 理论效率及表示方法 1.理论塔板高 H=L/N N= 5.54(tR/ W)2 实验上可按上式求出理论塔板数 W为电泳峰的半峰宽 2.分离度（Rs）， 1 1 毛细管电泳系统：毛细管电泳系统： 高压电源高压电源 （可高至（可高至 30KV30KV） 毛细管毛细管数据处理数据处理 检测器检测器 电极电极 电极电极 缓冲液缓冲液试样试样 缓冲液缓冲液 基本结构：高压电源、电解液槽和进样系统、毛细 管及恒温装置、检测器、数据处理装置 10.3 电泳仪和高效毛细管电泳仪 高压电源:0-30kv连续可调的直流高压电源 毛细管柱： 内径25-75m,常用50和75m 材料：石英为主，长度30-70cm, 凝胶柱20cm左右。 基本结构： （3） 进样方法 电动力学进样 也称电迁移进样. 样品 方法: 将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试 样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间 施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳 和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换 成载体缓冲液，电泳即可进行。 电极 电极 样品 压力 样品 真空 样品 虹吸 流体动力学进样 A 进样端加压 B 检测端出口减压 C 虹吸进样 流体动力学进样优点： 1.若严格控制样品的黏度和 温度，则进入毛细管的量是 固定的； 2.在进样中没有进样歧视。 A B C (4 ) 检测器 检测器 检出限（mol/L） 特 点 UV可见吸收 10-510-6 近似通用，常规应用 荧光 非相干光诱导 10-710-8 灵敏，但试样通常要衍生 激光诱导 10-1010-12 高灵敏度，价格贵，要衍生化 电化学 电导 10-510-7 通用性 安培 10-810-9 选择性，灵敏度高，微量 质谱 10-710-9 仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高 放射 10-910-11 灵敏度高，操作有特殊要求 (4 ) 检测器 检测器 检出限（mol/L） 特 点 UV可见吸收 10-510-6 近似通用，常规应用 荧光 非相干光诱导 10-710-8 灵敏，但试样通常要衍生 激光诱导 10-1010-12 高灵敏度，价格贵，要衍生化 电化学 电导 10-510-7 通用性 安培 10-810-9 选择性，灵敏度高，微量 质谱 10-710-9 仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高 放射 10-910-11 灵敏度高，操作有特殊要求 10.4 毛细管电泳在医药中的应用 一. 毛细管电泳在药学中的应用 （一）手性药物的分离 （二）其他药物的分离 二. 毛细管电泳在医学中的应用 A 对照品的电泳图谱 B 样品的电泳图谱 （背景电解质：20mmol/I 硼砂缓冲溶液(含10乙醇) ，pH 9.0 ）Agilent HP3DCE高效毛细管电泳仪(德国)； 未涂层弹性石英毛细管柱50 75m，有效长度为43cm压力 进样(5 s)，分离电压为25 kV，分离温度为25，检测波长为 206nm. 例：桂林西瓜霜喷剂中盐酸小檗碱、苦参碱与黄芩苷 的毛细管电泳测定 盐酸小檗碱 苦参碱 黄芩苷 仪器：高效毛细管电泳-二极管阵列检测器(HPCE-DAD) 毛细管柱长度585cm75 m，分离电压25 kv， 进样量3.