10 维生素的测定_ppt课件

单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *1 第十章 食品中维生素的测定 课程导言 维生素也称维他命，是人体不可缺少的一种营养素。维生 素跟酶类一起参与着肌体的新陈代谢，能使肌体的机能得到 有效的调节。人体中如果缺少维生素，就会患各种疾病。 3000多年前，当时古埃及人发现夜盲症可以被一些食物 治愈，虽然他们并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这 是人类对维生素最朦胧的认识。 1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南美洲 东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床破了，有的船 员流鼻血，有的船员浑身无力，待船到达目的地时，原来的 200多人，活下来的只有35人，人们对此找不出原因。 1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重 的坏血病，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛弃在 一个荒岛上。待他苏醒过来，用野草充饥，几天后他的坏血 病竟不治而愈。 诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万水手的生命。1747 年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军和远征 船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的建议被采纳，从 此未曾发生过坏血病。但那时还不知柠檬中的什么物质对 坏血病有抵抗作用。 坏血病是由于人体缺乏VC所引起的疾病。长期摄入不足或腹泻、呕 吐等情况，都可造成缺乏VC，使胶原蛋白不能正常合成导致细胞联结 障碍，使毛细血管的脆性增加，从而引起皮、粘膜下出血，医学上称为 坏血病。人工哺乳婴儿及成人食物中长期缺乏新鲜果蔬菜(嗜酒、偏食等 )、或长期感染对维生素C需要量增多时，可患本病。 维生素C缺乏后数月，患者全身乏力，精神抑郁、厌食、营养不良， 牙龈肿胀、出血，并牙齿松动、脱落，骨关节肌肉疼痛，皮肤淤点、淤 斑，毛囊过度角化、周围出血，小儿可因骨膜下出血而致下肢假性瘫痪 、肿胀、膝关节半屈，足外旋，蛙样姿势。 随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们认识和 发现，维生素成了一个大家族。人们把它们排列起来以便于 记忆，维生素按A、B、C一直排列到L、P、U等几十种。 现代科学进一步肯定了维生素对人体的抗衰老、防止心 脏病、抗癌方面的功能。 1912年，波兰科学家丰克，经过千百次的试验，终于从 米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色物质。这种物质 被丰克称为 “维持生命的营养素”，简称Vitamin(维他命)， 也称维生素。 10-1 概述 一、概念 维生素是从营养观点归纳而成的一类有机化合物，它 们的化学性质、结构及生物功能各异，有的属于胺类(如 VB1)，有的属醛类(如VB6)，有的属于醇类(如VA) ，有的 属于酚类或醌类化合物等。 三、维生素的性质与提取 （一）脂溶性维生素的性质 1、溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇 、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂； 2、酸碱稳定性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定；VE对 酸稳定，对碱不稳定； 3、光热稳定性：VA、VD、VE耐热性好；VA因分子中 有双链，易被氧化，光、热可促进其氧化；VD性质稳定 ，不易被氧化，VE在空气中能慢慢被氧化，光、热、碱 能促进其氧化作用。 （二）脂溶性维生素的提取 皂化处理水洗除脂有机溶剂提取浓缩 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入 抗氧化剂（如焦性没食子酸、维生素C等）；对于某些液 体试样或脂肪含量低的试样，可以先用有机溶剂抽出脂类 ，然后再进行皂化处理；对于维生素A、D、E共存的试样 ，或杂质含量高的试样，在皂化提取后，还需进行层析分 离。分析操作一般要在避光的条件下进行。 （三）水溶性维生素的性质 1、溶解性：易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多 数有机溶剂； 2、酸碱稳定性：在酸性介质中稳定，即使加热也不破坏 ；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下 加热，可大部或全部破坏； 3、光热稳定性：它们易受空气、光、热、酶、金属离子 等影响，VB2对光，特别是紫外线敏感，VC对氧、铜离子 敏感，易被氧化。 （四）水溶性维生素的提取 测定水溶生维生素时，一般都在酸性溶液中进行 前处理。 VB1、VB2通常采用酸水解，或在经淀粉酶、木瓜蛋 白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再将它们 从食物中提取出来。 VC通常采用草酸或草酸-醋酸直接提取。 在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质 对维生素的破坏。 四、维生素测定的意义 随着营养知识的普及，维生素在日常膳食及其在食品 加工中的重要地位越来越受到重视，我们在评价食品的 营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人 们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件， 最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入 量，防摄入过多的维生素而引起中毒，都离不开分析检 测工作。所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有 重要的意义。 10-2 维生素C的测定 一、维生素C的结构和性质 VC是一种己糖醛基酸 化学名称为：L-3-氧代苏己糖醛 酸内酯 英文名：Vitamin C ，Ascorbic Acid 维生素C为无色晶体，难溶于脂肪，易溶于水，其水溶 液具有酸性，对酸稳定，遇碱或遇热极易破坏，具有较强 的还原性，易氧化，铜盐可促进其氧化。 维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜。特别是鲜 枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。 自然界存在两种形式的VC：抗坏血酸（还原型VC）和脱氢抗 坏血酸（氧化型DHVC），VC具有较强的还原性，对光敏感，氧 化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解 则生成2，3二酮古乐糖酸，失去生理作用。在食品中，这三种 形式均有存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以 抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。 二、 2，6-二氯靛酚滴定法 1、原理 2、6-二氯靛酚是一种染料，其颜色反应表现为两种 特性。一是取决于氧化还原状态，氧化态为深蓝色， 还原态为无色；二是受其介质酸度的影响，在碱性介 质中呈深蓝色，在酸性溶液介质中呈浅红色。 用蓝色的碱性染料标准液，滴定含维生素C的酸性浸 出液，染料被还原为无色，到达终点时，稍微过量的2、6 -二氯靛酚染料在酸性溶液中呈浅红色即为终点。从染料 消耗量即可计算出试样中还原型抗坏血酸量。 本标准适用于果品、蔬菜及其加工制品中还原型抗坏 血酸的测定(不含二价铁、二价锡、一价铜、二氧化硫、 亚硫酸盐或硫代硫酸盐)，不适用于深色样品。 2、适用范围 3、试剂 （1）浸提剂 偏磷酸溶液（20g/L） 草酸溶液（20g/L） （2）抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)：称取100mg（准确 至0.1mg）抗坏血酸，溶于浸提剂中并稀至100mL。现 配现用。 （3）白陶土(或称高岭土): 对维生素C无吸附性。 （4）2，6-二氯靛酚标准溶液 称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中，然后称 取2，6二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却 定容至250mL，过滤至棕色瓶内，保存在冰箱中。 每次使用前，用标准抗坏血酸标定其滴定度。即吸取 1mL 抗坏血酸标准溶液于250mL锥形瓶中，加人10mL浸 提剂，摇匀，用2，6二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色 15s不褪色为止。同时，另取10ml浸提剂做空白试验。 滴定度计算: 式中： T滴定度，每毫升2，6二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克 数，mg/mL； C抗坏血酸的浓度，mg/mL； V吸取抗坏血酸的体积，mL； V1滴定抗坏血酸溶液所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mL； V2滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mL。 4、测定步骤 （1）试样制备 称取具有代表性试样的可食部分100g，置于组织捣碎 机中，加入100mL 浸提剂，迅速搅拌成匀浆。称取10g 40g浆状样品于烧杯中，用浸提剂将试样移入100mL容量 瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过滤，取中间滤液备用。 若滤液有色，可按每克试样加0.4g白陶土脱色后再 过滤。 （2）测定 吸取试样处理滤液10mL，于50mL锥形瓶中，用已标定 过的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液出现微红色15s不 褪为终点。 同时做空白试验。 5、结果计算 式中: X试样中维生素C含量，mg/100g； V滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL； V0滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL； T2，6-二氯靛酚染料滴定度，mg/mL； A稀释倍数； W一样品质量，g。 6、说明 1）本法测定的结果为食品中的还原型L-抗坏血酸含量， 而非VC总量。不适用于深色样品。 2）维生素C在酸性条件下较稳定，故试样处理或浸提都应 在弱酸性环境中进行。浸提剂以偏磷酸 （HPO3） 稳定维 生素C效果最好，但价格较贵。一般可采用草酸（20g/L） 代替偏磷酸，价廉且效果也较好。 3）整个操作过程应迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化。 三、荧光法 GB/T 5009.86-2003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（第一法） （一）原理 试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸 后，与邻苯二胺 （OPDA） 反应生成有荧光的喹唔啉（ quinoxaline）。其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条 件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸 的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应 ，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。 （二）试剂 1、偏磷酸-乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙 酸及250mL水，加温、搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水 至500mL。于4冰箱可保存7d10d。 2、偏磷酸-乙酸-硫酸液：称取15g 偏磷酸，加入40mL 冰乙酸及250mL 0.15 mol/L 硫酸液，加温，搅拌，使之逐 渐溶解，冷却后加0.15mol/L硫酸液至500mL。 3、硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100mL乙酸 钠（500g/L）溶液中，临用前配制。 4、邻苯二胺溶液（200mg/L）：称取20mg邻苯二胺， 临用前用水稀释至100mL。 5、抗坏血酸标准使用液（100g/mL） 6、0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加 0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧 化钠的用量约为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL。 变色范围： pH1.2时为红色； pH2.8时为黄色； pH 4为蓝色。 7、活性炭的活化：加200g炭粉于1L盐酸（1:9）中， 加热回流1h2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止， 置于110120烘箱中干燥，备用。 （三）仪器 荧光分光光度计 （四）操作方法 1、试样的制备 称取100g鲜样，加100mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入捣碎 机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调式匀浆酸碱度。如显 红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，如呈黄色或蓝色，则 用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.20。 匀浆的取量需根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样 液含量在40g/mL100g/mL之间，一般取20g匀浆，用 偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL。过滤，滤液备用。 2、测定 （1）氧化处理：分别取上述试样滤液及抗坏血酸标准 使用液（100g/mL）各100mL于200mL具塞锥形瓶中，加 2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液， 分别收集其余全部滤液，即试样氧化液和标准氧化液，待 测定。 （2）各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中，分 别标明“标准”及“标准空白”。 （3）各取10mL试样氧化液于2个100mL容量瓶中，分 别标明“试样”及“试样空白”。 （4）于“标准空白”及“试样空白”中各加5mL硼酸-乙酸 钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4冰箱 中放置2h3h，即得“标准空白”及“试样空白”溶液，取出 备用。 （5）于“试样”及“标准”中各加5mL 500g/L乙酸钠溶液 ，用水稀释至100mL，即得“试样”溶液及“标准”溶液（ 10g/mL），备用。 3、标准曲线的制备 取上述“标准”溶液（抗坏血酸含量10g/mL）0.5mL、 1.0mL、1.5mL和2.0mL标准系列，分别置于10mL带盖试管 中，再用水补充至2.0mL。 4、荧光反应 取“标准空白”溶液、“试样空白”溶液及“试样”溶液各 2mL，分别置于10mL带盖试管中，连同标准系列，在暗室 迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温 下反应35min，于激发光波长328nm、发射光波长420nm处 测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光 强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准 曲线或进行相关计算。 （五）结果计算 式中： X试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g； C由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，g/mL； m试样质量，g； V荧光反应所用试样体积，mL； F试样溶液的稀释倍数。 1、本法适用于蔬菜、水果及其制品中抗坏血酸和脱氢 抗坏血酸的总量。本法检出限为5g/mL20g/mL。 2、影响荧光强度的因素很多，各次测定条件很难完全 再现，因此，标准曲线最好与样品同时做。 （六）说明 四、2，4-二硝基苯肼法 GB/T 5009.86-2003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（第二法） （一）原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮乐古糖酸。试 样中的还原型抗坏血酸经酸性活性炭氧化为脱氢型抗坏血 酸，再与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与 总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色， 由标准曲线计算试样中总抗坏血酸含量。 （二）试剂 1、4.5mol/L硫酸和85%硫酸 2、2，4-二硝基苯肼溶液（20g/L）：溶解2g 2，4二硝基苯 肼于100mL 4.5mol/L硫酸溶液中，过滤。不用时存于冰箱内， 每次用前必须过滤 3、草酸溶液（20g/L与10g/L） 4、硫脲溶液（10g/L与20g/L ）：溶解5g（10g）硫脲于 500mL上述草酸溶液（10g/L）中 5、1mol/L盐酸溶液 6、VC标准溶液：称取100mg纯VC溶解于100mL草酸溶液（ 20g/L）中。此溶液每毫升相当于1mg VC 7、活性炭 （三）仪器 1、恒温箱：370.5； 2、可见-紫外分光光度计； 3、捣碎机 （四）操作方法 1、试样制备（全部实验过程要避光） （1）鲜样制备：称取100g鲜样及吸取100mL 20g/L草酸溶液，倒 入捣碎机中打成匀浆。取1040g匀浆（含12mg抗坏血酸）转 移到100mL容量瓶中，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。 （2）干样制备：称取试样1g4g（含1mg2mg抗坏血酸）放入 乳钵内，加入10g/L草酸溶液磨成匀浆，转入100mL容量瓶内，用 10g/L草酸溶稀释至刻度，混匀。 （3）液体试样：直接取样（约含1mg2mg抗坏血酸）用10g/L 草酸溶液定容至100mL。 将试样溶液过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用 离心机离心后，倾出上层清液，过滤，备用。 2、氧化处理 吸取25mL上述滤液于锥形瓶中，加入活性炭2g，振摇 1min，过滤。弃去数毫升初滤液。取10mL此氧化提取液， 加入10mL 20g/L硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液。 3、呈色反应 （1）于三个试管中各加入4mL氧化处理后的稀释液，一个试管作 空白，在其余试管中加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液（20g/L）， 将所有试管放入370.5恒温箱或水浴中，保温3h。 （2）3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管 取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL 2，4-二硝基苯肼溶液（ 20g/L），在室温中放置10min15min后放入冰水内，其余步骤 同试样。 4、85%硫酸处理 当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL硫酸（ 85%），滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。 将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 5、比色 用1cm比色杯，以空白液调零点。于波长500nm处 测定吸光值。 6、标准曲线的绘制 （1）加2g活性炭于50mL抗坏血酸标准溶液中，振摇1min，过滤 。 （2）取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用10g/L草 酸溶液稀释至刻度，此溶液抗坏血酸浓度为20g/mL。 （3）取5、10、20、25、40、50、60mL上述稀释液，分别放入7个 100mL容量瓶中，用10g/L硫脲溶液稀释至刻度，得一标准系列。 每个容量瓶中最后稀释液对应的抗坏血酸浓度分别为1、2、4、5、 8、10、12g/mL。 以下同前 （五）计算 式中： X试样中总抗坏血酸的含量，mg/100g； C由标准曲线查得或由回归方程算得“试样氧化液”中总 抗坏血酸的浓度，g/mL； V试样用10g/L草酸溶液定容的体积，mL； F试样氧化处理过程中的稀释倍数； m试样质量，g （六）说明 1、 加入硫脲可防止抗坏血酸氧化，且有助于促进脎的形 成。最后溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。 2、 加入硫酸后显色，因糖类的存在会造成显色不稳定， 30min后影响将减少，故加硫酸30min后方可比色。 3、 于冰浴上加入硫酸需一滴一滴加入，边加边摇，若加 得过快，温升过高，将使糖类炭化产生焦糖色，影响测定结 果。溶液温度需保持10以下。 4、活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸 附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定 结果偏低；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，也使 结果偏低。 5、本法为GB/T5009. 86-2003蔬菜、水果及其制品 中总抗坏血酸的测定中的第二法，适用于蔬菜、水果 及其制品中总抗坏血酸（还原型、脱氢型和二酮古糖酸 ）的测定。本法检出限为1g/mL12g/mL。 五、分光光度法 荧光法和2，4-二硝基苯肼法测定的是氧化脱氢型抗坏 血酸，不能测定其主要成分还原型抗坏血酸，而且局限于 果蔬类试样，操作非常繁琐；对营养强化食品、蛋白食品 等试样的测定更不适应。 （食品中还原型抗坏血酸的测定GB/T 5009.159-2003 ） （一）原理 在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的 草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物。在最大吸收波长420nm 处测定吸光度，与标准系列比较定量。 1、乙酸溶液（2mol/L与0.5mol/L） （二）试剂 2、乙二胺四乙酸二钠溶液（0.25mol/L） 3、蛋白沉淀剂 （1）乙酸锌溶液（220g/L） （2）亚铁氰化钾溶液（106g/L） 4、显色剂：固蓝盐B（Fast Blue Salt B）溶液（2g/L） 5、抗坏血酸标准溶液（0.1g/L） （三）仪器 1、分光光度计 2、捣碎机 3、离心机 4、10mL具塞玻璃比色管 （四）分析步骤 1、试样溶液的制备 （1）非蛋白性食品 液体试样：抗坏血酸含量在0.2 g/L以下的试样， 混匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量在0.2g/L以上的 试样，用水适量稀释后测定。 水溶性固体试样：准确称取1.0g5.0g，精确至 0.001g（含0.2g/kg以下抗坏血酸）放人乳钵中，加5mL 乙酸溶液（2mol/L）研磨溶解后，移入100mL棕色容量 瓶内，加水稀释至刻度。 蔬菜、水果：称取鲜样可食部分20.0g50.0g于捣碎 机内，加同倍量的乙酸溶液（2mol/L）捣成匀浆。称取 10.0g20.0g匀浆（含0.2g/kg以下抗坏血酸）于100mL棕 色容量瓶内，加5mL乙酸溶液（2mol/L），用水稀释至刻 度，混匀。 用滤纸过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心 机离心后，上清液供测定。 （2）蛋白性食品（奶粉、豆粉、乳饮料、强化食品等） 固体试样：混匀后精密称取5.0g10.0g，精确至0.001g； 液体试样：用移液管精密吸取5.0mL10.0mL于100mL 棕色容量瓶内。 加10mL乙酸溶液（2mol/L）、乙酸锌溶液（220g/L）和 亚铁氰化钾溶液（106 g/L）各7.5mL，加水至刻度，混匀。 将全部溶液移入离心管内，以3000r/min离心10min，上清液 供测定。 同时取与处理试样相同量的乙酸溶液、乙酸锌溶液和亚铁 氰化钾溶液，按同一方法做试剂空白试验。 2、标准曲线的绘制 精密吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mL 抗坏血酸标准使用溶液（相当于抗坏血酸0，10.0，20.0， 40.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0g），分别置于 10mL比色管中。各加0.3mL乙二胺四乙酸二钠溶液（ 0.25mol/L）、0.5mL乙酸溶液（0.5mol/L）、1.25mL固蓝盐 B溶液（2g/L），加水稀释至刻度，混匀。室温（20 25）下放置20min后，移入1cm比色皿内，以零管为参比 ，于波长420nm处测量吸光度，以标准各点吸光度绘制标准 曲线。 3、试样测定 非蛋白性试样的测定：精密吸取按上述非蛋白性食 品制备的试样溶液0.5mL5.0mL（约相当于抗坏血酸 200g以下）于10mL比色管内。以下按标准曲线的绘制自 “加0.3mL乙二胺四乙酸二钠溶液0.25mol/L）”起依法 操作。试样吸光度从标准曲线上查出抗坏血酸含量。 蛋白性试样的测定：精密吸取按上述蛋白性食品制备 的试样溶液（约相当于抗坏血酸200g以下）和等量试剂空 白溶液（0.5mL5.0mL），各于10mL比色管内。各加 1.5mL乙二胺四乙酸二钠溶液（0.25mol/L），1.0mL乙酸溶 液（0.5mol/L），1.25mL固蓝盐B溶液（2g/L），加水稀释 至刻度，混匀。室温（2025）下放置3min后，移入 1cm比色皿内，以试剂空白管为参比，于波长420nm处测量 吸光度。试样吸光度从标准曲线上查出抗坏血酸含量。 （五）结果计算 式中: X试样中抗坏血酸的含量，mg/100g（mg/100mL）； c试样测定液中抗坏血酸的含量，g； m试样质量（体积），g（mL）； V2试样处理液总体积，mL； V1测定时所取溶液体积，mL。 （六）说明 本法适用于各类食品中还原型抗坏血酸的测定。该法具 有灵敏度高、准确度好、操作简便、快速、应用范围广等 特点。但不适用于脱氢型抗坏血酸的测定。 10-3 维生素A的测定 一、维生素A的结构和性质 维生素A（vitamin A）又称视黄醇（其醛衍生物视黄醛 ）是一个具有酯环的不饱和一元醇，包括维生素A1、A2 两种 （维生素A1和A2 结构相似），属脂溶性维生素。 维生素A只存在于动物性食物中，A1主要存在于哺乳动 物及咸水鱼的肝脏中；A2主要存在于淡水鱼的肝脏中。植物 组织中尚未发现维生素A。人体缺乏维生素A，影响暗适应 能力，如儿童发育不良、皮肤干燥、干眼病、夜盲症等。 视黄醇可由植物来源的-胡萝卜素合成，在体内-胡萝卜 素-15，15-双氧酶（双加氧酶）催化下，可将-胡萝卜素转 变为两分子的视黄醛，视黄醛在视黄醛还原酶的作用下还原 为视黄醇。故-胡萝卜素也称为维生素A 原。 富含维生素A的食物有两类： 一是维生素A原，即各种胡萝卜素，存在于植物性食物中 ，如绿叶菜类、黄色菜类以及水果类，含量较丰富的有菠菜 、苜蓿、豌豆苗、红心甜薯、胡萝卜、青椒、南瓜等； 另一类是来自于动物性食物的维生素A，这一类是能够直 接被人体利用的维生素A，主要存在于动物肝脏、奶及奶制 品（未脱脂奶）及禽蛋中。 维生素A性质： 1. 溶解性：不溶于水，易溶于 有机溶剂。 2. 稳定性：易被氧化剂氧化，易 被紫外光裂解。在缺氧情况下， 对热较稳定，对光特别敏感。维 生素A对碱稳定。 3. 紫外吸收特性：在紫外光区有强吸收，可用于鉴别和 含量测定。 4. 与三氯化锑呈色：维生素A在氯仿溶液中与三氯化锑试 剂作用，产生不稳定的蓝色。 二、维生素A的提取 1. 试样用有机溶剂萃取脂类 试样可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采 用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果试 样中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。 脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50% KOH、无 水甲醚、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分 不皂化物。 2. 脂类的皂化 皂化温度与时间：70、30min。 3. 提取 皂化后经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。 4. 柱层析分离 采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把-胡萝卜素也 洗脱下来，那么这时维生素A与-胡萝卜素就是一个混合物 ，还要将它们分离开。如果试样中只有维生素A而不含-胡 萝卜素时，这时可直接定容。 5. 维生素A与-胡萝卜素分离 吸附剂： 8份中性Al2O3和2份碱性Al2O3混合，装柱分离方 法：用2%丙酮石油醚洗-胡萝卜素；用乙醚洗VA。 三、维生素A的测定比色法 （一）原理 维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝 色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。 该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计 于620nm波长处测定其吸光度。 （二）试剂 1、无水硫酸钠 2、乙酸酐 3、乙醚 4、无水乙醇 5、三氯甲烷 6、三氯化锑三氯甲烷溶液(250g/L)：用三氯甲烷配 制三氯化锑溶液，储于棕色瓶中。 7、酚酞指示剂(10g/L) 8、维生素A或视黄醇乙酸酯标准液 （1）配制：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%) 经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使 其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光 光度法标定其准确浓度。 （2）维生素A标准浓度的标定：取维生素A标准液 10.00L，用乙醇稀释至3.00mL，在325nm波长处测定其 吸光度值。用比吸光系数计算出维生素A的浓度。 式中： X维生素A的浓度； 维生素A的平均紫外吸光值； 1835维生素A（1）比吸光系数； K标准稀释倍数 （三）仪器 1、实验室常用仪器 2、分光光度计。 3、回流冷凝装置。 1、试样处理（根据试样性质，可采用皂化法或研磨法） （四）分析步骤 维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行 ，或用棕色玻璃仪器。 （1）皂化法：适用于维生素A含量不高的试样，可减少 脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生 素A损失。 皂化：根据试样中维生素A含量的不同，准确称取 0.5g5g试样于三角瓶（磨口与冷凝器连接）中，加入 10mL氢氧化钾及2040mL乙醇，于电热板上回流30min 至皂化完全为止。 脂类物质水溶性物质。 VA与脂类物质可根据其溶 解性分开。 提取：将皂化瓶（即以上的三角瓶）内混合物移至分液漏斗 中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。用50mL乙醚分二次 洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层（ 醚层在上，水层在下）后，水层（含皂化物）放入第二个分液漏斗 内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液 漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层（含VA ）与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止 (第二个 分液漏斗中的醚层不再使三氯化锑氯仿液呈蓝色) 。 试样中的VA全部进入第一个分液漏斗中。 洗涤：用约30ml水，加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇 ，静置片刻后，放去水层。加1520mL 0.5mol/L 氢氧化钾溶 液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性 酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞 指示剂呈无色为止(大约3次)。醚层液静置1020min，小心放 出析出的水。 进一步除去脂肪等杂质，净化醚层中的VA。 浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用 约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶 内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下 ，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中 维生素A含量在适宜浓度范围内。 （2）研磨法：适用于每克试样维生素A含量大于5g 10g试样的测定，如动物肝的检测。步骤简单、省时、 结果准确。 研磨：精确称取2g5g试样，放入盛有35倍试样质 量的无水硫酸钠研钵中，研磨至试样中水分被完全吸收，并 均质化。 提取：小心地将全部均质化试样移入具塞三角瓶内。 精确加入50mL100mL乙醚，紧压塞子，用力振摇2min， 使试样中维生素A溶于乙醚中，使其自行澄清 (大约需1h 2h)，或离心澄清 。 浓缩：取澄清乙醚液2mL5mL，放入比色管中，在 7080水浴上抽气蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解残 渣。 2、标准曲线测定 准确吸取维生素A标准液0.00、0.10mL、0.20mL、 0.30mL、0.40 mL、0.50mL于6个10mL棕色容量瓶中，以三 氯甲烷定容，得标准系列使用液。 再取相同数量的3cm比色皿顺次移入标准系列使用液各 1mL，每个比色皿中加乙酸酐一滴，制成标准比色列。于 620nm波长处，以10mL三氯甲烷加1滴乙酸酐调节吸光度至 零点，将标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯 化锑-氯仿溶液，于6s内测定吸光度，绘制标准曲线。 3、试样测定 取2个3cm比色皿，分别加入1mL三氯甲烷 (试样空白液) 和1mL样液，各加1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线绘制。 （五）结果计算 式中： X试样中维生素A的含量，mg/100g； C由标准曲线上查得试样中维生素A的含量，g/ mL； V提取后用三氯甲烷定容之体积，mL； m试样质量，g。 100以每100g试样计。 四、紫外分光光度法 VA为脂溶性的，测定VA时必须先将试样中的脂肪抽 提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂 质等干扰物质，维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有 最大吸收峰，且其吸光度值与维生素A含量成正比。 1、原理 2、仪器 紫外分光光度计 3、试剂 （1）维生素A标准溶液（40 IU/mL ） （2）异丙醇 4、操作方法 （1）标准曲线的绘制 分别吸取维生素A标准溶液（40 IU/mL）0.5mL、1.0mL、 1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL于10mL棕色容量瓶 中，以异丙醇定容。于紫外分光光度计325nm处测定吸光度， 并绘制标准曲线。 （2）试样的测定 提取皂化层析-胡萝卜素和VA 以石油醚为空白，准确称取适量试样，加异丙醇定容， 于紫外分光光度计325nm处测吸光度。 5、计算 式中：X试样中维生素A的含量，IU/100g； C由标准曲线查得维生素A的含量，IU/ mL； V试样加入异丙醇定容的体积，mL； m试样质量，g。 紫外分光光度法操作简便，灵敏度较比色法高，可测 定维生素含量低于5g/g的食品。但由于在维生素A的最大 吸收波长325nm附近许多其它化合物也有吸收，干扰其测 定。故本法多适用于透明鱼油、维生素A浓缩产物等纯度 较高的试样。 6、说明 10-4 食品中胡萝卜素的测定 GB/T 5009.83-2003 食品中胡萝卜素的测定 一、概述 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色 素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分 子结构中含有-紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变 为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中 以-胡萝卜素效价最高。 二、胡萝卜素的性质和提取 胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中 的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维