lrp16基因启动子活性分析(1)

LRP16LRP16 基因启动子活性分析基因启动子活性分析(1)(1) 作者：卢学春，楼方定，韩为东，朱旭东， 母义明，徐周敏，于力 【摘要】本研究的目的在于分析 LRP16 基因不同启动 子区域的活性，为深入研究 LRP16 基因的表达调控机制奠 定基础。在 NCBI 的人类基因组数据库中截取并下载 LRP16 基因转录起始位点 5侧翼区 kb 的基因组序列，设计 PCR 引物，从健康外周血单个核细胞中克隆和亚克隆了 LRP16 基因的启动子分子，对各个长度相差 400bp 左右的亚克隆 启动子片段调控荧光素酶表达的作用强度进行比较分析。 结果获得了与 GeneBank 序列一致、长度为 kb 的 LRP16 基 因启动子 DNA 序列，其主要调控序列在 LRP16 基因转录起 始位点 5侧翼区的-200 至-600bp。结论：LRP16 基因启动 子是一个典型的型启动子，其启动子活性在-200 至- 600bp 区域最强。 【关键词】基因表达 AnalysisofLRP16GenePromoterActivity AbstractThestudywasaimedtoanalyzethecharacteristics ofLRP16genepromoteranditsactivityinordertoexploreth epossibleregulationmechanismofLRP16geneexpression.A kbgenomicDNAsequenceofLRP165- endwasobtainedfromNCBIbyBLASTsoftware.The7targetseq uencesbetweenkbfromahealthyblooddonorDNAsamplewerea mplifiedbyPCR，thenidentifiedbyDNAsequencingandsemi -nestPCR.Theverifiedsequenceswereanalyzedon- line.Theresultsshowedthatthe7targetsequenceswereabo ut400bpdifferentfromeachother.All7sequenceswerethes ametotheseGenBankdescribed.Atlast，all7promotersequ enceswereligatedwithluciferasevector，andthentheluc iferaseactivitywasanalyzedinHeLacells.Aknowngenepro motersequencecanbefreelyobtainedfromNCBIdatabase.It isconcludedthatLRP16promoterisastandardtypepromot eranditsactivityisstrongestintheregionfrom-200to- 600bp. KeywordsLRP16gene；promoter；geneexpression LRP16 基因是于力等利用限制性酶切基因扫描 （restrictionlandmarkgenomicscanning，RLGS）和 cDNA 末端快速扩增技术克隆到的一条白血病相关基因1-3 。 该基因定位于第 11 号染色体长臂 11 区，其编码的基因翻 译产物是一种核蛋白。此外通过 SAGE（serialanalysisofgeneexpression）数据库分析还 发现，LRP16 基因在多种性激素相关的肿瘤中均有高表达 4 ，提示 LRP16 基因与肿瘤发生密切相关。通过在乳腺 癌细胞系中的研究发现，LRP16 基因是一个雌激素受体 调控的下游基因5 ，作为进一步研究 LRP16 基因表达调 控、活性及其生物学作用的前期工作，我们克隆了 LRP16 基因启动子，并对 LRP16 基因启动子区域近 kb 的 DNA 序列 进行了分析。 材料和方法 主要试剂与仪器 FPROGO2D 型 PCR 仪（TechnolCambridgeLtd.公司产品） 。 质粒提取试剂盒 （WizardPlusMiniprepsDNAPurificationSystem 产品） ， PCR 产物回收试剂盒 （WizardPCRPrepsDNAPurificationSystem 产品） ，大肠 杆菌感受态细胞（CompetentCells）和 ITPG 以及 X-Gal 均 为 Promega 公司产品。Tryptone 和 Yeastextract（OXOIDLtd 产品） 。淋巴细胞分离液（天津 TBD 产品） ，LATaq 酶（TaKaRaCo.产品） ，琼脂糖凝胶 （Spanish 产品） 。T4DNA 连接酶，p-GEM- TEasyVector，Superfecttransfectionreagent，TD- 20/20 型 Luminometer 荧光素酶检测仪。 人类基因组 DNA 的提取及引物设计 选用健康献血员的外周血分离单个核细胞，常规方法 提取基因组 DNA，并用 HindIIIDNA 酶切处理。 LRP16 启动子及亚克隆启动子序列钓取及引物设计 LRP16 启动子、亚克隆启动子序列的钓取以 LRP16 基因 cDNA 序列全长作为探针，在 NCBI 的 HumanGenomicDatabase 中利用 Blast 程序进行搜索，下载 并截取 LRP16 基因 5侧翼 kb 基因组 DNA 序列。 引物设计利用 Primer 软件包设计 9 个上游引物和 1 个 下游引物（上海生工生物工程公司合成） ，其中每个亚克隆 启动子的序列长度相差 kb 左右，引物名称和序列如下（括 号内数字表示的是扩增产物长度，英文字母表示酶切位点， 相对应的 PCR 产物分别为 S0-S6）： LRP16 基因启动子-荧光素酶报道重组子的构建 采用上述引物扩增出 7 条 3端平齐，5端不等大小 相差 200bp 左右的启动子和亚克隆启动子 DNA 片段，将此 片段克隆纯化并插入 pGL3-Basic 质粒构建 7 个 LRP16 基因 启动子和亚克隆启动子荧光素酶载体，具体操作方法详见 参考文献6，7 。 启动子及亚克隆启动子荧光素酶活性检测 采用脂质体转染法，用 Superfecttransfectionreagent 将上述构建好的 7 个 LRP16 基因启动子-和亚克隆启动子-荧光素酶报道重组子转 染入 HeLa 细胞，培养 24 小时后，用 TD-20/20 型 Luminometer 荧光素酶检测仪检测细胞内的荧光素酶活性， 以荧光素酶活性的高低作为启动子活性大小的指标。 结果 LRP16 基因启动子及亚克隆启动子序列的钓取 通过上游引物 Pu0 和下游引物 Pd 进行 PCR 扩增之后共 得到 7 条长度相差 kb 左右大小的 PCR 产物，图 1 为 S0- S6PCR 产物结果。 序列检测 结果表明各亚克隆片段与目标序列的理论序列完全一 致，限于文章篇幅以下仅给出 S0 的 DNA 测序结果。S0 长度 为 kb，经用 DNAstar 软件比较，该序列与人类基因组序列 完全一致（图 2） 。 pGL3-S0pGL3-S6 的酶切鉴定 构建好的 7 个质粒 pGL3-S0pGL3-S6 经 Sac和 Hind内切酶酶切以后，产物分别为 1 个相同大小的载体 片段和 7 个大小彼此相差约 200bp 的启动子 DNA 片段，证 实了所构建好的启动子-荧光素酶质粒分别为 7 个大小不等 的亚克隆启动子-荧光素酶载体（图 3） 。 LRP16 基因启动子及亚克隆启动子荧光素酶活性检测 LRP16 基因启动子能够调控荧光素酶的表达，其中 pGL3-S5 的调控作用最强，表明在 ORF 上游-1bp 至-600bp 范围内存在 LRP16 的核心调控序列，对表达起主要调控作 用。除 pGL3-5 和 pGL3-S4 以外，pGL3-S1 是另一个相对活 性较高的亚克隆启动子区域，但与前两者相比 pGL3-S1 的 作用相对比较弱，