mox40ig的表达及其生物学活性的初步研究(1)

mOX40IgmOX40Ig 的表达及其生物学活性的初的表达及其生物学活性的初 步研究步研究(1)(1) 作者：刘艳菲,林志娟,冯永堂,许传武,史琳,苗乃 法 【摘要】 目的:构建mOX40Ig 真核表达载体, 转染 CHO 细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的 mOX40Ig 融合蛋白。方法:RTPCR 法扩增获得 hIgG1Fc 段基因,构建hIgG1Fc 重组质粒并经测序证实。从本室保 存的 pIRES2EGFPmOX40 重组质粒中 PCR 扩增 mOX40 胞 外段,将其插入hIgG1Fc 重组质粒中构建mOX40Ig 真 核表达载体。脂质体法转染 CHO 细胞获得稳定表达,用 RTPCR 与 ELISA 法检测其表达,蛋白 A 亲和纯化后, SDSPAGE 进行鉴定。3HTdR 掺入法研究 OX40 信号对 B 细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实 hIgG1Fc 段、 mOX40 胞外段及 mOX40Ig 基因序列正确,RTPCR 与 ELISA 证实 mOX40Ig 的表达,SDSPAGE 证实其为 mOX40Ig 融 合蛋白,3HTdR 掺入法显示 mOX40Ig 在体外能有效地促 进 B 细胞增殖。结论:成功地构建mOX40Ig 真核表达载 体,并获得有生物学活性的 mOX40Ig 融合蛋白的稳定表达,为 进一步开展 OX40 相关领域的横向应用研究奠定了基础。 【关键词】 OX40mOX40IgCHO 细胞真核表达 Abstract AIM:Toconstructarecombinanteukaryoticexp ressionvectorcontainingmOX40Igfusiongeneandobta inmOX40Igfusionproteinwithbioactivitybytransfecti ngCHOcells.METHODS:ThegenefragmentencodingthehumanI gG1FcwasamplifiedbyRTPCRandtheeukaryoticexpressio nvectorhIgG1Fcwasconstructed.Aftersequencing,mOX4 0extracellulargenewasclonedfrompIRES2EGFPOX40by PCRandtheninsertedintotherecombinantvectorhIgG1Fc.T herightrecombinantwastransfectedintoCHOcellswithlip ofectinRagentanditsexpressionwasdetectedbyRTPCRan dsandwichELISA.AfterpurifiedbyproteinAaffinitycol umnchromatography,themOX40Igfusionprotein wasiden tifiedbySDSPAGEanditseffectontheproliferationofBc ellsinvitrowasstudiedby3HTdRmethod.RESULTS:ThehIg G1Fc,mOX40extracellulargeneandmOX40Iggenewerecons istentwithDNAexpressionofmOX40IgfusionproteininCH OcellswasconfirmedbyRTPCR,sandwichELISAandSDS PAGE.3HTdRanalysisshowedthemOX40Igfusionprotein stimulatedtheproliferationofBcellsinvitro.CONCLUSIO N:AeukaryoticexpressionvectorcontainingmOX40Igh asbeenconstructedsuccessfullyandthestableexpression ofmOX40Igfusionproteinwithbioactivityhasbeenacqui red,whichlaysasolidbasisforfurtherstudyoftheapplica tionrelatedtoOX40. KeywordsOX40;mOX40Ig;CHOcellline;eukaryoticexpr ession OX40/OX40L 作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激 分子,对延长 T 细胞的寿命、促进其增殖1,2、刺激 DC 细 胞的分化成熟3、促进生发中心的形成均有重要的作用4。 本研究我们通过构建mOX40Ig 真核表达载体,将其转染 CHO 细胞,获得可溶性 mOX40Ig 融合蛋白的稳定表达,并进 行初步的鉴定和生物学活性检测,为进一步研究 OX40 分子 在肿瘤免疫、自身免疫性疾病中的作用奠定基础。 1 材料和方法 材料 TRIzol 购自 Gibco 公司;MMLV 第 1 链 cDNA 合成 试剂盒、TaqDNA 聚合酶、各种限制性内切酶及 T4 连接酶均 购自 MBI 公司;Agarose（西班牙分装）购自上海生工公司; LipofectinReagent 购自 Invitrogen 公司。胎牛血清购自 杭州四季青公司。G418 购自北京华美公司。蛋白 A 亲和层 析柱购自本元正阳公司。羊抗人 IgG、正常人 IgG、HRP 标 记鼠抗人 IgGFc 购自宁波新芝生物公司。小鼠 mIgM 激发型 抗体及抗 CD40 激发型单克隆抗体购自 R 筛选阳性克隆经质粒 PCR、限制性酶谱分析及测序分析确证。 PCR 法扩增小鼠 OX40 胞外段 以本室构建鉴定并保存 的 pIRES2EGFPOX40 重组质粒为模板,以 P3、P4 为上下 游引物扩增小鼠 OX40 胞外段基因,反应条件为:95预变性 5min 后,94变性 55s,55退火 1min,72延伸 1min,为 1 个循环,共 30 个循环,最后再于 72延伸 10min。 真核表达载体mOX40Ig 的构建 小鼠 OX40 胞外段 PCR 产物纯化后与测序正确的hIgG1Fc 重组质粒分别用 BamHI 和 EcoRI 进行双酶切,37,4h 后置 65灭活 20min,16连接过夜,转化感受态 DH5 菌株,筛选阳性 克隆即重组真核表达载体mOX40Ig;重组质粒分别经质 粒 PCR、限制性酶谱分析及测序分析证实。 表达 mOX40Ig 的 CHO 细胞株的构建及稳定转染 将 mOX40Ig 重组质粒以脂质体法转染 96 孔板中已 70%80%融合的 CHO 细胞。转染 48h 后,置于含 G418 的选 择培养液中,筛选培养 2 周后再用有限稀释法挑取阳性克隆。 RTPCR 检测外源 OX40IgmRNA 的表达 收集 G418 抗 性细胞,TRIzol 法抽提总 RNA,逆转录获得 cDNA 后分别以 P3+P4、P3+P2、P1+P2 为上下游引物进行 PCR 扩增,琼脂糖 电泳测定扩增产物。 夹心 ELISA 法检测上清中 mOX40Ig 融合蛋白的表达 用 10mg/L 的羊抗人 IgG 包被酶标板,酶标抗体为 HRP 标记 鼠抗人 IgGFcmAb,同时以正常人 IgG 为阳性对照,以转染有 空载体的细胞培养上清为阴性对照。 蛋白 A 亲和层析柱纯化及纯化蛋白的鉴定 样品的纯 化按说明书进行。SDSPAGE 完毕后以考马斯亮蓝 G250 染 液染色,鉴定纯化后 mOX40Ig 融合蛋白的分子量。 小鼠 B 淋巴细胞的制备 小鼠眼球放血处死,无菌取脾 脏,移入滤网中研磨,用 Ficoll 分离单个核细胞。PBS 洗后, 贴壁 2h 去除贴壁细胞,吸出富集的 B 细胞备用。 淋巴细胞增殖试验 将反应 B 细胞按 1105 个/孔的 浓度加到预先用抗小鼠 mIgM 激发型抗体（1mg/L）包被的 96 孔板中,同时加入或不加入抗小鼠 CD40 激发型抗体 （1g/L） 。培养 2d 后,分别加入 110、120、140 倍比 稀释的纯化 mOX40Ig,同时设阴性对照（不同浓度的人 IgG）,空白对照（含 100mL/LFCS 的 RPMI1640 培养液）,每 组设 5 个复孔。在 37、50mL/LCO2 培养箱中共培养 2d,加 入 3HTdR,于 37共育 16h。将细胞收集于 24nm 玻璃纤维 纸片上,使用 液体闪烁计数器测定每个样品的 cpm 值。 统计学处理 采用软件对数据进行单因素方差分析和 多元方差分析。 2 结果 hIgG1Fc 段基因的扩增及重组载体hIgG1Fc 的构建 RTPCR 法从正常人外周血单个核细胞中扩增出约 650bp 的 hIgG1Fc 段基因（图 1）,重组载体经 PCR、限制性酶谱 分析后（图 2）进行 DNA 测序。结果显示,所获得的 hIgG1Fc 段基因序列与 GenBank 中报道的序列完全一致。