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肝脏蛋白的提取 和浓度测定 医学基础实验室 实验目的实验目的 了解并掌握 蛋白质的提 取方法 了解掌握考 马斯亮蓝法 （Braford法 ）测定蛋白 质含量的原 理和方法 实验内容 实验目的 肝脏组织蛋白肝脏组织蛋白 的提取的提取 蛋白的浓度测蛋白的浓度测 定定 原理： RIPA裂解液是一种传统的细胞 组织快速裂解液，主要裂解成分含 1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠 （sodium deoxycholate）, 0.1% SDS，得到的蛋白样品可以用于常规 的Western。 1.肝脏组织的提取 操作 步骤 超声匀浆 冰上放置 4度离心 吸取上清 1.肝脏组织的提取 组织取材 1.肝脏组织的提取 （1）组织取材： 取约100mg大 鼠肝脏组织，用灭 菌的剪刀将组织块 尽量剪碎，放入 1.5ml 灭菌的EP管 中 1.肝脏组织的提取 （2）超声匀浆： 加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次 1.肝脏组织的提取 （3）冰上放置： 裂解完全后，冰 上放置30分钟 1.肝脏组织的提取 （4）4度离心： 放入离心机中， 4 12000rpm离心 5min 1.肝脏组织的提取 （5）吸取上清： 取上清分装于 0.2ml离心管中并置 于20保存，待 用 超声匀浆 要保持低温 超声强度 以不产生泡沫 为准 注意 事项 2.蛋白的浓度测定 l考马斯亮蓝法 lBCA法 l紫外吸收法 lLowry法(Folin-酚试剂法) l双缩脲法 2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（ Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种 结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰 在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大 吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。 15 实验步骤实验步骤 空白管 标准管 测定管 0 1 2 3 4 5 6 1mg/mL牛血清 白蛋白溶液 蒸馏水 待测样品 考马斯亮蓝 G250 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 5 5 5 5 5 5 5 管号 试剂(ml) 1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂: 2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管 调零，测定各管吸光度值。 16 以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值 为纵坐标绘制标准曲线。 C（蛋白浓度） A（吸光度） Ax cx 绘制标准曲线： 0.2 0.4 0.
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