elisa检测p24抗原用于诊断hiv感染的研究现状(1)

ELISAELISA 检测检测 p24p24 抗原用于诊断抗原用于诊断 HIVHIV 感染感染 的研究现状的研究现状(1)(1) 关键词ELISA；p24；HIV 1HIV 感染实验诊断 的研究概况 HIV 主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来， 欠发达国家的感染人数超过发达国家。预计到 XX 年我国感 染 HIV 的人数将超过 1000 万。目前测定血清 HIV 抗体是诊 断 HIV 感染的常规实验方法，但是测定 HIV 抗体有局限性： 有超过 70%的 HIV 感染者在感染 6 个月后才能检测出抗体， 在同性恋群体，这个数字超过 80%，检测技术增加了 HIV“窗口期”传播的危险1 ；新生儿产生抗体需要出生 1 年后，来自母亲的 HIV 抗体会致使假阳性产生；HIV 抗体 持续存在，艾滋病晚期时消失，无法作为治疗监测的稳定 指标。 2p24 的来源和实验价值 24kDa 的蛋白质 p24 是 HIV 病毒颗粒的主要结构蛋 白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24 蛋白的氨 基酸序列在 HIV 各毒株之间高度保守，缺失 p24 会导致病 毒无法正常组装。衣壳蛋白 p24 特异性很强，与多数其他 逆转录病毒无交叉反应，可以用于 HIV 感染的早期诊断， 抗 HIV 药物疗效的检测及 HIV 感染者发展为艾滋病的动态 观察。HIV1 感染机体后,感染者血液中最早出现的是病毒 gag 基因表达产物 p24 抗原,然后才出现相应的特异性抗 HIV 抗体,以后随抗体滴度的升高 p24 抗原含量呈逐渐下降 的趋势,以至检测不出。在病情发展后期,病毒大量复制,机 体免疫力下降,所产生的抗体不足以中和病毒抗原时,p24 抗 原在血中又可测出。HIV 阳性母亲所生育的婴儿 30%可能已 受到感染,但由于婴儿体内母源性抗 HIV 抗体可持续 13 个 月21 个月之久,常规检测抗 HIV 抗体不适用于婴儿,而 p24 抗原的检测则可弥补这一不足。 3p24 抗原用于 HIV 感染的诊断 HIV1 和 HIV2 的 p24 抗原不同，但有轻微的交 叉反应。因 HIV2 主要局限于西部非洲，目前 p24 抗原的 研究主要针对 HIV1 感染。SchpbachJ 比较 245 份 HIV1 感染成人不同阶段的血样，发现血浆中 p24 抗原浓 度高于血清2 ，因此建议检测血浆中 p24 抗原。p24 抗原 测定主要存在的问题：机体产生针对 p24 的抗体，抗原抗 体结合形成免疫复合物。感染初期，随着抗体大量产生， 免疫复合物形成，游离 p24 抗原减少，致使 ELISA 测定 p24 抗原得出假阴性结果。为提高 p24 检测 HIV 感染的敏感度， 在检测之前需要将抗原抗体复合物分开。将抗原从免疫复 合物上分开主要通过加热和酸碱中和。酶标记抗原斑点试 验（EnzymeLabelledAntigenSpotTest,ELAST）能显著提高 ELISA 实验的敏感度和特异度。 实验步骤患者血浆用%三硝基甲苯稀释至 16 比 例后 100加热 5min。已知浓度 0pg/ml、pg/ml、1pg/ml、pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg /ml、80pg/ml 的 p24 抗原作为对照同时操作。所有标本 （100l/份）加入微孔中 37孵育 60min 后，用稀释的磷 酸盐缓冲液（PBS）洗板后，加入 100l 用辣根过氧化物 酶（HRP）标记的抗 p24 抗体，再 37孵育 60min。洗板后， 来自 ELASTELISA 系统的 100l 生物素酪胺加入微孔中， 室温下孵育 60min。再次洗板后，来自 ELASTELISA 系统的 链霉素辣根过氧化物酶用 1%小牛血清PBS吐温 20ml 溶 液稀释至 1500，取 100l 加入每个孔中，室温下孵育 30min 后洗板。100l 四甲基联苯胺底物加入微孔中，室 温下孵育 30min。然后加入 100l1mol/L 的硫酸终止显色 反应。15min 内 450nm 测定吸光度，当吸光度时被认为是 阳性3 。 敏感度和特异度 SutthentR 等发现采取 ELASTELISA 方法测定血浆 p24 的线性范围是 pg/ml80pg/ml。针对新生儿感染 HIV 的检测，p24 检测的 敏感度与 HIV1RNA 检测的敏感度相同，高于检测 HIV1DNA（%） ，三种方法的特异度都可达 100%3 。 SchupbachJ 等研究 390 例 HIV 感染母亲生产的婴儿，发现 经过中和抗体，p24 检测的特异度可达 100%，在 125 例感 染 HIV 的儿童中，p24 检测敏感度可达 97%高于 PCR 检测 HIVDNA（96%）和病毒培养结果（77%） 。普通采用免疫复合 物分离技术测定 p24 抗原的方法敏感度低，而且只能检出 50%没有症状的 HIV 患者。如今已有商品化试剂盒 （bioMerieux）采用 ELASTELISA 方法检测 p24 抗原，其敏 感度和特异度能和 PCR 检测 HIV1RNA 相媲美。 4 检测 p24 抗原的方法临床价值评判 p24 抗原用于 HIV1 的早期诊断成人 HIV 感染至 抗体阳转需要 6 个月时间1 。p24 抗原在感染早期，病毒 大量复制而抗体产生很少时就能被检测出来4 。通过检 测血浆 p24 抗原，可以将“窗口期”减短至 20d，此时抗体 尚为阴性5，6 。因此对献血员进行 p24 抗原筛查很有必 要性。美国 FDA 已规定,自 1995 年 8 月起,所有全血、成分 血、白细胞和原料血浆的献血员,在献血前必须进行 HIV1 抗原的筛选。HIV 感染母亲是所生育的新生儿中 30% 会感染 HIV。检测脐带血和新生儿血浆中的 p24 抗原可判断 新生儿感染 HIV 是先天性还是在产道中感染所致。感染 HIV 新生儿早期使用齐多夫定（zidovudin）可降低 HIV 母婴传 播的危险率7 。 p24 抗原用于 HIV 治疗的监测目前主要是把血液中 HIV1RNA 的数量作为何时开始治疗以及治疗是否有效的标 志。因 p24 抗原感染后 20d 即可从血浆中检测出来，并且 伴随抗病毒治疗，血液循环中的 p24 抗原的量会减少。采 用 ELASTELISA 测定 p24 抗原的方法，最低可检测到 pg/ml 的浓度，相当于每毫升有 100 个病毒，而 HIV1RNA 检测 正常低限是小于 400 拷贝/ml。故 ELASTELISA 测 p24 抗原 的阈值小于测定 HIV1RNA，并且两种方法的敏感度和特异 度都相同。相比之下，p24 抗原更适合作为治疗何时开始以 及治疗是否有效的标志物。美国艾滋病临床实验组认为， 血浆 p24 浓度下降一半表明抗病毒治疗有效，p24 浓度持续 升高表明缺乏有效治疗2 。 5 前景与问题 目前临床可以用于检测 HIV 感染，并监测疾病进 展的方法有：HIV 抗体检测、p24 抗原检测、HIV 核酸检测 以及 T 淋巴细胞计数。总的来说 ELISA 检测抗体和 p24 抗 原的方法是比较经济，省时，同时也比较节省人力资源的。 由于献血者需要同时作 HIV 抗体和 p24 抗原检测，比较费 时，国外已有第四代 HIV1 抗体/HIV2 抗体/p24 抗原联 合检测 HIV 的商品试剂盒。两项检测同时进行，大大减少 了时间，尤其适用于大标本量的筛查。HIV 病毒致病机制主 要是蛋白的作用，而非 RNA，所以检测 p24 抗原能比检测 HIVRNA 直观地预测爱滋病进展。ELASTELISA 测定血浆 p24 抗原作为一种操作简单、经济、省时高效的实验方法，具 有良好的敏感度和特异度，检测阈值较 HIV1RNA 检测还 低。可以作为抗体阴性的疑似 HIV 感染者的检测，献血者 的筛查，HIV 感染母亲生产婴儿的检测以及决定何时开始治 疗和抗病毒治疗是否有效的监测指标。主要存在的问题： 现在对于 p24 抗原的研究集中于 B 亚型，Bonard 等研究发 现在非洲 HIV1CRF02_AG 株感染患者中，当 RNA 水平低于 5log10copies/ml 时，p24 抗原和 HIV1RNA 的相关性很低 （r=） 。