微生物检验59955ppt课件

第二章 生理生化试验 一、生理生化试验的概念 及其类型 二、常见的生理生化试验 一、生理生化试验的概念及其类型 （一）定义 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的 代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、 属种的试验。 （二）设计原则 在试验中加入某些 化学物 质，使细菌代谢 途径中分解代谢产物与加入的化 学物质发生反应， 产生某些变化或出现某种特征。 （三） 生理生化试验的类型 1 .糖（醇）类代谢试验 2 .氨基酸和蛋白质代谢试验 3 .有机酸盐和铵盐的利用试验 4 .呼吸酶类试验 5 .毒性酶类试验 （四）生理生化试验的方法 1. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产 物所生成的颜色反应。 2. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 3. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌 的生长情况。 4. 在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培 养后,观察培养基的pH值变化。 （五）生理生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多 为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌 落分别进行试验。 （一）过氧化氢酶及过氧化物酶试验原理 1、2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 阳性：气体产生 2、过氧化物酶： RH2+H2O2 过氧化物酶 R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色； 阴性： 不变色。 二、常见生理生化试验 阳性阴性 （二）细胞色素氧化酶试验原理 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + -奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性 阴性：无变化。 阳性阴性 二、常见生理生化试验 阳性： 不抑菌， 变混浊 阴性：抑菌 （三）氰化钾试验 二、常见生理生化试验 （四）硝酸盐还原试验原理 KNO3 还原酶 KNO2 KNO2+对氨基苯磺酸+ -萘胺 红色化合物 （立刻或数分钟内） （五）糖发酵试验 分解糖产酸，PH值下降，使培 养基的酸碱指示剂发生变化。 阳性：产酸产气 阴性 阳性阴性 阳性 二、常见生理生化试验 （六）氧化发酵试验（O/F试验） 有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细菌称为氧化型； 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。 阳性阴性 灭菌琼脂（厌氧） 二、常见生理生化试验 （七）甲基红（MR）试验和V-P试验 1、MR试验原理： 一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙 酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和 琥珀酸而使培养基的PH值下降到4.5以下， 加入甲基红指示剂出现红色反应 2、V-P试验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一 步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在 碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二 酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸 的胍基发生反应生成红色化合物。（试验结 果同MR试验） 阴性 阳性 二、常见生理生化试验 （八 ）柠檬酸盐（枸橼酸盐）试验 一些微生物可以以铵盐作为唯一的 氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠 檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成 碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂 变色。 （九）丙二酸钠试验 一些微生物可以以丙二酸钠作为唯 一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培 养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 阴性阳性 二、常见生理生化试验 阴性阳性 （十）马尿酸盐试验 一些细菌可以水解马尿酸生成 苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应 生成有色的苯甲酸盐沉淀。 （十一）葡萄糖铵试验 有些细菌可利用铵盐作为唯一 氮源，并分解葡萄糖产酸，酸碱指示 剂变色，培养基变黄 阳性 二、常见生理生化试验 阳性阴性 （十二）明胶液化试验 一些细菌可产生胞外酶，使 明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶 的凝固能力。 （十三）苯丙氨酸脱氨酶试验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶 ，可以脱氨 生成苯丙酮酸，其与 FeCl3反应产生绿色 。 二、常见生理生化试验 阳性阴性 阳性 阴性 （十四）氨基酸脱羧酶试验 一些细菌可以产生氨基酸脱羧酶 使氨基酸脱羧， 产生胺类物质，使培养基变碱，酸 碱指示剂变色。 （十五）尿素试验 一些细菌可以产生尿素酶，使尿 素分解产生大量的氨，使培养基变 碱，培养基指示剂变色。 阳性阴性 阳性 二、常见生理生化试验 阴性 对照 （十六）靛基质试验（吲哚试验） 一些细菌可以分解蛋白胨的色氨 酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基 苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。 （十七 ）ONPG试验（ 检测-半乳 糖苷酶） 邻硝基酚-D半乳糖苷 -半乳糖苷酶 邻硝基酚+ -D半乳糖 阳性对照 阳性 二、常见生理生化试验 阴性 （十八）淀粉酶试验 一些细菌可产生淀粉酶将淀粉 分解为双糖或单糖，加入碘不变色。 （十九）卵磷脂酶试验 一些细菌产生卵磷脂酶，可以 分解卵磷脂产生甘油脂和水溶性的磷 酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色 的沉淀或浑浊带。 接种菌，可 产生淀粉酶 透明圈 乳白色 浑浊带 二、常见生理生化试验 （十九）脱氢酶试验 微生物有脱氢酶，可使氯化 三苯四氮唑（TTC)还原，由无色变 为红色。 （二十）硫化氢试验 一些微生物分解含硫氨基 酸（胱氨酸或半胱氨酸），产生硫 化氢硫化氢与二价铁盐或铅盐生成 黑色沉淀，使培养基变黑。 阳性 二、常见生理生化试验 （二十一）动力学试验 有鞭毛的细菌在半固体 培养基中除了沿穿刺线生长外 ，在穿刺线周围可见到羽毛状 或云雾状浑浊生长。 二、常见生理生化试验 阳性阴性 （二十二）三糖铁试验 1、培养基主要成分： 牛肉膏、蛋白胨（氮源） 三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1% 硫酸亚铁 琼脂 培养基摆成高层斜面 pH值调到7.4 黄 pH7 2、接种（1）斜面划线接种 （2）穿刺接种 36oC培养18-24小时 二、常见生理生化试验 3、观察结果 （1）乳糖、蔗糖中，至少分解其中的一种， 则： 斜面：产酸显黄色（阳性） 底层：产酸显黄色（阳性） （ 2 ）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖，则 ： 斜面：产碱显红色 （阴性） 底层：产酸显黄色 （阳性） （3）三种糖均不能分解，则： 斜面：产碱显红色 （阴性） 底层：产碱显红色 （阴性） （4）分解含硫氨基酸 产硫化氢，则 硫化氢与Fe 2+生成黑色沉淀（FeS），培养 基变黑 （5）分解糖类产气，培养基中有气泡。 二、常见生理生化试验 第一节 细菌菌落总数测定 第二节 大肠菌群检验 第五章 卫生指标菌检 验 一、定义 （一）定义 菌落总数（aerobic plate count）是指食品检样经过处理， 在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH 、需氧性质等），所得1g（或1mL）检样中形成菌落的总数。 实际上只包括在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌 或兼性厌氧菌。 （二）卫生意义 1.可作为判定食品被污染程度的标志； 2. 可用来观察细菌在食品中繁殖的动态； 3. 为食品进行卫生学评价提供依据。 第一节 菌落总数测定 二、原理 样品经稀释后，使样品悬液中的微生物分散存在， 接种一定量到培养基中，充分混匀。从理论上来说微生 物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼 可见的菌落，计算菌落数可推出菌体数。 第一节 菌落总数测定 五、稀释度选择方法 （一）根据食品卫生标准选择 1.使平板上菌落数落为30300cfu； 2.若落不到30300cfu，尽量接近30cfu或 300cfu； 3.使平板上菌落数宁多不少 （二）根据对样品污染程度的估计 第一节 菌落总数测定 六、菌落总数测定时的注意事项： 1、固体样品应彻底粉碎； 2、培养基（营养）琼脂必须透明、无杂质； 3、选择好稀释度； 4、培养基温度应在46oC ，不能过烫，否则易把细菌 烫死； 5、培养液中接种菌悬液后，应在20min内接种培养基 ，（时间太长，某些细菌可自动凝集）培养基和菌悬液 必须充分浑匀。 第一节 菌落总数测定 第二节 大肠菌群计数 一、定义 大肠菌群系指一群在36oC 条件下培养48h能发酵乳 糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢 杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指 标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 食品（目前大多数国标规定）中大肠菌群数系以每 100毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示 。 二、选择粪便污染指标菌应具备的条件 1、这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多； 2、在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长； 3、在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和 食品中不能发现； 4、对氯的低抗力与肠道致病菌相似； 5、检验方法比较简单，易于检出。 第二节 大肠菌群数测定 三 、大肠菌群数测定的卫生学意义： 大肠菌群包括：艾希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属 、 克雷伯氏菌属 新鲜粪便中艾希氏菌属占优势。 1、大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又 包括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全保 险系数更大了； 2、测定大肠菌群含量表明食品、饮料被粪便污染的程 度：如果菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间接 表示有肠道致病菌污染的可能性。 第二节 大肠菌群数测定 四、大肠菌群数 测定原理 二步九管法 1.初发酵 培养基：月桂基硫 酸盐胰蛋白胨 2复发酵 培养基：煌绿乳糖 胆盐 培养时间：48h 第二节 大肠菌群数测定 结果处理 现有国家标准的稀释度选择方法 设E为国家标准规定的待检食品大肠菌群指标 1.待检食品为液体食品， 如E3，加样方法为： 原液各10mL分别接种到3管双料LST中，原液各 1mL分别接种到3管单料LST中，10-1稀释液各1mL分别 接种到3管单料LST中； 2.其他所有食品的加样方法为： 10-1稀释液各10mL分别接种到3管双料LST中， 10-1 稀释液各1mL分别接种到3管单料LST中， 10-2稀释液各 1mL分别接种到3管单料LST中； 根据大肠菌群阳性管数, 查MPN检索表，报告每 g (mL)样品中 大肠菌群的MPN值 。 经过和标准起草人沟通，此方法标准的单位可以乘以100，最 终报出MPN/100g(100mL)。 现国标的MPN表与原国标的MPN表的不同点： 1，现表里的数字是有小数点的，而