sars-cov s240蛋白与眼部ace2受体作用机制的研究(1)

SARS-CoVSARS-CoV S240S240 蛋白与眼部蛋白与眼部 ACE2ACE2 受体作受体作 用机制的研究用机制的研究(1)(1) 作者：孙琰，柳林，潘欣，景明 【摘要】目的：研究 SARS 冠状病毒（SARS-CoV）S240 蛋白与眼部功能性受体血管紧张素转化酶 2（ACE2）作用 的机制。方法：构建 SARS-CoVS 蛋白融合基因 pS240- EGFP，并在哺乳动物细胞中表达；半定量 RT-PCR 和免疫组 化鉴定 ACE2 在结膜、角膜中的表达；酶联免疫吸附实验、 流式细胞仪检测法进行 SARS-CoVS240 蛋白与结膜、角膜细 胞的体外结合研究。结果：构建了融合基因 pS240-EGFP； 证实 ACE2 在结膜、角膜有表达；结膜、角膜细胞与 SARS- CoVS240 蛋白能够结合。结论：结膜、角膜中存在 SARS 冠 状病毒的功能性受体，SARS-CoVS240 蛋白与结膜、角膜细 胞能够结合。本研究对了解 SARS 的病理机制及进一步研究 SARS 的防护和治疗具有一定的参考意义。 【关键词】严重急性呼吸综合征冠状病毒 S240 蛋白受 体血管紧张素转化酶 2 结合作用 0 引言 非典型肺炎即严重急性呼吸综合征 （severeacuterespiratorysyndrome,SARS） ，具有高度传 染性与致病性，其致病因子为一种新型冠状病毒SARS 冠 状病毒（SARS-CoV） ，基因组结构为：5-帽状结构-复制 酶（rep）-棘突糖蛋白（S）-小包膜蛋白（E）-膜糖蛋白 （M）-核衣壳蛋白（N）多聚核苷酸尾-3 。S 蛋白介导了 病毒与宿主细胞的结合，SARS-CoV 的功能性受体是血管紧 张素转化酶 2（angiotensin-convertingenzyme2-ACE2） 。 本研究用 293T 细胞表达出了包含 SARS-CoVS 蛋白结合功能 区域的 pS240-EGFP 融合蛋白片段，体外培养了人结膜、角 膜细胞，检测了 SARS-CoV 的功能性受体 ACE2 在人结膜、 角膜中的表达，并进行了非洲绿猴肾细胞（VeroE6Cell） 、 人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞与 SARS- CoVS240-EGFP 融合蛋白片段的体外结合实验研究。 1 材料和方法 材料 SARS-CoVS（基因组原型 GenBank 登录号为： AY278554）基因片段 S（11650nt）DNA 片段。ACE2 引 物序列（accessionnumberAF291820）：上游引物 5- CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3 ，下游引物 5- GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3 ，扩增片段长度为 107 个碱基。 GAPDH:上游引物 5-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3,下游引物 5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3 ，扩增片段长度为 100 个碱 基。由上海博亚生物工程公司合成。PCR 产物克隆载体 pMD-18T（TaKaRa 公司） ；质粒 pEGFP-N1（Clontech 公司） ； 脂质体转染试剂 LipofectamineTMReagent（Invitrogen 公 司） ；MammalianProteinExtractionReagent 哺乳动物细胞 蛋白抽提液（PIERCE 公司） ；SABC-AP 免疫组化染色试剂盒 （Santa-Cruz 公司） ；SARS 患者恢复期血清（使用前经 56加热 30min 进行灭活，获自北京小汤山医院与解放军 309 医院） 。主要抗体：角蛋白 KeratinPan，波形蛋白 Vimentin，神经纤维丝蛋白 NFkappaB（上海友谊中联生物 工程有限公司） ；抗鼠辣根标记的二抗（上海华美生物工程 有限公司） ；羊抗人 ACE2 多克隆抗体（R&D 公司） 。组织来 源：36mo 中期引产胎儿的角膜、结膜、心、肺组织，男 女不限；成人眼球破裂伤摘除的角膜和结膜组织；尸体解 剖的成人心、肺、脑组织由长海医院提供。 方法 pEGFP-N1 及 pS240-EGFP 融合蛋白的表达 PCR 引物： SRF:5-GAATTCGCCACCATGCAGACCTCTAATTTCAGGGTTG-3（斜 体为 EcoRI 酶切位点） ；SRR:5- TCTAGATTAGGGATCCATCTCGAGAGGAGTTAACACACCAGTAC-3（斜 体分别为 XbaI、BamHI、XhoI 酶切位点） 。基因工程方法构 建真核表达质粒 pMD-S240，进一步构建 pS240-EGFP 融合蛋 白表达质粒。利用脂质体介导转染法将 pEGFP-N1、pS240- EGFP 分别转染 293T 细胞并进行克隆培养；细胞蛋白抽提液 裂解细胞并进行透析，荧光分光光度计检测透析前后荧光 光度值；Braford 法检测蛋白质浓度；WesternBlot 法分析 基因表达产物。 ACE2 在人结膜、角膜的表达体外培养人结膜上皮细胞、 角膜上皮细胞、结膜成纤维细胞并行 ELISA 法鉴定。抽提 组织（或细胞）的总 RNA，鉴定 RNA 纯度、浓度和完整性； 半定量 RT-PCR；琼脂糖凝胶电泳；经复日紫外及可见图像 识别分析系统（上海复日科技公司）进行电泳条带光密度 扫描，以光密度积分值比值 ACE2/GAPDH 代表 mRNA 的表达 水平，实验重复 3 次，数据使用 SAS 软件包处理。免疫组 化法检测组织、细胞中 ACE2 的表达（SABC 法） S240-EGFP 蛋白与各组织、细胞的结合免疫酶标技术 ELISA 法：透析的各种组织及细胞蛋白抽提液与 S240EGFP 蛋白进行结合试验，分别使用脑组织和 Hela 细 胞及 EGFP 蛋白作为阴性对照，使用 ACE2 抗体进行阻滞研 究。对所得的 A450 值进行统计分析，使用 SAS 软件包，采 用析因方差分析。流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞与 S 蛋白的结合：检测结合后的荧光细胞。 2 结果 pEGFP-N1 及 pS240-EGFP 融合蛋白的表达质粒琼脂糖凝 胶电泳（图 1）与 DNA 测序鉴定证明 SARS-CoVS240-EGFP 融 合基因构建正确。转染的 293T 细胞在 410h 内观察到绿 色荧光，12h 后可观察到明显荧光。其中 pEGFPN1 转染细 胞的荧光较 pS240-EGFP 转染细胞的荧光稍强，细胞形态呈 圆形（图 2） 。SARS-CoVpS240-EGFP 基因表达产物的 SDS- PAGE 及 WesternBlot 分析：相应分子质量处出现蛋白表达 条带，与理论推算值相符。 ACE2 在人结膜、角膜的表达培养的人结膜上皮细胞、 结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞（图 3） ，ELISA 法鉴定细 胞属性正确。抽取总 RNA 样品的浓度在/L 之间、完整性 良好、A260/280 比值为之间的抽提样本，进行 RT-PCR。 半定量统计结果认为成人肺组织、成人心组织、成人结膜 组织与成人角膜组织间及 Vero 细胞、结膜上皮细胞、结膜 成纤维细胞与角膜上皮细胞间 ACE2-x 与 GAPDH-x 的比值间 的差异有统计学意义；levene 法进行组间两两比较结果除 了结膜上皮细胞与角膜上皮细胞间无显著差异外，其他各 组织、细胞间均有显著差异（图 4） 。免疫组化法检测组织、 细胞中 ACE2 的表达结果见文献1。 S240-EGFP 蛋白与各组织、细胞的结合免疫酶标技术 ELISA 法：细胞及组织蛋白抽提液浓度为 10mg/L 时，结膜 上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜、角膜 组织的蛋白抽提液与 pS240-EGFP 蛋白出现了比较明显的阳 性结合反应，与 VeroE6 细胞及心、肺组织蛋白抽提液相比 稍弱；HeLa 细胞和脑组织蛋白抽提液与 pS240-EGFP 蛋白均 没有出现阳性结合反应。相同浓度的上述组织、细胞蛋白 抽提液中分别加入 pEGFP-N1 蛋白，均没有出现阳性结合反 应。空白对照组为阴性反应。相同浓度的 VeroE6 细胞、结 膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、心、肺、 结膜、角膜组织蛋白抽提液被 ACE2 抗体孵育后，与 pS240- EGFP 蛋白没有出现阳性结合反应（图 5） 。用析因方差分析 比较 S240 和 EGFP 在不同浓度（1mg/L 和 10mg/L）下与结 膜上皮细胞、Vero、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、 HeLa 的结合能力，结果显示：S240EGFP 的结合能力比 EGFP 强，均数分别为， ，10mg/L 浓度比 1mg/L 浓度结合能 力强，均数分别为， 。在比较的各种细胞中，Vero 的结合能 力最强，均数为，结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜 上皮细胞的结合能力相当，均数分别为：， ， ，HeLa 的结合 能力最差，均数为。经过比较，以 10mg/L 浓度的 S240 与 Vero 的结合能力最强，均数标准差为。用同样的方法比 较 S240 和 EGFP 在不同浓度（1mg/L 和 10mg/L）下与心、 肺、结膜、角膜、脑 5 种组织的结合能力，结果如下： S240 的结合能力比 EGFP 强，均数分别为， ，10mg/L 浓度比 1mg/L 浓度结合能力强，均数分别为， 。在比较的各种组织 中，心、肺组织的结合能力最强（二者无差异） ，均数分别 为， ，结膜组织和角膜组织的结合能力为其次（二者无差异） ，均数分别为：， ，脑组织的结合能力最差，均数为。经过 比较，以 10mg/L 浓度的 S240 与肺组织、心组织的结合能 力最强，均数标准差分别为，。流式细胞仪检测结果 显示：从细胞荧光指数观察，VeroE6 细胞、结膜上皮细胞、 结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与 pEGFP-N1 蛋白均没有明 显的结合；VeroE6 细胞与 pS240-EGFP