[生物医药论文精品]蛋白质和多肽的PEG定点修饰研究进展.doc

蛋白质和多肽的peg定点修饰研究进展 摘要：目的 综述蛋白质和多肽的peg定点修饰研究进展。方法 参阅近年来的文献，就氨基、巯基、非天然氨基酸及酶和过渡金属催化修饰几个方面对蛋白质和多肽的peg定点修饰研究进行归纳总结。结果与结论 peg定点修饰有利于保持蛋白质或多肽的生物活性，随着材料科学、新的化学专一反应技术、蛋白质化学合成和重组技术的发展进步，以及准确快速灵敏的分析方法的建立，peg定点修饰技术将具有更加广泛的适用性和广阔的发展前景。关键词：peg修饰；定点修饰；蛋白质和多肽research progress in site-specific pegylation of protein and peptide 蛋白质或多肽的聚乙二醇(polyethylene glycol, peg) 修饰即peg化(pegylation)，是将活化的peg通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。自1977年davis首次采用peg修饰牛血清白蛋白以来，peg修饰技术迅速发展，并广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，peg修饰技术也从理论走向实际的药物应用。peg修饰能赋予蛋白质和多肽类多种优良性能1,2，具体表现为循环半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等，在很大程度上扩宽了蛋白质和多肽的的应用范围。其机理3可能为（见图14）：蛋白质peg修饰后，相对分子质量（mr）增大，当修饰后的蛋白质的mr达到或超出肾小球滤过阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球的滤过作用；由于peg的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高，因而可以在血液循环中停留更长的时间；peg在溶液中呈无规则卷曲，作为一种屏障，能掩盖蛋白质表面的抗原决定簇，使得蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，降低了蛋白质的免疫原性；peg与蛋白质偶联后能将其优良的理化性质赋予蛋白质，如能改善蛋白质的生物分布和溶解性能。目前，已有多种peg修饰的蛋白质和多肽用于生物医药领域，通过fda批准进入市场，如peg修饰的腺苷脱氨酶(peg-ada)、天冬酰胺酶(peg-l-asparaginase)、干扰素-2b (peginterferon alfa-2b)、干扰素-2a(peginterferon alfa-2a)、重组人粒细胞集落刺激因子(pegfilgrastim)等。图1 蛋白质peg修饰后的优良性能fig 1 main advantages of pegylated protein传统的peg修饰多为随机修饰，存在修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高、修饰后的蛋白质分子mr分布宽、活性降低、稳定性有时不够理想等突出问题。相反, 定点修饰能够选择特定基团进行修饰, 避免或减少对活性位点的修饰, 并且可较好地控制修饰程度，提高活性保存率，有利于产品质量控制和工业化生产，已成为peg修饰蛋白质、多肽类药物的研究热点。蛋白质或多肽的定点peg修饰主要从三个方面着手：蛋白质方面，如蛋白质的定点突变、蛋白质可逆性位点定向保护、非天然氨基酸的引入等；peg的活化形式，如修饰氨基的peg-醛和修饰巯基的peg-乙烯基砜等；反应条件的控制，如ph值、金属离子或酶的催化等。本文主要就氨基、巯基、非天然氨基酸及酶和过渡金属催化修饰几个方面综述蛋白质和多肽的peg定点修饰研究进展。1 氨基修饰在peg化修饰兴起早期，修饰靶点多为蛋白质或多肽的氨基，包括赖氨酸的-nh2和末端的-nh2。氨基是蛋白质或多肽中数量最多的亲核功能基团，而且常常暴露于分子表面，因而较容易与peg试剂反应。研究者也开发了一系列以氨基为靶点的聚乙二醇修饰剂，主要有peg-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(peg-ss)、peg-琥珀酰亚胺碳酸酯(peg-sc)、peg-三氟乙基磺酸酯(peg tresylate)和peg-醛(peg aldehyde)等（见表1）。但是，以氨基为靶点的peg化修饰也存在一系列缺陷，如peg修饰产物同分异构体数量多、难以分离纯化获得单一的peg化产物等，但仍有此类修饰药物通过了fda批准，如peg-天冬酰氨酶、peg-ada、peg-ifn-等。近年来，研究者们就以氨基为靶点的定点修饰做了大量研究并开发了一系列较为新颖有效的方法，主要包括定点突变、保护剂定点保护与脱保护、氧化去氨基反应及peg-醛的还原烷化等514。表1 与氨基选择性反应的peg修饰剂tab1 pegs reactive towards amino groupspegslinkage chemistriespeg-succinimidyl succinate.peg-succinimidyl carbonatepeg-tresylatepeg- aldehyde1.1 定点突变 蛋白质或多肽的氨基修饰包括赖氨酸的-nh2和末端的-nh2，多个氨基位点的存在常常导致反应产物的不均一，包括多种修饰位点、多种修饰程度等，利用定点突变技术将赖氨酸突变为其他不含氨基侧链的氨基酸，只保留末端氨基，再与相应peg试剂偶联，可定点修饰末端氨基。yoshioka等人5利用噬菌体蛋白库表达赖氨酸缺陷的肿瘤坏死因子 mtnf-lys(-)，即野生肿瘤坏死因子的6个赖氨酸均被替换为其他氨基酸，只保留末端氨基。mtnf-lys(-)分别与不同mr不同形状的peg-n-羟基琥珀酰亚胺反应，制备末端修饰的peg产物，各产物分别经体内抑瘤活性筛选，结果显示mr为 10kd的分枝peg和直链peg修饰产物，其活性高于未修饰mtnf-lys(-)，可见peg分子的形状和大小对mtnf-lys(-)修饰产物的活性影响较大。本法的缺点是：由于赖氨酸在蛋白质和多肽中含量较多，一般占氨基酸总数的10%左右，若将所有的赖氨酸突变掉，很可能会影响蛋白质的生物活性。1.2保护剂定点保护与脱保护另外一种定点修饰氨基的方法是基于9-芴甲氧羰基（fmoc）和叔丁氧羰基（boc）等氨基酸保护剂的定点保护与脱保护作用来实现的69。此过程主要分为两步，即蛋白质的fmoc衍生物与peg试剂偶联和fmoc的脱保护。如youn等人6以鲑降钙素（sct）的fmoc衍生物fmoc1,11-sct为原料即该蛋白1位半胱氨酸和11位赖氨酸用fmoc保护，只有18位赖氨酸与peg试剂具有反应活性，经偶联、脱保护两步定点修饰18位赖氨酸(见图2)，产率高达86%，修饰产物活性保持率高达80%，酶稳定性明显提高，肺部给药后生物半衰期明显延长9。但该方法只适用于多肽而并不适用于蛋白质，因为在保护和脱保护的过程中常常会破坏到蛋白质的结构，易造成活性损失。deprotectionpegylationfmoc1,11-sct fmoc1,11-peg18-sct lys18-peg-sct图2 使用fmoc1,11-sct对sct的18位赖基酸进行定点修饰示意图fig 2 scheme of the lys18-amine-specific pegylation of sct using fmoc1,11-sct.1.3 氧化去氨基反应在磷酸吡哆醛（plp）存在下，利用氧化去氨基反应去除蛋白质或多肽的末端氨基，并氧化产生酮基，再与peg-酰肼或peg-羟胺成腙或成肟10(见图3)。该方法有利于保持蛋白质或多肽的生物活性，但只有当蛋白质或多肽的末端氨基暴露在分子表面的情况下才易与peg试剂偶联，限制了该方法的应用。图3 plp存在下蛋白质的n-末端氨基酸的定点修饰fig3 site-specific modification of n-terminal amino acid residual of protein under the presence of plp1.4 与peg-醛的还原烷化反应以上所述的多种氨基修饰方法虽然能达到较好的定点效果，但或多或少存在操作复杂、成本高、蛋白或多肽活性损失等问题。kinstler 等人11利用蛋白质n-末端氨基的高反应活性开发了一种简便易行、修饰产品质量容易控制、适用于大规模生产的n-末端修饰方法。在蛋白质或多肽骨架中，末端氨基酸残基的-nh2的 pka 值通常低于赖氨酸的-nh2的 pka 值，在弱酸性环境中，peg-醛更易与末端氨基酸残基的-nh2发生还原烷化反应，从而实现n-末端氨基的定点修饰。amgen 公司采用此方法生产的pegfilgrastim(见图4)，在2002年通过fda 批准进入市场，成为已经上市的第一个采用peg定向修饰技术的药物用于治疗化疗引起的粒细胞减少症。后来也有研究者采用该方法对其他蛋白质进行修饰并取得了较为理想的效果，如 lee 等12利用固相peg修饰的方法，即先将重组的干扰素-2a（rifn-2a）吸附于阳离子交换树脂上，再与peg-醛发生还原烷化反应，随后通过梯度洗脱即可将单修饰产物与随机修饰产物以及未反应的peg修饰剂分离开来。定点修饰产物的产率为50%65%，产物对胰蛋白酶水解的抵抗能力和热稳定性显著提高。此方法将蛋白质的peg定点修饰和分离纯化整合为一步，从而在一定程度上解决了peg修饰反应副产物多，纯化困难等难题。图4 g-csf末端氨基酸的-nh2与peg-醛的还原烷化反应fig4 reductive alkylation of the -amino group of the n-terminal amino acid residual of g-csf with peg aldehyde在上述还原烷化反应中，过量的还原剂nacnbh3常常会使蛋白质变性或对活细胞有毒性。2005年 mcfarland 和 francis13 报道ir（）复合物可以代替还原剂 nacnbh3，反应条件温和，蛋白质不易失活。ogo 等14在此基础上研究发现该金属复合物在 ph7.4、室温下即能生成ir-氢化物，催化效率高，在被活化蛋白浓度仅为 10moll-1 时0.05mol的催化剂就能达到很高的催化效率。2 巯基修饰蛋白质和多肽分子中巯基含量较少，利用巯基的高亲核性，选取能够特异性与巯基偶联的peg偶联剂，可以定向修饰蛋白质和多肽。常用的能与巯基特异性反应的peg偶联试剂主要有：peg-马来酰亚胺、peg-邻-吡啶-二硫醚、peg-乙烯基砜、peg-碘乙酰胺，其具体结构及性质见表24。2.1 包埋于蛋白质内部的巯基修饰由于巯基的疏水性大，常常包埋在蛋白质的疏水口袋中，分子量较大的peg偶联试剂水化半径大，且呈无规则卷曲，因而难以进入蛋白质内部与巯基反应，如-干扰素（-ifn）可采用两步法15：第一步，采用一种含多功能基团的低分子量peg，即peg分子一端为能与巯基特异性反应的基团，另一端为叠氮基团，由于此种peg的分子量小，空间位阻小，因而能到达蛋白质结构内部，进而与包埋于蛋白质内部的半胱氨酸残基偶联；第二步，能与叠氮基团反应的高分子量peg与之前引入的peg结合。2.2 基因工程技术引入巯基后进行修饰对于缺少巯基的蛋白质，可以通过基因工程技术在蛋白质的合适位置引入巯基，再用相应的peg偶联剂进行修饰1520。常用的引入位置有：糖蛋白的糖基化位点、蛋白质的抗原决定簇、蛋白质末端等。采用此方法定点修饰蛋白质的例子很多，如利用定点突变技术在天花粉蛋白（tcs）分子中引入一个半胱氨酸残基，再与peg-马来酰亚胺偶联，结果显示tcs经定点修饰后免疫原性降低了34倍，t1/2延长为原来的5.57倍20。通过基因工程在蛋白质中引入半胱氨酸残基，固然能达到定点修饰蛋白质或多肽的目的，但是这种方法在技术上要求较高，花费大，而且常常会导致蛋白质错误折叠，在纯化过程中也易形成不可逆聚集。对于分子中有多个半胱氨酸残基的蛋白质，也可采用定点突变，将某些半胱氨酸替换为其他氨基酸如丝氨酸，只保留一个半胱氨酸以达到定点修饰蛋白质的目的21,22。如重组人酸性成纤维细胞生长因子（rhafgf）含有三个半胱氨酸，将98位和132位的半胱氨酸突变为丝氨酸，只保留31位的半胱氨酸，再与peg-马来酰亚胺偶联，可完成31位半胱氨酸的定点peg化，大鼠体内试验结果表明修饰后的药物活性优于未修饰药物21。表2与巯基选择性反应的peg修饰剂tab2 pegs reactive towards a thiol groupthioreactive pegsstructurepropertiespeg-pyridildisulphidethe most specific towards thiol but yields a linkage by a reducing agent also in vivo.peg-maleimidegives stable linkage by double bond addition but can also react with amines at ph8.peg-vinylsulfonepeg-iodo acetamideless reactive, not much used2.3 二硫键的定点修饰对于那些通过与细胞表面相应受体结合而发挥作用的蛋白质类药物，常常含有较多二硫键而很少存在游离的半胱氨酸残基，balan等人针对此类蛋白质开发了一种专一性修饰蛋白质中的二硫键的方法2325。先将二硫键还原为两个游离的半胱氨酸巯基，再利用双烷基化peg试剂将两个巯基分别烷基化形成三碳桥，peg通过三碳桥与蛋白质共价偶联。此反应的优势在于不会造成蛋白质的不可逆变性，二硫键还原后能保持蛋白质的三级结构；所开发的双烷基化peg试剂对二硫键的选择性高；且由于peg分子的空间屏蔽作用一个二硫键只能结合一个peg分子。此种针对蛋白质二硫键进行定点修饰的策略已成功应用于多种细胞因子、酶及抗体片断的修饰，结果表明此方法定点peg化蛋白质，产率较高且未破坏蛋白质的三级结构，生物活性也得到较好保持。对于g-csf的二硫键定点修饰可采用可逆还原法，即在还原剂存在下利用变性剂如盐酸胍将蛋白质分子中的二硫键打开并还原为巯基，再以巯基为靶点进行peg修饰，随后通过透析或凝胶过滤色谱除去变性剂复性。经圆二色谱和体外细胞实验证实，此法制备的g-csf修饰产物二级结构和生物活性均保持良好26。3 非天然氨基酸修饰近年来，许多文献2739阐述了将非天然氨基酸如带有卤素、酮基、烯基、叠氮基等基团的氨基酸引入蛋白质和多肽中，并以此为靶点对蛋白质和多肽进行定点修饰。以非天然氨基酸为靶点的蛋白质和多肽定点修饰主要基于五种类型的反应（见表3）27。3.1 sonogashira 偶联1998年dibowski 和 schimdtchen 28采用逆向蛋白水解作用向一个十一肽中引入对碘苯丙氨酸，在金属催化剂 pd(oac) 2 和cui 存在下，与 peg-炔发生 sonogashira 偶联(sonogashira coupling)，收率达到了91%之高。后来也有许多研究者29,30先后尝试采用化学合成或在体外表达系统中利用琥珀终止密码子抑制突变技术将对碘苯丙氨酸引入蛋白质或多肽，在金属钯的催化下与peg-炔偶联，获得了较理想的修饰效果。3.2 成肟或成腙反应利用化学合成31或重组蛋白技术32可将酮基引入蛋白质或多肽，再与peg-羟胺或peg-酰肼偶联生成肟类或腙类复合物33，也可定点修饰蛋白质或多肽。zhang等人 33利用终止密码子抑制突变技术将乙酰苯丙氨酸引入大肠杆菌的蛋白质中，该蛋白质在体内外均能与peg-酰肼特异性生成腙类复合物，产率达75%。糖蛋白上的糖基和n-端丝氨酸或苏氨酸的羟基也可氧化为醛基或醛酸。如糖蛋白上的糖基可被酶如葡萄糖氧化酶或高碘酸钠氧化生成具有多种反应活性的醛基，有些蛋白质或多肽的n-末端氨基酸为丝氨酸或苏氨酸，可被高碘酸氧化为乙醛酰衍生物。以白介素-8 (il-8) 为例，其n-末端氨基酸恰好是丝氨酸，先将丝氨酸氧化为乙醛酰衍生物，再与peg-酰肼或peg-羟胺反应即可对il-8的n-末端进行定点修饰。对于n-末端的氨基酸不是丝氨酸或苏氨酸的蛋白质或多肽如g-csf，可先对其进行氨基肽酶消化，在其n-末端酶解出丝氨酸或苏氨酸后再进行氧化和peg化修饰34。3.3 saudinger反应saudinger反应为叠氮基团与三苯基膦偶联生成酰胺键。血栓调节素是凝血酶催化活化蛋白c的辅助因子，cazalis等人35通过定点突变技术在该蛋白质c-端引入叠氮甲硫氨酸残基，再与三苯基膦衍生化peg反应，从而实现血栓调节素的c-端定点修饰。3.4 huisgen 3+2 环化加成反应叠氮基团与炔基经cu()催化发生3+2环化加成反应36。甲硫氨酸缺陷型大肠杆菌在甲硫氨酸缺乏的培养基中，可在转录水平上向其合成的蛋白质中引入叠氮丙氨酸或炔丙基甘氨酸37，该蛋白质在cu()催化下能与相应活化形式的peg相偶联。还有一种在蛋白质中引入非天然氨基酸的方法，就是利用之前提到的琥珀终止密码子来编码叠氮或炔基氨基酸。deiters等人38开发了一种酪氨酰trna/trna合成酶对能识别这种密码子，可有效地在超氧化物歧化酶（sod）的特定位点加入叠氮或炔基氨基酸，再与peg-叠氮或peg-炔发生 3+2 环化加成反应，活性实验结果显示与天然sod相比修饰sod活性丧失不大。表3 peg修饰剂与含非天然氨基酸的蛋白质的偶联反应tab 3 linkage chemistries employed for the attachment of pegs to protein containing unnatural amino acidsreaction typeslinkage chemistriessonogashira couplingoxime formationhydrazone formationsaudinger ligationhuisgen3+2 cycloaddition 以上所述的非天然氨基酸修饰方法的优势在于选择性高、引入的非天然氨基酸残基只能与相应的peg化试剂特异性地反应，天然的生物大分子则不存在此类氨基酸残基，因此peg修饰的选择性好、效率高。同时，由于只改变了蛋白质或多肽末端或表面的一个氨基酸位点，因此对其空间构象影响不大，有利于保持蛋白质或多肽的生物活性。4 酶和过渡金属催化修饰在进行催化反应时，酶一般都需要与特定的底物进行结合，因此，选取特定的酶为催化剂可以诱导peg-烷基胺与蛋白质上特定的底物进行定点修饰。如果蛋白质上缺少酶催化作用所需的蛋白质片段，可以通过基因工程或其他方法在蛋白质的n-或c-末端引入。目前，常用的酶有转谷氨酰胺酶，这种酶是一种蛋白质修饰酶，能催化谷氨酰氨上的-酰胺基团与其他氨基酸的转移反应，因此将peg-烷基胺做为亲核供体通过转谷氨酰胺反应就能将peg连接到蛋白质的特定位置40。后来，frees等41提出了利用转谷氨酰胺酶对蛋白质进行翻译后修饰，具体为：大肠杆菌表达蛋白在重组o-n-乙酰半乳糖胺（o-galnac）-转移酶的催化下在丝氨酸或苏氨酸位点被添加一个galnac，引入的该糖基进而在唾液酸转移酶的作用下与peg-唾液酸产生专一性反应。另外，酪氨酸酶也被报道用于蛋白质中酪氨酸残基的定点修饰42。蛋白质多带有亲核功能基团，利用亲电的有机金属试剂能更有效地进行peg修饰。如在卡宾铑催化下，色氨酸残基上的吲哚基团可被专一性修饰43。酪氨酸残基在芳基膦钯催化下能与peg试剂反应44。过渡金属在这一领域的应用，使得许多无法常规peg化的氨基酸残基如色氨酸残基、酪氨酸残基等变得可用，从而大大扩展了蛋白质peg修饰的靶点。5 小结peg定点修饰有利于保持蛋白质或多肽的活性，能获得某一特定修饰位点的均一peg产物，免去了复杂甚至不可能实现的的分离纯化步骤，易于控制产品质量、提高产率、降低生产成本。peg定点修饰也成为蛋白质及多肽药物研究的一大热点，随着材料科学、新的化学专一技术、蛋白质化学合成和蛋白质重组技术的发展进步，以及准确快速灵敏的分析方法的建立，peg定点修饰技术将具有更加广泛的适用性和广阔的发展前景。references 1 ryan s m, mantovani g, wang x, et al. advances in pegylation of important biotech molecules: delivery aspectsj. expert opin drug deliv, 2008, 5(4):371-383.2 pasut g, veronese f m. polymerdrug conjugation, recent achievements and general strategiesj. prog polym sci, 2007, 32(8-9):933-961.3 veronese f m. peptide and protein pegylation: a review of problems and solutions j. biomaterials, 2001, 22 (5):405-417.4 veronese f m, pasut g. pegylation, successful approach to drug delivery j. drug discov today, 2005, 10(21):1451-1458.5 yoshioka y, tsutsumi y, ikemizu s, et al. optimal site-specific pegylation of mutant tnf-alpha improves its antitumor potency j. biochem biophys res commun, 2004, 315(4): 808-814.6 youn y s, na d h, lee k c. high-yield production of biologically active mono-pegylated salmon calcitonin by site-specific pegylation j. j control release, 2007, 117(3):371-379.7 youn y s, chae sy, lee s, et al. evaluation of therapeutic potentials of site-specific pegylated glucagon-like peptide-1 isomers as a type 2 anti-diabetic treatment: insulinotropic activity, glucose-stabilizing capability, and proteolytic stability j. biochem pharmacol, 2007, 73(1): 84-93. 8 youn y s, lee kc. site-specific pegylation for high-yield preparation of lys(21)-amine pegylated growth hormone-releasing factor (grf) (1-29) using a grf(1-29) derivative fmoc-protected at tyr(1) and lys(12) j. bioconjug chem. 2007, 18(2): 500-506.9 youn y s, kwon m j, na d h, et al. improved intrapulmonary delivery of site-specific pegylated salmon calcitonin: optimization by peg size selectionj. j control release. 2008, 125(1):68-75.10 gilmore j m, scheck r a, esser-kahn a p, et al. n-terminal protein modification through a biomimetic transamination reactionj. angew chem int ed engl, 2006, 45(32): 5307-5311.11 kinstler o, molineux g, treuhrit m, et al. mono-n-terminal poly(ethylene glycol)-protein conjugates j. adv drug deliv rev, 2002, 54(4):477-485.12 lee b k, kwon j s, kim h j, et al. solid-phase pegylation of recombinant interferon alpha-2a for site-specific modification: process performance, characterization, and in vitro bioactivityj. bioconjug chem. 2007, 18(6):1728-1734. 13 mcfarland j m, francis m b. reductive alkylation of proteins using iridium catalyzed transfer hydrogenation j. j am chem soc, 2005, 127(39): 13490-13491.14 ogo s, uehara k, abura t, et al. ph-dependent chemoselective synthesis of alpha-amino acids. reductive amination of alpha-keto acids with ammonia catalyzed by acid-stable iridium hydride complexes in water j. j am chem soc, 2004, 126(10): 3020-3021.15 el tabir n, roberts m j. polyol-ifn-beta conjugatesp, wo9955377p. 1999.16 zappe h, snell m e, bossard m j. pegylation of cyanovirin-n, an entry inhibitor of hivj. adv drug deliv rev, 2008, 60(1):79-87.17 doherty d h, rosendahl m s, smith d j, et al. site-specific pegylation of engineered cysteine analogues of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor j. bioconjug chem, 2005, 16(5):1291-1298.18 tom i, lee v, dumas m, et al. reproducible production of a pegylated dual-acting peptide for diabetes. j. aaps j, 2007, 9(2):e227-34. 19 bell s j, fam c m, chlipala e a, et al. enhanced circulating half-life and antitumor activity of a site-specific pegylated interferon-alpha protein therapeuticj. bioconjug chem. 2008, 19(1):299-305.20 an q, lei y, jia n, et al. effect of site-directed pegylation of trichosanthin on its biological activity, immunogenicity, and pharmacokineticsj. biomol eng. 2007，24(6):643-649.21 huang z, zheng q, wu x, et al. enhanced protection of modified human acidic fibroblast growth factor with polyethylene glycol against ischemia/reperfusion-induced retinal damage in ratsj. toxicol lett, 2007, 170(2):146-156.22 wu x, liu x, xiao y, et al. purification and modification by polyethylene glycol of a new human basic fibroblast growth factor mutant-hbfgf(ser25,87,92) j. j chromatogr a, 2007, 161(1-2):51-55. 23 zloh m, shaunak s, balan s, et al. identification and insertion of 3-carbon bridges in protein disulfide bonds: a computational approachj. nat protoc, 2007, 2(5):1070-108324 balan s, choi j w, godwin a, et al. site-specific pegylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridgej. bioconjug chem, 2007, 18(1):61-76.25 brocchini s, godwin a, balan s, et al. disulfide bridge based pegylation of proteinsj. adv drug deliv rev., 2008, 60(1):3-12. 26 veronese f m, mero a, caboi f, et al. site-specific pegylation of g-csf by reversible denaturationj. bioconjug chem. 2007, 18(6):1824-1830.27 kochendoerfer g g. site-specific polymer modification of therapeutic proteins j. curr opin chem biol, 2005, 9(6):555-560. 28 dibowski h, schmidtchen f p. bioconjugation of peptides by palladium-catalyzed c-c cross-coupling in water j. angew chem int ed, 1998, 37(4): 476-478.29 ojida a, tsutsumi h, kasagi n, et al. suzuki coupling for protein modification j. tetrahedron lett, 2005, 46(5): 3301-3305.30 kodama k, fukuzawa s, nakayama h, et al. regioselective carbon-carbon bond formation in proteins with palladium catalysis; new protein chemistry by organometallic chemistry j. chem bio chem, 2006, 7(1): 134-139.31 chen s y, cressman s, mao f, et al. synthetic erythropoietic proteins: tuning biological performance by site-specific polymer attachment j. chem biol, 2005, 12(3): 371-383.32 miller l w, cornish v w. selective chemical labeling of proteins in living cells j. curr opin chem biol, 2005, 9(1): 56-61.33 youn y s, na d h, yoo sd, et al. carbohydrate-specifically polyethylene glycol-modified ricin a-chain with improved therapeutic potentialj. int j biochem cell biol, 2005, 37(7): 1525-1533.34 gaertner h f, offord r e. site-specific attachment of functionalized poly(ethylene glycol) to the amino terminus of proteinsj. bioconjug. chem, 1996, 7(1):38-44.35 cazalis c s, haller c a, sease-cargo l, et al. c-terminal site-specific pegylation of