血栓与止血检验进展王鸿利ppt课件

1 血栓与止血检测进展 王鸿利 上海交通大学医学院附属瑞金医院， 上海血液学研究所，200025 2 近年，随着基础理论和实验技术的 发展，血栓和止血检验及其临床应用 也有了很大的进展，本文就此作一简 述。 3 （一）血小板微颗粒检测 血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以 伪足断裂方式形成直径为0.11.0m的血小板颗 粒（Platelet Microparticle,PMP)。PMP的体积较正 常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。 PMP膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP） b/a（ GP b/a）、 GPb/-、血小板 活化因子（PAF）、-样前体淀粉蛋白、Ca2+依 赖性蛋白酶Calpainyi以及有促凝作用的磷脂等。 因此检测血循环中的PMP可较完整地反映血小板参 与血栓形成和血液凝固的功能。 4 5 检测方法流式细胞术。主要试剂为 CD61 parcp:多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗血 小板GPa的单克隆抗体 参考值6617个/104血小板（山东大 学齐鲁医院报道）。 6 临床意义PMP主要用于动脉血栓性疾病的 检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标 志物。 1.急性冠脉综合征（ACS）：有证据显示， PMP参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程 。Cawaz等对急性心肌梗死（AMI）施行PTCA患 者进行系列血小板功能研究，发现PTCA术后患 者的血小板数因消耗增加而减少，PMP因大量形 成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。 Katopodis等对行冠脉血栓形成术的ACS患者进行 观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期 发生AMI、不稳定性心绞痛者），结果发现，试 验组患者PMP水平较正常对照组明显增高。 7 2.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管 血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者 进行PMP检测。结果发现，阿尔茨海默病 患者的PMP水平与正常对照组无统计学差 异，而其他疾病组患者的PMP水平均显著 高于正常对照组，且治疗后有明显的降低 ，而且小血管血栓组患者的PMP水平高于 大血管血栓组患者。表明PMP水平的增高 ，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞 。 8 （二）血小板-白细胞聚集体检测 血小板被激活后，血小板释放P-选择素 （P-selectin或GMP-140）。 P-选择素与白 细胞和（或）单核细胞膜上的P-选择素配 体糖蛋白-1（PSLG-1）结合形成血小板-白 细胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre - gate,PLA)和（或）血小板-单核细胞聚集物 （ Platelet-Monocyte Aggregate）。该聚 集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物 之一。 9 检测方法流式细胞术。主要试剂为 FTTC标记的鼠抗人GPIb（CD42b）单克隆 抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45单 克隆抗体，FTTC标记的鼠抗人P-selectin （CD62b）单克隆抗体。 参考值瑞典学者报道血小板-白细胞 聚集物为15.38.5（PLA/L）。 10 临床意义动物实验和临床研究表明 ，PLA是更敏感和更特异的血栓标志物。一 组93例胸痛患者，其中9例为AMI患者，其 血小板-单核细胞聚集物为34.210.3，84 例非AMI胸痛患者的血小板-单核细胞聚集 体为19.31.4，二组差异显著（0.05 ）； AMI胸痛组和非AMI胸痛组患者的血小 板-单核细胞聚集物水平均较10例正常对照 组的血小板-单核细胞聚集物水平为高（ 0.001）。 11 （三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测 生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管 性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）主要受vWF裂解蛋白酶（ vWF C- leaving Proteinase, vWF -CP）的调节。 vWF CP作用于 vWF分子量为250000多聚 体的Try（842）-Met（843）之间的肽键， 将它们水解成分子量为176000和140000的 两个小分子肽段。此时vWF不能过度地参与 血小板的粘附和聚集，因此vWF CP是 限制血栓形成的标志物之一。 12 13 14 检测方法ELISA。以型胶原包被酶标板 ，2.5BSA封闭，分别加入未透析的标本和经 Slide-A-Lyzer透析过的标本，一抗为兔抗人vWF 多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG， 加入底物OPD490nm显色。结果以透析前后的 OPD490比值作为该份标本的残余胶原结合活性 （ vWF:CBA或R- CBA ）表示， R- CBA 越高， vWF-CP活性越低。 参考值83例正常人血浆（n 30） vWF:CBA 范围为2.140.5（21.99.2） ；血清（n 53） vWF:CBA范围为2.4 52.0（20.510.8）（苏州大学附一院）。 15 临床意义 1.血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：由 于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血浆中存 在抗vWF-CP自身抗体，使vWF-CP血浆水 平显著降低，不能正常裂解超大分子量的 vWF多聚体（UL- vWF ）。体内聚集的UL- vWF 易于血小板结合，促使血小板粘附和 聚集，引起TTP病理过程的发生和发展。一 组5例TTP患者检测vWF:CBA结果为48.1 96.5（78.220.2），较正常对照组 明显增高，反映患者vWF-CP明显降低。 16 2.血管性血友病（vWD）：据报道，21 例vWF患者血浆vWF:CBA水平明显降于30 例正常人、15例血友病患者及30例其他出 血性疾病患者（0.001）。在vWF中， 型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值1.0； 型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA比值2.0； 型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA都极低，其 vWF:Ag/ vWF:CBA比值具有可变性。 17 3.恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP活 性水平显著低于正常人，伴有远处转移患 者的vWF-CP活性水平更低，接受手术治疗 后患者的vWF-CP可升高，导致血浆大分子 多聚体增多，促使vWF参与血小板粘附和 聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和 血栓形成，反映vWF是参与恶性肿瘤血栓 形成机制之一。 18 (四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测 （monoclonal antibody specific immobili- zation of platelet antigen,MAIPA） 将待测抗体、单抗和血小板共同温育， 得到血小板膜GP、待测标本和单抗三分子 复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色被 抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测 抗体水平呈正比。 参考值抗GP b/a阳性，A值 0.133；抗GPb阳性， A值0.209 19 20 临床意义检测血小板相关抗体，其 敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA法。 用于检测ITP和同种免疫血小板减少症。 21 两种方法对ITP诊断的比较 ELISA法 MAIPA法 PAIgGPAIgAPAIgMGPb/aGPb 阳性率（）8127225413 敏感性（）8866607566 特异性（）5075768394 诊断效率（）7227227313 22 (五)凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测 凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM） 将由肝脏合成的、分子量为55KD的凝血酶 激活的纤溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI）的Arg（92）- Ala（93）之间的肽键水解后，脱去一个活 化肽， TAFI变成活化型的TAFI a。 TAFI具 有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性 ，但是TAFI也受蛋白C抑制物（PCI）的抑 制。 23 24 检测方法 采用 ELISA测定TAFI： Ag。以鼠抗人TAFI单克隆抗体包被酶标板 ，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧 化物酶标记的抗人TAFI抗体，充分作用后 加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本 TAFI的含量成正比。 TAFI:A采用发色底物 法测定。 参考值 TAFI:Ag （n 34）为77 28 （21133）； TAFI:A （n 34 ）为24 5g/L（1434g/L）（上海瑞金 医院） 25 临床意义 1.深静脉血栓（DVT）：Tiburg等对脑74例 初发DVT患者的TAFI:Ag 进行检测，发现其水平 增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI： Ag水平超过90，其水平的危险性水平2倍，此 时患者的纤溶活性减低。 2.动脉血栓（冠心病）：瑞金医院对19例冠 心病患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现冠心病 患者的TAFI:Ag和TAFI:A的水平均高于正常对照 组（0.001），与Silveira报道11例冠心病的 检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。 此外， TAFI水平增高也见于不稳定性心绞痛。 26 3.微血栓（DIC）：瑞金医院对15例 DIC患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现患 者的水平明显低于正常对照组（0.001 ），表明患者纤溶活性明显升高。 4.其他：TAFI水平升高还见于感染、因 子V Leiden突变； TAFI水平减低还见于某 些凝血因子缺乏（血友病、F缺乏症）、 急性早幼粒细胞白血病（ TAFI:A减低66 ，但TAFI:Ag正常）。 27 （六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测 可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（Soluble Endothelial Protein C Receptoe,sEPCR）是由血 管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连 EPCR，一部分流离于血浆称sEPCR。克隆的膜 连EPCR cDNA全长1.3kb,是一种由221个氨基酸 组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR 通过促进T-TM复合 物与蛋白C（PC）的结合，进而放大PC的活性； 此外， EPCR还对体内急性炎症反应河DIC的发 生具有保护作用。然而，血浆中sEPCR与膜连的 EPCR具有相反的作用。 sEPCR也可与PC和活 化蛋白C（APC）结合。抑制PC的活化和抑制 APC的抗凝活性，减轻膜连EPCR的增强PC活化 和APC的抗凝作用，所以血浆sEPCR水平的增高 市反映血管损伤和抗APC抗凝作用的特异性标志 物。 28 检测方法采用 ELISA。以单克隆-抗 包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀 释度的sEPCR标准品后，以生物素标记的 单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显 色，绘制标准曲线。 参考值血浆sEPCR为 115.220.7g/L 29 临床意义安徽省立医院报道的结果见表1 组别nsEPCR（g/L）值 正常对照值20115.2020.70 冠心病组30134.2069.60 心绞痛17148.9087.90 心肌梗死 8117.6033.80 糖尿病组56177.0081.400.001 败血症组30172.6043.700.001 SLE合并血栓组 14144.7033.900.005 SLE血栓组49165.8045.300.001 30 （七）蛋白C Global试验 凝血酶（T）与血管内皮细胞的凝血酶 调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后 者使PC转化为APC。 APC在蛋白S（PS） 的辅助下，灭活因子Va和因子a，还抑制 纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纤溶 活性增强。然而，Agkistrodon contorix蛇 毒可以取代T-TM复合物直接激活PC，使 PC转化为APC， APC也受PAI的抑制。 31 检测方法在待测血浆中加入蛇毒温 育，蛇毒可直接激活PC，使PC转化为AP- C。随后在检测系统中加入APTT试剂以检 测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C Activ-Ity Dependent ClottingTime,PCAT） 若待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+ 后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多 因素的影响，本试验设计了对照组，即在 实验过程中以缓冲液代替PC激活剂，血浆 不依赖PC活性的血浆凝固时（PCAT/O） ，其结果应短于60s。 32 参考值PCAT为85200s， PCAT/O为 3355s （n 234）。 临床意义本试验对PC活性低于参考值70 的检出率为90；对PS活性低于参考值的60 的检出率为89；对凝血因子Leiden突变的检 出率为100；对凝血酶原（F）20210 CA 突变的检出率为84。本试验的检出特异性为79 。因此，本试验多用于PC、PS、F Leiden突 变和F20210 CA突变的检测，起到蛋白C系 统筛选检测作用。但是，本试验也有假阳性，见 于凝血因子、活性升高、口服抗凝剂和狼疮 抗凝物质等。 33 （八）蛋白Z抗原检测 蛋白Z（Protein Z,PZ）是二十世纪90 年代发现的一种血液凝固调节蛋白，为一 种维生素K依赖的单链糖蛋白，由肝脏合成 后分泌入血。人PZ的相对分子量为62KD， 半寿期为2.5天，其基因位于13q34。在 Ca2+和磷脂存在时，PZ可与蛋白Z依赖的蛋 白酶抑制物（ Protein Z-Pependent ProtaseInhibItor,ZPI）结合，并进一步与 Fa形成a-ZPI-PZ复合物而使因子a在 一分钟内便失去95以上的凝血活性。 34 检测方法 目前多采用法国Stago公 司的 ELISA试剂盒检测。 参考值法国学者报道1.04 3.57mg/L；国内潘学谊报道60例中青年人 （2258480）g/L。妊娠期时PZ水平逐渐 增高。 35 临床意义目前PZ在临床上的意义尚不十 分清楚。Wasse等研究发现PZ缺乏（1.0Mg/L ）在缺血性脑卒中和健康对照中分别为20和5 ，二者具有显著性差异，PZ缺乏可使缺血性脑 卒中的危险性提高4倍。Soft等报道在急性冠脉综 合征病人当中PZ水平明显低于健康对照，说明PZ 缺乏是导致急性冠脉综合征的独立的危险因素。 此外，尚有报道认为PZ缺乏也会导致临床出血症 状，故认为PZ具有血栓和出血双种作用，机制未 明。此外，血透患者和口服避孕药者PZ水平升高 ；口服抗凝剂、流产、早产、先兆子痫、胎儿宫 内发育迟缓等PZ血浆水平降低。 36 蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物检测 (proteinZ-dependent protease inhibitor,ZPI) 原理用抗ZPI的多克隆抗体色被酶标板， 待测血浆中的ZPI与固相抗体结合，生物素 化抗ZPI单抗与ZPI抗原结合形成固相多抗- 抗原-生物素单抗夹心物。后加入链霉素亲 和素-辣根过氧化物酶复合物，其中辣根过 氧化物酶作用其特异性底物甲基联苯胺 （TMB）生成有色物质，显色程度与ZPI含量 呈正比。 37 参考范围各室需自行建立 临床意义ZPI应与PZ同时检测。PZ缺乏 时，势必使ZPI抑制FXa和FXIa的作用明显 减低，易形成血栓。 38 （九）组织因子途径抑制物-因子Xa复合物检测 （tissue factor pathway inhibitor-factor-factorXa complex,TFPI-FXa） 利用双抗体夹心法检测血浆中TFPI/FXa二元 和TF/Fa/ TFPI/FXa四元复合物。将稀释的血浆 样品加至预先用特异性抗TFPI抗体色被的酶标板 中温育，抗原-抗体结合后用生物素标记的纯化鸡 IgY来检测，后者可识别TFPI/FXa复合物表面的 新抗原决定簇。加辣根过氧化物酶标记的链霉素 亲和素，形成双抗体夹心酶联免疫复合物。加底 物TMB，与过氧化物酶反应生成蓝色溶液，最后 加0.5mol/LH2SO4终止反应，溶液变成黄色。在 波长450nm处测得吸光度值。根据标准曲线，计 算待测血浆中TFPI/FXa复合物的含量。 39 参考值待建立 临床意义有助于DIC早期和血栓前状态的 检测和诊断。 40 （十）抗体芯片技术 抗体芯片（Antibody Microarray）是 蛋白芯片的一种，是将能识别特异性抗原 的抗体制成微阵列，检测生物样品中抗原 蛋白表达模式的方法。这种抗体微阵列可 以在一次简单实验中同时检测样品中的数 百甚至数千种蛋白质的表达情况，并且可 以在一张芯片上对两种样品的表达模式进 行比较分析。这使抗体芯片在毒性实验、 疾病研究和药物开发上有着广泛的应用前 景。 41 抗体芯片的检测操作并不要求特殊的技 能，一般常规的操作就可以完成以往极为 复杂耗时的工作。整个检测操作流程包括 ：从组织或细胞、体液中提取蛋白质，并 用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别 标记被检测样品和对照样品，去除多余的 标记分子后与芯片杂交孵育，最后扫描分 析结果。整个过程从样品制备到结果分析 只要一天即可完成。在抗体芯片制作方面 ，如何获得高质量的抗体、提高特异性、 减少交叉反应是制作高质量抗体芯片的主 要考虑因素。 42 抗体芯片技术在血栓与止血检验领域 有着很好的应用前景。目前正在研发过程 中的凝血疾病诊断抗体芯片，是将针对各 种凝血因子和抗凝血因子的单克隆抗体分 别固定在合适的片基上，来检测血清标本 中各种凝血因子和抗凝血因子的抗原，从 而可以迅速诊断遗传性易栓症和出血性疾 病。 43 （十一）血栓弹力图 （ Thrombelastograph hemostasis system,TEG ） 的检测及其临床应用 凝血-血小板-纤溶的筛选作用 44 参数定义 45 参数定义 46 -3+3 485472 47 高凝 48 -3+3 4854724774 49 50 -3+3 EPL 015 Ly30 08 4774 51 纤溶亢进 52 53 54 （十二）旋转血栓弹力图（ROTEM） 是在传统的TEG基础上，减少振动 的干扰，增加了流动性和电脑分析系 统，使测量间的波动减少，更为准确 、明了。 55 常用参数及其意义/应用 EXTEM是加入重组的TF(rTF)激活外源 凝血系统，很快形成血凝块(相当于PT)，即 为EXTEM-CT。EXTEM-CT的截断阈值出 现在实验开始后的80s，提示需输注PCC或 FFP； EXTEM-MCF：提供血凝块最大强度和 稳定的信息，与血小板计数和Fg水平有关 。 56 FIBTEM-MCF：实验中加入一种血小板 抑制剂（细胞松弛素D）即代表Fg对血凝块 的强度；MCF截断阈值出现于实验开始后 的1015分钟，其降低提示须输注Fg制品； FIBTEM-MCF值正常而EXTEM-MCF值 减低提示须输注血小板，因此二者须同时检 测。 57 INTEM是实验中加入鞣花酸活化物， 激活内源凝血系统（类似APTT）；加入 肝素酶（HEPTM）用肝素样抗凝物检查 。比较INTEM-CT和HEPTEM-CT，可用 于对肝素化和鱼精蛋白纠正的定量，二者 需同时检测。 58 针对围手术期大出血患者床旁ROTEM 检查，应包括EXTEM、FIBTEM、APTEM 以及必要时用INTEM、HEPTEM等。 对于心脏手术（体外循环）被肝素化的 患者，推荐将INTEM-CT和HEPTEM-CT作 为首选的ROTEM检查。 59 推荐检查的时间点 手术之前 有明显出血，但尚未作纠正治疗时 置换一个血容之后 术后检测有无高凝状态 60 血制品的输注和止血药的应用 1、Fg/冷沉淀输注：Fg1.0g/L，或 ROTEM检测EXTEM-MCF50mm及 FIBTEM-MCF12mm。应输注Fg/冷沉淀 。 EXTEM-MCF和FIBTEM-MCF的目标值 （参考值）分别为5060mm和1620mm。 若行施肝移植和心脏手术患者，其EXTEM- MCF可为45mm，FIBTEM-MCF可为8mm ；若无出血EXTEM-MCF的临界值可 35mm。 61 2、血小板输注：BPC 50109/L或EXTEM -MCF45mm + FIBTEM-MCF12mm， 应输血小板制品。 62 3、PPC/FFP输注：APTT/PT 正常对照值 的1.5倍或EXTEM-MCF 100mm。提示 F、F、F、F的血浆水平减低，应 给予PPC或FFP。FFP应输注 2030ml/kg（国内1015ml/kg），且可以 补充F。 63 4、rFa制品：在Fg 1.0 1.0g/L， BPC 50109/L和APTT/PT接近正常情况下，其 疗效最佳。可以选用TEG/ROTEM检查中 的R/CT、K/CFT缩短以及MA/MCF升高最 能反映rFa的效果，但APTT/PT的缩短不 能反映rFa的效果。 64 （十三）血小板功能分析仪 （platelet function analyzer- 100,PFA-100) 体外筛选血小板黏附和聚集的 仪器。以标有胶原/腺上腺素（ CEPI）和胶原/ADP（CADP） 两种纤维膜为诱导剂，以观察 膜孔闭合时间（closure time， CT）为结果。 参考范围 CEPI为61203s； CADP：48 187s 65 In Vivo HaemostasisPFA100.avi capillary 200m aperture 150m epinephrine or ADP platelet vWF erythrocyte FLOW - 40 mbar collagen membrane PFA-100 Test Principle lumen fibrinogen platelet collagen fibrils erythrocyte endothelial cell vWF 66 临床应用 一期止血缺陷的筛选试验。 敏感性：CEPI/CADP为82.5%/66.9% 特异性： CEPI/CADP为88.7%/85.5% 阴性预测值： CEPI/CADP为83%/75% 阳性预测值： CEPI/CADP为88%/79% 67 vWD：CEPI/CADP的敏感性为88%/87%； 特异性为95%/95%。 血小板无力症：CT延长，可替代BT，准确 、可靠。 服用ASA时：CEPI的CT延长，CADP可正 常；与其他疾病与药物诱导血小板功能异 常鉴别的敏感性和特异性分别为100%和 50%。 68 方法学评价 PFA-100操作简便、快速、结果准确。 CEPI/CADP的变异系数为12%/8%，与 PAgT有良好相关性。 受PLT、贫血（Hct30%）、O型血 型、3.8%枸橼酸盐和富含核黄素食物等的 影响；Fg的裂解肽可影响 Fg-vWF/GPb-a的结合 69 （十四）凝血酶生成 (Thrombin generation，TGT) 的检测及其临床应用 乏血小板血浆(PPP)试剂(含TF和磷脂)作用于待测 血浆，激活凝血系统，最终生成凝血酶。后者将荧光 底物ZGGR-AMC*转化为荧光基团AMC，AMC在 390nm激发光的作用下发出460nm波长的荧光。荧光 读数仪实时检测产生的荧光强度，通过电脑自动绘制 凝血酶生成曲线。 * ZGGR-AMC: Z-Gly-Gly-Arg-AminoMethyl coumarin 凝血酶生成试验的原理 70 CAT检测法主要有5个指标： 延迟时间(lagtime):即从反应开始到凝血酶开始生成所 经历的时间(min为单位)。 峰值(peak):即生成凝血酶的最大量(nM为单位)。 达峰时间(ttpeak):即从反应开始到凝血酶达到最大值所 经历的时间(为单位)。 凝血酶生成潜力(Endogenous thrombin potential,ETP): 即凝血酶生成曲线下的微积分面积，反映凝血酶的生成 量(nMmin为单位)。 ETP比值：即患者ETP与正常人ETP的比值(%为单位)。 71 72 凝血酶生成试验的临床应用 在低分子量肝素(LMWH)治疗中的凝血酶生成 73 74 75 76 77 检测抗凝药物治疗：例如华法林治疗(n=78)。 随着PT-INR值的递增，TGT的峰值下降，延长时间和达 峰时间随之延长。 目前认为，华法林治疗要求PT-INR为2.03.0， PT-INR 1.5，华法林无效； PT-INR 2.0仍有血栓可能； PT- INR 3.0出血事件增加， PT-INR 5.0出血危险度剧增。 Dieri等报道，ETP30%时可致出血倾向，要求抗凝治 疗时ETP维持在50%为宜。若以PT-INR与ETP同时用于华 法林观察，能更全面反映凝血状态。 78 附：血管性血友病（vWD）的实验诊断 血管性血友病（von Willebrand dise- ase,vWD）是由于血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）合成的量或质异 常所致的以皮肤、粘膜出血为特征的遗传 性或获得性出血病。 79 80 诊断vWD的常用检测 筛选试验：BT