胎儿染色体异常的细胞遗传学产前诊断技术标准解读

胎儿染色体异常的细胞遗传学 产前诊断技术标准解读 湖南省妇幼保健院 王 华 胎儿染色体异常的细胞遗传学 产前诊断标准内容 l范围 l术语和定义 l临床工作 l产前诊断的实验室工作 l产前诊断病例的追踪和随访 l资料性附录 范 围 l规定了产前诊断的临床工作、实验室工作、 以及产前诊断病例的追踪和随访标准 l适用于： l已取得产前诊断技术服务资质的医疗保健机 构 l采用细胞遗传学方法等国家认可的相关技术 l对孕妇实施胎儿染色体检查 l对胎儿是否罹患目前细胞遗传学技术可诊断 染色体病做出产前诊断 术语和定义 l染色体计数：在显微镜下计数一定数量 的中期细胞中具有着丝粒的染色体数目 l分析细胞数：在镜下或计算机处理图像 、或根据照片对显带标本中期细胞中每 一条染色体的形态进行分析的细胞数量 术语和定义 l核型分析细胞数：根据ISCN 1995或ISCN 2005规则对一个细胞的染色体照片或者 计算机处理图像进行分组、排队、配对 并进行形态分析的细胞数量 l集落：经收获并染色后贴附在细胞培养 物生长基底上相对聚集的细胞克隆 l异常克隆：至少有两个细胞含有相同的 额外染色体或染色体机构异常，或至少 有3个细胞均丢失同一号染色体 临床工作 l门诊工作程序 l知情同意书的签署 l病例资料和样本采集 门诊工作程序(1) l由经过专门培训的、有资质的医师承担 l进行遗传咨询或者妇产科产前咨询 l应让孕妇理解采取侵入性取材手术可能 发生的各种并发症的风险 l对于年龄在35岁以上，或者符合其他产 前诊断指征的孕妇，均应推荐其做产前 诊断 门诊工作程序(2) l细胞遗传学产前诊断指征 l35岁以上的高龄孕妇 l产前筛查出来的胎儿染色体异常高风险的 孕妇 l曾生育过染色体病患儿的孕妇 l产前B超检查怀疑胎儿可能有染色体异常 的孕妇 l夫妇一方为染色体异常携带者 l医师认为有必要进行产前诊断的其他情形 门诊工作程序(3) l介入性产前诊断手术 l绒毛取材术孕1013周+6 l羊膜腔穿刺术孕1622周+6 l经皮脐血管穿刺术孕18周之后 l应选择合适的时期和方法进行产前诊断 l术前应正确掌握产前诊断及取材手术的 适应征和禁忌征，并完成必要的检查 门诊工作程序(4) l胎儿标本采集手术室要求： l手术室配备（抢救设备） l消毒环境 l设备（B超，最好带穿刺探头） l手术组人员搭配合理 l手术医师相对固定 胎儿取材术前准备 l认真核对适应症及有无禁忌症 l查血、尿常规、凝血功能、HIV、 HBSAg、抗梅毒抗体、ABO血型和Rh 因子 lB超检查了解胎儿情况及胎盘附着情况 胎儿取材术禁忌症 l先兆流产 l术前两次测量体温（腋温）高于37.2 l有盆腔或宫腔感染先兆 l无医疗指征的胎儿性别鉴定 介入性胎儿取材术安全事项 l羊水穿刺术中,如两次穿刺未获取羊水时 应终止手术,1-2周后再次手术。 l经腹绒毛穿刺术中,如引导套针两次穿刺 均未穿入胎盘绒毛组织时应终止手术,1-2 周后再次手术。 l经皮脐血穿刺术中，手术时间不宜超过 20min，如穿刺针2次经皮穿刺均未穿入 脐带时应终止手术,1-2周后再次手术。 取材手术的质量控制 l羊膜腔穿刺术 l一次穿刺成功率99以上 l术后一周内的胎儿丢失率小于0.5 l绒毛取材术 l一次穿刺成功率98以上 l术后一周内的胎儿丢失率小于1.5 l经皮脐血管穿刺术 l一次穿刺成功率90以上 l术后一周内的胎儿丢失率小于2 知情同意书的签署 l应向孕妇说明： l细胞遗传学产前诊断技术的局限性 l即常规染色体检查不能： l诊断染色体微小结构改变 l单基因遗传病 l多基因遗传病 l环境以及药物导致的胎儿宫内发育异常 l如因细胞培养失败而无法得到结果，则 有再次取材的可能 产前诊断病历书写要求 l产前诊断病历保存规格和期限 l按照重要技术档案保存 l保存期限至少20年 细胞遗传学产前诊断实验室工作 l标本的接收登记 l细胞培养 l外周血淋巴细胞染色体(植物血凝素刺激) 检查 l产前诊断实验室的一般要求 l羊水细胞染色体分析 l绒毛细胞染色体分析 l胎儿脐带血染色体分析 l细胞遗传学检查报告 l产前诊断病历资料存档及标本保存 细胞培养 l一般要求：细胞接种操作应在超净工作台 进行 l培养箱 l应定期清洗并检查培养箱 l每个工作日检查指示的培养箱内温度和二 氧化碳浓度 l应注明最高与最低温度控制 l应制定并张贴出仪器运行的合理范围 l当读数超过合理范围时应有相应处理方案 l每周检查贮气瓶气体和实验室空气湿度 外周血淋巴细胞染色体检查 (植物血凝素刺激) (1) l一般要求 l每份标本至少建立两个独立的培养系统 l90%以上的常规外周血分析应在收到标本 之日起21个工作日之内发出最终书面报告 l特殊染色和分析可以酌情延迟发放报告时 间 l有特殊情况时要及时与被检人和送检单位 取得联系 l每年的诊断失败率不超过2 外周血淋巴细胞染色体 (植物血凝素刺激)检查(2) lG显带染色体标本应达到320条带的分辨率 l外周血染色体分析标准 l计数：至少计数20个细胞，记录任何观察到 的染色体数目或结构异常。对可能有性染色 体异常病例的标本，至少计数30个细胞。 l分析：分析5个细胞，所分析细胞的染色体 分辨率应达到320条带水平 l核型分析：2个细胞，如果标本中发现有一 个以上的细胞克隆，则每个克隆核型分析一 个细胞 产前诊断实验室的一般要求(1) l至少应建立两个独立的培养系统并分别 置于不同的培养箱中 l除了经皮脐血管穿刺获取的脐血标本外 ，其他标本应有备份培养以备进一步研 究所需 l如果需要对父母的染色体进行分析以助 于鉴别胎儿染色体异常或异态性，应由 同一个实验室进行上述分析 产前诊断实验室的一般要求(2) l诊断失败率不应超过2 l应尽可能明确所有诊断失败的原因 l诊断失败的记录以及相应整改措施的记录 至少应保存一年 l除了经皮脐血管穿刺获取的脐血染色体分 析，90%以上的最终结果应在从接收到标 本之日起28个工作日之内完成并发出正式 报告，除非需要进行进一步的研究 产前诊断实验室的一般要求(3) l不能达到上述标准的实验室应将病人 转送到其他产前诊断实验室。 l 对异常诊断结果应尽可能进行细胞遗 传学随访，以对产前诊断结果进行确 认 羊水细胞染色体分析(1) l培养瓶法： l计数：至少计数在2个以上独立培养的培养 瓶中平均分布的20个细胞，记录任何观察 到的染色体数目或结构异常 l分析：至少分析在2个以上独立培养的培养 瓶中的5个细胞，所分析的细胞的染色体分 辨率应达到320条带水平 l核型分析：2个细胞，每个独立的培养瓶各 l分析一个细胞 羊水细胞染色体分析(2) l原位法： l计数： l至少计数在2个以上独立培养的器皿中平均分布 的15个 l细胞集落中的15个细胞，一个集落计数一个细胞 l如果没有15个集落，则至少计数10个集落中的15 个细胞 l记录任何观察到的染色体数目或结构异常 l分析：至少分析在2个以上独立培养的培养器皿 中 的5个 l细胞，所分析的细胞的染色体分辨率应达到320 条带水平 l核型分析：2个细胞，如果发现有一个以上的细 胞克隆， l则每个克隆核型分析一个细胞 绒毛细胞染色体分析(1) l一般要求 l不建议使用直接法(未培养)染色体制备方 法； l建议采用培养法(定义为培养时间在48小 时以上)染色体制备方法； l最终的书面报告应是绒毛细胞培养的方法 绒毛细胞染色体分析(3) l培养法 l计数：至少计数在2个以上独立培养的培养 瓶中平均分布的20个细胞，记录任何观察到 的染色体数目或结构异常 l分析：至少分析在2个以上独立培养的培养 器皿中的5个细胞，所分析的细胞的染色体 分辨率应达到320条带水平 l核型分析：2个细胞，如果发现有一个以上 的细胞克隆，则每个克隆核型分析一个细胞 脐血细胞染色体分析标准 l计数： l至少计数在2个以上独立培养的培养瓶中 平均分布的20个细胞，记录任何观察到 的染色体数目或结构异常 l分析： l至少分析在2个以上独立培养的培养器皿 中的5个细胞，所分析细胞的染色体分辨 率应达到相应标准 l核型分析： l2个细胞，如果发现有一个以上的细胞克 隆，则每个克隆核型分析一个细胞 细胞遗传学检查报告(1) l细胞核型分析记录及染色体异常的命名法 ：采用ISCN l995或ISCN 2005均可 l最终书面报告应包括以下信息： l一般信息：患者姓名、年龄、标本采集日 期、实验室收到标本日期、实验室编号、 标本的唯一编号、送检医师的姓名 l检查内容的报告应包括：产前诊断指征； 细胞培养的方法；显带方法、染色体分辨 率；对所分析细胞的现行ISCN命名；除非 有明确胎儿性别的医疗指征，不得报告胎 儿性别；应标注实验室结果报告的局限性 。 细胞遗传学检查报告(2) l至少应由两个有资质的人员对细胞进行分析 和评估 l对结果的解释应包括：和临床信息之间的关 系；对结果的意义的讨论；应建议进行进一 步的遗传咨询 l实验室信息应包括：实验室名称、技术员姓 名、签发报告的实验室负责人姓名和签名 l对正常核型的报告：G显带染色体320条带 水平未见异常 l对异常核型的报告：按ISCN(1995)或者 ISCN(2005)书写和描述，并建议遗传咨询。 产前诊断病历资料存档及标本保存 l产前诊断病历含术前相关检查登记，知情同意书、细胞 遗传学分析实验记录合并入病历中，存入产前诊断档案 保存，保存期限20年以上 l细胞培养及染色体标本制备的实验记录按实验室工作日 志保存档案，保存期限5年以上 l 用于诊断性实验的玻片保存期限有限，如果是永久性的 显带方法(G一，C一，R一带)，玻片宜保存两年。 l荧光染色体的染色体玻片的保存时间由实验室主任决定 。 l 各个实验室应制定相应的方案以确保在获得足够的能够 完成所要求的分析所需的中期分裂相细胞之前，要保存 有部分原始标本、细胞培养物或细胞沉淀物。 l每个产前诊断病例至少有2个细胞的核型图像照相记录并 永久保存电子版或者相片。 产前诊断病例的追踪和随访 l对产前诊断核型异常的病例应进行随访 l尽可能了解胎儿的发育情况和妊娠结局 l将随访结果记录在产前诊断病历中 l尽可能明确染色体核型和临床表现之间 的关系 胎儿标本的运送 l根据国家具体法律规定，只有具有产前 诊断资质的医务人员在具有产前诊断资 质的医疗机构才能够进行介入性产前诊 断的取材手术 l只能让患者到具有产前诊断资质的医疗 机构进行取材 l不能够在无产前诊断资质的医疗机构取 材后再将标本转运到产前诊断单位 l本标准中不涉及到标准寄送或转运问题 染色体标本分辨率标准编制说明 l标准中提出G带染色体标本应达到320条带 的分辨率 l按照ACMG标准，对于智力低下、出生缺 陷、畸形和反复流产的夫妇等病例应尽量 达到550条带水平 l在实际工作中要将外周血淋巴细胞染色体 显带水平达到550条带水平比较困难 l本标准的制定原则是略高于最低标准，目 前不对上述特殊病例的 要求做强制规定。 染色体带水平判断标准 染色体400条带水平550-600条带水平 7q 2条深染带每条深染带分成2条小深染 带和1条浅染带 10q 3条深染带，其中 最上面1条最深 最上面的1条深染带分成2条 小深染带和1条浅染带 11p 2条深染带相互靠 近 2条深染带清晰分开，近臂 末端处出现1条小深染带 Xp 1条深染带分成2条小深染带，两带之 间出现1条浅染带，最上面 的1条深染带染色最深 产前羊水细胞诊断中嵌合体的处理 l据统计，产前羊水细胞诊断的嵌合体发 生率在3.4%-8.6之间。属胎儿真性嵌合体 仅占0.3%。 l嵌合体中含染色体畸变的细胞比例越高 ，表现型就越严重； l嵌合体发生的组织部位会影响其遗传效 应，如果嵌合体局限于脑组织，尽管含 染色体畸变的细胞比例小，确能产生严 重的效果；如果嵌合体局限于胎盘组织 ，通常只引起胎儿生长缓慢。 羊水细胞嵌合体的诊断标准 l出现2种或2种以上的不同的核型 l各种核型都出现在2个或2个以上的细胞 集落 l各不同核型的细胞或细胞集落都来源于2 个或2个以上培养瓶（皿） 羊水细胞嵌合体真实性评估 l水平嵌合体：指异常核型只出现在来自 单个培养瓶的单个细胞或细胞集落。 l水平嵌合体：指同一异常核型出现在来 自两个细胞或细胞集落，但都来自单个培 养瓶。 l水平嵌合体：指两个不同核型分别来自 两个或两个以上培养瓶，且每个培养瓶发 现相同两个或两个以上细胞或细胞集落。 羊水细胞嵌合体真实性评估 l水平嵌合体属真性嵌合体，反映了胎 儿或新生儿的基因组构成。 l水平和水平嵌合体通常多属于假性 嵌合体，并常常发生于体外细胞培养或 染色体制片过程。 异常核型来源说明 lSC（培养瓶法）：来源于单个培养瓶的 单个异常细胞 lSCo（原位培养法）：来源于单个培养皿 的单个异常细胞集落 lMC（培养瓶法）：来源于单个培养瓶的 多个异常细胞（多个异常细胞集落） lMCo （原位培养法）：来源于单个培养 皿的多个异常细胞集落 在发现SC 、MC时临床处理： 羊水细胞培养 绒毛细胞培养 脐血细胞培养 胎儿组织培养 嵌合体必须是对胎儿组织进行培养以最后证实 超声检查是确诊嵌合体的辅助手段 超声超声 在发现SC 、MC时实验室处理 ： l高强度的额外工作（广泛检测）：培养瓶 法，分别从另外两个原始培养瓶分析20个 细胞使细胞总数为50。（原位培养法，从 其它原始培养皿至少分析24个细胞集落） 。 l中等强度的额外工作（中等检测）：培养 瓶法，在初始培养瓶中在分析10个细胞， 使细胞总数为30。如果初始培养瓶中的细 胞数不够，则需收获第三瓶（原位培养法 ，额外分析12个细胞集落）。 高强度额外工作指征 l 以下常染色体三体 l（SC或SCo ，MC 或 MCo ）： l2，5，8，9，12，13，14，15，16，18 ， 20，21，22 l不平衡结构重排（MC 或MCo ）： l标记染色体（MC 或MCo ）： 中等强度额外工作指征 l额外的性染色体（SC或SCo ，MC 或 MCo ） l以下常染色体三体（SC或SCo ，MC 或 MCo ） l1，3，4，6，7，10，11，17，19 l 45,X （MC 或SCo 、MCo ） l除45,X 以外的单体（MC 或SCo 、MCo ） l标记染色体（SC或SCo ） l平衡性结构重排（MC 或MCo ） l不平衡性结构重排（ SCo） 无需额外工作的指针 l 45,X(SC) l平衡性结构重排（ SC或SCo ） l不平衡性结构重排（ SC） l 在着丝粒处断裂从而丢失一臂 （ SC或SCo ） 限制性胎盘嵌合体（一） l产前诊断中发现2%的存活胎儿出现：绒毛 细胞诊断发现异常核型而随后的羊水细胞 或胎儿血染色体诊断的结果正常。 l限制性胎盘嵌合体是一种异常核型细胞只 出现在胎盘组织而不出现在胎儿机体组织 的现象。 l发生机理：主要是合子后体细胞有丝分裂 过程中的染色体不分离。如果染色体不分 离只发生在分化为胎盘组织的细胞系上， 那么含异常核型的细胞就只出现在胎盘组 织里，而胎儿组织细胞核型正常。 限制性胎盘嵌合体（二） l遗传效应：宫内生长发育迟缓、宫内胎 儿死亡、死产 l致病机