转录组水平识别马铃薯耐旱调控关键基因研究.pdf

独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 1.1 研究背景 马铃薯（solanum tuberosum l.）是全球仅次于水稻、玉米、小麦的重要粮食作物1，由于它 高产稳产、适应性广、营养成分全和产业链长而受全世界的高度重视，其种薯及各种加工产品已 成为全球经济贸易中的重要组成部分。马铃薯具有较耐旱、耐寒、耐瘠薄、适应性广等特点，全 国大部分地区的土壤及气候条件都适于种植马铃薯2。目前，我国马铃薯种植面积和总产量均占 世界的 25%左右，可见我国马铃薯的发展潜力很大，尤其是南方冬闲田面积较大。据估计，南方 可用于种植马铃薯的面积在 400 万 hm2以上，发展马铃薯的前景十分广阔2。 植物的生长发育伴随着生物和非生物胁迫的影响，强光、干旱、高盐、冷冻等是限制农作物 产量最主要的非生物胁迫因素3，据统计干旱造成的损失最大，损失量超过其他逆境造成的损失 的总和4，被认为是西北地区农业发展的瓶颈。干旱胁迫是影响马铃薯生长发育的主要逆境因子 之一， 会引起马铃薯植株发生一系列的生理代谢反应， 表现为生理代谢和生长发育的可逆性抑制， 严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡5。因此，国内外对干旱胁迫下马铃薯抗旱分子 机理的研究日益受到重视。 根据水分的供应情况，马铃薯在缺水和足水的自然条件下均能生长，因此，可以说马铃薯是 研究植物抗旱性较为理想的材料。利用其具有较强抗旱性研究干旱胁迫诱导表达基因，对于改良 马铃薯的抗旱性以及选育耐旱品种提供基因资源和理论依据具有重要意义6。近年来，对马铃薯 的抗旱性从外部形态结构到内在生理生化变化等方面多有研究，但对于其在干旱胁迫下耐旱调控 网络途径的关键基因的识别却鲜有报道，构建一个清晰的马铃薯干旱胁迫下的代谢网络途径仍需 要大量的工作。 1.2 植物抗旱分子机理研究进展 干旱胁迫发生时，植物具有对外界环境变化快速感知和主动适应的能力，通过胞间和胞内逆 境胁迫信号的传递和转导，做出积极的应答反应4。这一过程包括以下 3 个环节：一是环境刺激 诱导感受细胞或组织的感知，产生胞间信使；二是通过胞间信使在细胞或组织间传递，最终到达 受体细胞的作用位点；三是胞间信使被受体细胞识别、接受、转导和诱导相关基因表达，最终导 致细胞内做出一系列生理生化的最优化功能组合，使植物表现出对环境刺激或逆境的适应性或抗 性4。因此，通过对干旱胁迫下信号传导网络途径的研究，为深入研究植物抗旱分子机理奠定基 础，对调控植物在逆境胁迫中的生长发育，提高抗旱性具有重要的理论指导意义7。 1.2.1 干旱胁迫信号的感知 最近的研究发现，干旱胁迫信号可能通过以下几种方式被感知和识别8。 （1）干旱胁迫会引起植物细胞缺水，造成细胞质膜收缩，质壁分离的相互“撕扯”引起机械 刺激，最终引发了机械胁迫信号。这种信号可引起细胞内游离 ca2+浓度增加，导致细胞内信号物 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 2 质含量的变化，诱导相关基因表达。 （2）干旱胁迫引起植物细胞跨膜渗透势发生变化，这种干旱胁迫刺激转化成渗透胁迫信号, 从而被“渗透感受器”识别。真核生物的“渗透感受器”是一种多步磷酸化传递的“双组分系统 （two-component systems） ”， 其中有作为感受器的组氨酸蛋白激酶 （histidine protein kinase， hpk） 和反应调节蛋白(response-regulator protein，rr)，以及一个含有组氨酸的磷酸转移结构域 （histidine-containing phosphotransfer domain） ，即 hpt 结构域9。植物通过双组份系统将外界环 境干旱胁迫信号跨膜传递到细胞内，引起相关基因表达，使细胞做出相应的生理生化反应10。 （3）干旱胁迫会影响植物叶绿体对 co2的利用，在强烈的干旱条件下使得光合电子传递的 o2比例相对增加11，形成的 h2o2在金属离子 fe2+或 cu2+的催化下，通过 fenton 型 haber-weiss 反应形成化学性质更活泼、更具伤害性的羟自由基oh。叶绿体是产生活性氧的主要部位，叶绿 素分子在干旱胁迫下，可将羟自由基oh 激发能转移给 o2，而形成破坏性更高的单线激发态氧 1o 2 12；同时在细胞膜上产生 h 2o2，其氧化降解膜脂上的不饱和脂肪酸，引起膜脂脂肪酸配比发 生变化，从而导致膜的通透性发生变化13。活性氧的增多会引起植物的氧化胁迫，从而诱导抗氧 化相关基因的表达。 （4）内源激素是植物抗逆工程中不可缺少的一类蛋白质因子，它所引起的一系列反应，构成 了植物细胞内特定的防御网络途径，如脱落酸、乙烯、多胺等激素在抗逆研究中备受关注8。 1.2.2 干旱胁迫诱导的 aba及其它逆境信号分子 在干旱胁迫中 aba 作为一种主要的根源信号， 植物根细胞中 aba 合成酶基因活性的增高产 生大量的 aba，并通过木质部蒸腾作用流运送到叶片细胞，被保卫细胞上的 aba 受体感知，通 过跨膜运输，由胞内第二信使（钙信使、质子信使、1,4,5-三磷酸肌醇（1p3）等）转导，激活多 种离子通道以及和生理生化反应相关的酶类，调控气孔的运动，最终导致气孔的关闭8。李师翁 等14研究表明，植物在干旱胁迫下产生大量的 aba 诱导过氧化氢（h2o2）和一氧化氮（no）的 生成，二者都是可跨膜的物质，在某些情况下，aba 会调控 h2o2和 no 所构成的两条平行的信 号转导途径，最终引起植物胞质内 ca2+浓度升高，导致气孔关闭以减少水分的散失。mishra g 等 15研究表明，在干旱条件下，aba 可以同时促进开放的气孔关闭和抑制关闭的气孔开放的两个 过程，在气孔关闭过程中，aba、h2o2和 no 可能都参与 mapk 信号途径，aba、h2o2、no 在干旱胁迫下“关系网络”如图 1 所示。 王玮等16研究发现， 干旱胁迫下aba含量的增加也会影响脯氨酸含量的变化， 利用外源aba 处理植物后，在根部与叶片中发现脯氨酸含量的积累，使植物细胞渗透能力增强，抗旱性也随之 提高。 在植物发育系统中，乙烯和多胺也可以作为信号分子。在干旱胁迫的发生时，也能够引起一 系列生理生化反应来调节植物生理状态，以适应恶劣的生长环境。在干旱条件下，植物可通过施 用乙烯利，改善体内水分含量，也可刺激保护物质（如脯氨酸）的积累，其含量的增多不仅可以 稳定细胞膜的结构状态，同时也会加快细胞壁保护物质的填充，增加细胞壁的可塑性17。胡景江 等18研究表明，维持或者提高保护酶的活性是外源多胺提高作物抗旱性的机理之一，能够降低膜 脂过氧化作用对细胞膜造成损伤。 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 3 aba aba 受体 蛋白激酶/蛋白磷酸化酶 h2 ca2+ no 蛋白激酶/蛋白磷酸化酶 离子通道 ca2+ 气孔关闭 图 1 植物保卫细胞中 aba、h2o2、no 信号网络 fig1.the signaling network of aba、h2o2、no in plant guard cells 1.2.3 干旱胁迫信号的转导 植物胞内信号转导是一个通过蛋白质磷酸化和去磷酸化逐级传递放大信号的过程，其中受体 蛋白激酶 rpk（receptor protein kinase）是重要组成部分，位于细胞膜上的 rpk 感受干旱、低温、 高盐以及生长发育等信号，将信号跨膜传递到胞内，直接触发了第二信使系统（ca2+/ip3/cdpk） 传递信息，最终激活了相应的转录因子而诱导特定的基因表达，并引起细胞生理生化过程的改变 4 （见图 2） 。 已经发现一些参与干旱、 低温和高盐等各种信号转导途径的蛋白激酶， 主要有 cdpk （钙依赖蛋白激酶）和 mapk（促分裂原活化蛋白激酶）19两种。 cdpk 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，在干旱胁迫下，cdpk 能够被细胞内 ca2+浓度的 变化激活，通过可逆磷酸化激活底物蛋白，发挥转导信号的作用。cdpk 的底物种类很多，其中 有跨膜运输水分和离子的蛋白， 如液泡膜上的水通道蛋白、 保卫细胞液泡膜上的阴离子通道蛋白、 质膜的内向 k+通道蛋白、质膜 h-atpase 等，通过 cdpk 的信号转导可激活质膜上的水分和离子 通道， 从而有效控制细胞水势， 维持植物细胞稳定的生理作用4。 从拟南芥中克隆到两个依赖 ca2+ 的蛋白激酶基因的 cdna：catcdpk1 和 catcdpk2，northern 杂交结果显示，这两个基因受干 旱或高盐的条件诱导表达20；sheen 等21采用报告基因和效应基因共表达的方法发现，cdpk1 和 cdpkd 能激活干旱胁迫诱导的启动子； sharma 等22研究发现， 水稻基因组的一种 cdpk 能被 干旱、低温或盐胁迫激活，并且干旱和盐胁迫同时作用能够增强 cdpk 基因的表达。 mapk 也是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 包含 3 个级联组分 mapkkks、 mapkks、 mapks。 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 4 上游的mapkkks使mapkks的丝氨酸/苏氨酸发生双重磷酸化， 激活mapkks， 活化的mapkks 接着对 mapks 发生双重磷酸化，最终激活 mapks，特定的 mapks 被激活后，转入细胞核内激 活转录因子，调节相关基因的表达23。ichimura k 等24研究发现 atmpk4 和 atmpk6 是拟南芥 中的 2 种 mapk，干旱、冷害等逆境胁迫下，它们在不同的级联反应中起作用。在真核细胞内， mapk 级联反应途径在介导生长因子、激素反应、细胞增殖和分化以及在介导胞外环境胁迫信号 和调节胞内胁迫反应中起重要作用25。 生物胁迫，风害 干旱，高盐 冻害 信号感知 信号转导 ja aba 生物合成 aba 独立的途径 myb2，myc2 nac areb/abf nac dreb2 dreb1/cbf 转录因子 (myb/myc) (rd26) (bzip) hdzip (ap2/erf) (ap2/erf) 顺式作用元件 mybrs/mycrs abre dre/crt (yaacr,canntg) (acgtggc) (g/accgac) 基因表达 rd22 gly rd29b erd1 rd29a 基因功能 参与胁迫反应的基因产物 胁迫反应 图 2 干旱胁迫下植物信号转到途径及基因转录表达调控网络（kazuo shinozaki 等.2007） fig2.the regulatory networks of plant signal transduction pathways and gene transcriptional expression 1.2.4 干旱胁迫信号诱导基因表达 干旱胁迫信号的感知和转导激活了一系列蛋白激酶，最终导致相关转录因子（trans-acting factor）量的增加以及活性的增强，并和顺式作用元件（cis-acting elements）相互作用，诱导基因 表达8。干旱胁迫下诱导表达的基因包括两类：第一大类是功能蛋白基因，主要包括水通道蛋白、 渗透调节大分子物质（如蔗糖、脯氨酸和甜菜碱）合成酶、膜蛋白结构和功能的保护蛋白（如 lea 蛋白、抗冻蛋白、分子伴侣、mrna 结合蛋白等） 、蛋白转移酶以及脱毒蛋白酶等，其编码 的产物在植物抗旱过程中起直接保护作用；第二大类是调节蛋白基因，如蛋白激酶、转录因子、 磷脂酶等，其编码的产物在信号转导和基因表达过程中起调节作用，这类蛋白是通过参与到植物 胁迫信号转导途径或通过调节其它效应分子的表达和活性而起作用的8。shinozaki k26通过对拟 南芥 aba 缺陷突变体和 aba 不敏感突变体的研究发现，干旱胁迫的基因表达存在着依赖 aba 和不依赖 aba 途径两种途径。 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 5 1.2.4.1 依赖依赖 aba 的途径的途径 在干旱胁迫下依赖aba的基因表达有两种途径： 一是植物在干旱胁迫下的生理生化变化主要 是逆境胁迫信号激发aba合成酶的活性，从而促使内源aba水平显著增加。内源aba通过aba 受体被细胞感知，触发cadpr/ip3第二信号传递系统使胞内ca2+浓度升高，引发mapk磷酸化/去 磷酸化反应而传递信息，然后激活某些转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合从而诱导 特定功能基因的表达27。 另一途径是aba通过促进具亮氨酸拉链结构域的调节蛋白bzip （leu-zip motif）和具有acgt或g盒的aba保守顺式作用元件abre（aba responsive element）特异结合， 诱导抗旱功能基因的表达25。 1.2.4.2 不依赖不依赖 aba 的途径的途径 干旱胁迫信号被细胞膜上“渗透感受器”感知，不需要aba介导，直接触发第二信号传递系统 （ca2+/ip3/capk磷酸化和去磷酸化反应）传递信息，最终激活相应的转录因子而导致特定的基 因被诱导表达27。dre元件是近年来植物抗逆基因工程研究最具突破性的发现，目前已分离出结 合drei启动子63bp区域的3个cdna克隆，如catgtg模序，其中cdna克隆编码的蛋白包括nac 转录因子，tran l p28利用酵母单杂交系统分离出与rps1-like序列结合的包含一个同源结构域 的锌指同源结构域转录因子（zf-hd） ，转nac和zf-hd蛋白的拟南芥在逆境下可诱导dre1基因 的表达。刘强等29从拟南芥中分离到5个编码ap2/erebp类转录因子的基因，分别属于dreb两 个亚家族，命名为dreb 1a、dreb 1b、dreb 1c和dreb 2a、dreb 2b，深入研究了与dreb 基因相结合的dreb蛋白质发现， 在冷害诱导的基因表达中dreb1发挥作用， 而dreb2则在高盐、 干旱胁迫的基因表达中发挥作用。 1.2.4.3 干旱胁迫基因的转录后调控及交互作用干旱胁迫基因的转录后调控及交互作用 高等植物干旱胁迫诱导基因表达调控的研究主要集中在转录水平上进行，但是也存在着转录 后调控。rna 拼接、加工及转移，mrna 稳定性及翻译效率，蛋白质的翻译后修饰，酶活性及 蛋白质降解速度等被认为是转录后水平调控主要方面30。hao li min 等31研究表明，转基因植 物中过量表达 dreb2 不能提高植物的抗旱能力， 由此说明 dreb2 蛋白需要翻译后修饰才能够被 激活表达。何军贤等32,33在研究干旱胁迫对光系统 ii 的影响中发现，干旱胁迫明显降低 psba、 psbd 基因 mrna 的稳定状态，这些均说明一些干旱胁迫应答基因的表达调控也会发生在转录后 水平。 iuchi s 等33研究结果表明干旱胁迫能够诱导 mmk4 基因转录效率的提高， 同时促使 mmk4 蛋白的积累， 可见 mmk4 基因在翻译后水平和转录水平上均受干旱胁迫信号因子的调控。 从干旱 胁迫信号的感知出发，分析其转导途径，利用上游转录因子的调控以增强植物抗旱性已成为抗旱 基因工程研究的重点7。 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 6 1.3 转录组水平识别植物组织或细胞特异表达基因研究进展 分离和克隆差异表达基因对于揭示植物的生命活动规律，进行植物的种质改良、抗逆和抗病 等研究具有重要的理论指导意义 34。目前识别和克隆差异表达基因的方法很多，主要为两类：基 于 pcr 和基于分子杂交的方法，一些相关方法己成功运用于植物病理、胚胎发育、形态发生、信 号转导、抗逆和抗病等众多领域，并成功地分离了一些特异性表达基因 34。 1.3.1 cdna 扩增片段长度多态性 基于 pcr 的方法包括较早的 cdna-aflp，cdna-rda 等，还有 ssh，cdna microarray， sage，ssh，tsh 和 rna-seq 等。cdna 扩增片段长度多态性（cdna-amplified fragment length polymorphism，cdna-aflp）法结合了 rt-pcr 和 aflp 技术，分析植物 mrna 表达差异，其 基本原理为以纯化的 mrna 为模板， 反转录合成 cdna， 用识别序列分别为 6 个碱基和 4 个碱基 的两种限制性内切酶酶切双链 cdna，酶切片段与接头相连后，利用与接头序列互补的引物序列 进行预扩增，再在引物 3末端加 3 个左右选择性碱基进行选择性扩增 35。目前该方法在分离植 物特异表达基因， 以及抗病育种和金属离子对植物的作用方面均有较成熟的研究报道。 hubank36 提出了 cdna 代表性差异分析法（cdna-representational difference analysis, cdna-rda），该方 法主要用于分析比较具有相近遗传背景， 但是表型不同的两组 cdna 之间的差异， 对于如果 cdna 之间存在较大差异，此方法难以分离到差异表达基因。 1.3.2 cdna 微阵列 cdna 微阵列（cdna microarray）是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合 成等技术， 在固相表面固定成千上万个寡核苷酸探针， 或将液相中的探针点样于尼龙膜或硅片上， 与放射性同位素或荧光物标记的 dna 或 cdna 进行杂交的技术37。目前该方法已广泛用于监测 组织细胞基因表达水平的差异、识别疾病相关基因等研究领域。但寡核苷酸探针全部依据功能已 知的基因设计，各类依据 dna 微阵列的基因表达研究工具不能识别细胞或组织表达、且功能未 知的转录子。 1.3.3 抑制消减杂交 抑制消减杂交 （suppression subtractive hybridization, ssh） 技术是目前最常用的一种分离组织 细胞中差异表达基因的方法，其原理是以抑制性 pcr 为基础的 cdna 消减杂交技术，通过两种 不同的接头，选择性地扩增差异性表达的 cdna 片段38。通过 ssh 方法，识别了组织病变、发 育过程、代谢信号调控等众多基因；其存在的不足是所用两个内切酶各仅能识别不足 80%的 mrna，有超过 30%的 mrna 在其实验中丢失；另外，此方法耗时过长，实验精度受影响，所 以在几个报道中，其文库筛选的假阳性率高达 90%以上。 1.3.4 转录子消减杂交 基于ssh方法存在的局限性，本实验室结合ssh方法，保留其优点、改善其中的不足而建立 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 7 了器官特异表达基因cdna高识别率的方法，即转录子消减杂交（transcripts subtraction hybridization, tsh） 39。 这种新方法是基于转录水平策略和抑制消减杂交的消减方法建立起来的， 几乎可以消减掉tester和driver中所有的共同序列，可以准确地鉴别tester和driver群体，并可富集 tester中特异表达的cdna序列。 tsh 方法是一种比较和分离遗传背景较近的不同细胞系、 不同组织或同一细胞系同一组织在 不同条件下差异表达基因有效的方法, 也可用于分离不同器官组织之间、个体不同发育阶段以及 受外界因子作用而特异表达的基因等方面的研究39。本实验室39通过 tsh 方法识别了大肠杆菌 质粒存在和非存在状态下特异表达基因，结果显示，质粒携带的 6 个基因全部出现在质粒存在的 大肠杆菌 tsh 文库中。对转录水平上几种主要的基因分离和克隆的方法进行了比较，如表 1 所 示。 表 1 转录水平上基因识别和克隆方法比较 table 1 comparison of several gene isolation methods on the transcriptional level 技术 优点 缺点 cdna-aflp cdna-rda cdna microarray sage ssh tsh 1.低成本 2.简单易行 1.低成本，简单易行 2.阳性较高 3.可用于非 poly(a)结尾的 mrna 的检测 1.高度自动化 2.易分析待分析的转录本 3.务须已知基因序列信息 4.灵敏度高 1.对低丰度表达基因有较好 检测效果 2.成本低 1.阳性率较高 2.灵敏度较高 3.结果易于分析 1.阳性率高 2.覆盖全部转录子 3.灵敏度高 1.假阳性高 2.转录组覆盖有限 3.需要较大的参考数据库 1.需要高质量的 cdna 2.受限于序列的相似性 1.存在交叉杂交信号干扰 2.成本高 3.只适用于少数物种 4.未能覆盖全部转录子 1.操作繁琐 2.结果分析数据庞大 1.受限于存在的酶切位点，未能覆盖全部 转录子 2.耗时长 1.连接效率有待提高 2.功能未知基因影响结果分析 1.4 本研究的目的和意义 本研究的目的在于通过tsh法识别马铃薯耐旱调控相关的特异基因，并对其表达展开研究， 推测马铃薯耐旱调控网络形成的代谢途径，初步识别耐旱调控关键基因。 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 8 本研究对从分子水平上阐明马铃薯抗旱代谢及调控的网络途径、获得抗旱基因重组、创新抗 旱育种新种质等方面有重要意义。 1.5 研究内容及技术路线 1.5.1 研究内容 （1） 以非耐旱基因型n4和耐旱基因型ld两种不同耐旱性表型的马铃薯缺水处理和对照生长 条件下幼叶和幼根为实验材料，利用trizol法分别提取总rna； （2）比较ld和n4缺水处理和对照叶与叶基因的差异，建立正向和反向tsh文库，构建耐旱 消减表达谱； （3）通过菌落pcr鉴定，挑选部分阳性结果进行测序筛选，经生物信息学软件分析，去除 载体和冗余序列，获得高质量unique est； （4）将一些代谢相关的酶类或者蛋白质以及部分未知蛋白的est经反向northern斑点杂交进 一步筛选，半定量rt-pcr对筛选结果进行表达分析，获得马铃薯耐旱调控相关的特异est； （5）参考相关文献报道推测马铃薯耐旱调控网络形成的可能代谢途径假说，并初步识别马 铃薯耐旱调控途径的关键基因。 1.5.2 技术路线 技术路线如图 1-3 所示。 宁夏大学硕士学位论文 第一章 引言 9 图 1-3 转录组水平识别马铃薯耐旱调控关键基因的技术路线图 生物信息学软件分析 高质量 unique est 序列 tsh 文库 幼叶 获得马铃薯耐旱调控相关的特异 est 推测出耐旱调控网络形成的代谢途径 初步识别马铃薯耐旱调控代谢途径的关键基因 tsh 法 反向 northern 斑点杂交 半定量 rt-pcr 参见相关文献报道 菌落 pcr 鉴定，测序 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 10 第二章 tsh文库的构建 tsh文库是指通过本实验室建立的tsh方法构建的转录子消减 cdna文库。tsh消减 cdna 文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如不同基因处理细 胞系或植物的近等基因系等）提取总rna ，经连接头及反转录后合成 cdna，在一定条件下用过 饱和不含目的基因的一方作为驱动子（driver）与含有目的基因的试验方（tester）进行杂交，选 择性的消减两部分共同基因cdna杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分富 集后，并连接到载体构建文库。转录子消减 cdna文库可用于克隆不同组织或同一组织在不同生 理或者病理状态下表达有特异的基因39。 本部分研究以缺水处理和对照生长条件下两种不同耐旱性表型的马铃薯（非耐旱基因型n4 和耐旱基因型ld）叶为材料，通过构建tsh cdna文库，获得马铃薯耐旱消减表达谱，从而为研 究马铃薯耐旱调控的网络途径奠定基础。 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料、菌株、载体 马铃薯品种：宁夏固原市泾源县马铃薯种质研究基地的非耐旱品种“n4”和耐旱品种“ld”幼 叶、幼根为实验材料； 试验因子及处理设定 试验水平 土壤相对含水量（srwc） 表示 缺水 10% w 受体菌株 dh5a 由本实验室保存；pgem-t easy 载体购自 promega 公司。 2.1.2 试剂与仪器 2.1.2.1 主要试剂主要试剂 my 接头由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；rnaes h、t4 polynucleotide kinase、 ciap （25u/l） 、 t4 dna ligase、 购自 takara 公司； 反转录试剂： dntp （10mmol/l） 、 rna inhibitor （20u/l）购自 takara 公司，mlv（5u/l） ，购自 promega 公司；pcr 试剂：dntp mixture （2.5mm each） 、10la pcr buffer（mg2+ plus） 、la taq dna polymerase（5u/l）购自 takara 公司，my 上下游引物（1ug/l）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；pcr 回收试剂盒 wizard sv gel and pcr clean-u system、 pgem-t easy 购自 promega 公司； 胰蛋白胨 （tryptone） 、 酵母提取物（yeast extract）为 oxoid 产品；nacl、琼脂粉为北京化学试剂公司产品；rna 提取 试剂 trizol 试剂盒购自 invitrogen 公司； 氨苄青霉素 （amp） 购自上海求德生物化工公司； iptg、 x-gal 购自 takara 公司。 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 11 2.1.2.2 主要仪器主要仪器 pcr 仪（德国 eppendorf 公司） ，高速冷冻离心机（意大利 alc 公司） ，dsx-280a 不锈 钢手握式灭菌器（上海中安医疗器械厂） ，tgl-16m 高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器 有限公司） ，凝胶成像仪（blo-rad laboratories-sagrate ltaly 公司） ，uv-2102pc 型紫外可见分 光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司） ，mdf-382e 超低温冰箱（日本 sanyo 公司） ，al104 电 子天平 （mettler toledo 仪器上海有限公司） ， yds-15 液氮生物容器 （成都液氮容器厂） ， hc-tp11-2 架盘药物天平（上海精科天平公司） ，nn-s529wfs national 微波炉（上海松下微波炉有限公司） ， dhx-9272b 型电热恒温培养箱（上海福码设备有限公司） ，sw-cj-1f 洁净工作台（苏州安泰空 气技术有限公司） ，dycp-31b 型电泳槽，空气浴恒温振荡培养箱（哈尔滨东明公司） ，智能光照 培养箱 gxz-50a（宁波江南仪器厂） 。 2.1.3 实验中所用溶液、缓冲液、培养基 具体配方见附录。 2.2 实验方法 2.2.1 trizol 法提取幼叶和幼根总 rna 整个操作要在冰上及超净工作台中进行，必须多次更换一次性手套。 （1）打开超净工作台中的紫外灯，照 20min 以上； （2）取 24g 幼叶材料用液氮速冻，在研钵中磨成粉末； （3）将冻粉分装入预冷的 1.5ml depc 水处理的 eppendorf 管中，立即加入 1ml trizol 提 取液，吹打均匀，15-30孵育 5min； （4）每 1ml trizol 加入 0.2ml 氯仿，上下颠倒混匀 15s，15-30孵育 2-3min； （5）2-8，12000g 离心 15min； （6）转移水相于新的 eppendorf 管中（约为 600l） ，加入 0.5ml 异丙醇（每 1ml trizol 加入 0.5ml 异丙醇） ，15-30孵育 10min； （7）2-8，12000g 离心 10min，去上清； （8）用 1ml75%乙醇洗涤沉淀，上下颠倒，2-8，7500g 离心 5min； （9）去上清，室温放置 5-10min 干燥沉淀，勿太干，可在-80长期保存； （10）将沉淀溶于 1050l 无 rnase 水或 te 溶液中； （11）取 3l rna 溶液上胶电泳，用凝胶自动成像仪观察染色后的电泳凝胶； （12）取 1l rna 溶液在核酸检测仪上测定其纯度（1.8od260/od2802.0）及浓度（ng/l） 。 2.2.2 水平 tsh文库的构建 2.2.2.1 my 接头的处理反应接头的处理反应 取一个 0.2 ml eppendorf 管，加入 15l 10um my 接头，95变性 2min，55退火 3min， 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 12 降至常温，-20保存。 （全过程可在 pcr 仪中进行） 2.2.2.2 接头磷酸化反应接头磷酸化反应 取一个 0.2ml eppendorf 管,依次加入以下试剂： 10t4 dna polynucleotide kinase buffer 2.5l atp（2mm） 12.5l my 接头（10m） 3l（150pmol） t4 polynucleotide kinase（10u/l） 0.5l 补 ddh2o 至 25l 37温育 30min，-20保存。 2.2.2.3 rna 5端去磷酸化反应端去磷酸化反应 （1）取一个 0.2ml eppendorf 管，加入 10l 10t4 dna ligase buffer（ph 7.6）用 5m koh 调 ph 约为 9.0； （2）取一个 0.5 mleppendorf 管，依次加入以下试剂： rna 12g 10 t4 dna ligase buffer（ph=9.0） 2.0l ciap（25u/l） 0.5l 补 dd h2o 至 10l 50温育 30min，70变性 15min，冰浴后离心数秒。 2.2.2.4 dnase i 消化消化 rna 中混有的中混有的 dna 在以上溶液中继续加入： rnase inhibitor（40u/l） 0.1l dnase （rnase-free，5u/l） 0.4l 37温育 2030min，70变性 15min，冰浴后离心数秒。 2.2.2.5 第一次连接头反应第一次连接头反应 在以上溶液中继续加入: 2 mm atp 0.5l my 接头（10m） 1.0l 70变性15min， 冰上急冷2min以上， 离心数秒使混合液聚集于管底， 继续加入0.5l t4 dna ligase（350u/l） ，16过夜反应。 2.2.2.6 rna 反转录反应反转录反应 将上述溶液 70，15 min，冰浴后离心数秒加入： dntp mixture（10mm each） 0.5l rnase inhibitor（40u/l） 0.25l 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 13 m-mlv rt（200u/l） 1l 42温育 1h，70变性 15min，冰上急冷 2min 以上，离心数秒。 2.2.2.7 rnase h 消化杂链（消化杂链（rna-cdna）中）中 rna 的反应的反应 继续加入： rnase h（60u/l） 1l 30温育 1h，70变性 15min，冰上急冷 2min 以上，离心数秒。 2.2.2.8 rna 过饱和法杂交反应过饱和法杂交反应 继续加入： 总 rna（另一样品） 3g 反应条件： 95 30sec 70 30min 60 15min 50 15min 4保存。 2.2.2.9 rnase a 消化杂交反应产物消化杂交反应产物 继续加入： rnase a（10mg/ml） 1.5l 37温育 3060min； 继续加入： 等体积的酚：氯仿（25:24） ，充分混匀后，4，13,000rpm 离心 15min，小心吸上清，转移 至新离心管， 加入 1/10 量的 3m naac （ph5.2） ， 2.5 倍量的冷无水乙醇， -20放置 3060min； 4， 13,000rpm 离心 15min，弃上清，将沉淀室温干燥。 2.2.2.10 hae iii 酶切酶切 rna-cdna 的反应的反应 在上述 eppendorf 管中，依次加入以下试剂： ddh2o 8.5l 10m buffer 1.0l 70，15 min，冰浴后离心数秒，再加入 hae iii（10u/l） 0.5l 37温育 2h 30min； 继续加入：1l（1/10 量）的 3m naac（ph5.2） ，25l（2.5 倍量）的冷无水乙醇，-20放 置 3060min，离心回收沉淀，干燥。 2.2.2.11 t4 dna ligase 在在 cdna 末端加末端加 my 接头反应接头反应 继续加入： ddh2o 5l my 接头（10m） 1l 混匀，静置 5min，继续加入： 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 14 10t4 dna ligase buffer 1l dd h2o 2.5l 70变性 15min，冰上急冷 2min 以上，离心数秒使变性液聚集于管底； 继续加入： t4 dna ligase（350u/l） 0.5l 16过夜反应。 2.2.2.12 pcr 扩增目的扩增目的 cdna （1）pcr 反应体系 取一个 0.2 ml eppendorf 管，依次加入以下试剂： 10la pcr buffer 2.5l dntp（2.5 mm each） 2.0l myf（10 m） 1.0l myr（10 m） 1.0l cdna 2.0l la taq 聚合酶 0.25l 补 ddh2o 至 25l （2）反应条件： touchu-up pcr，12 圈 pcr 95变性 30 sec，55退火 45 sec，72延伸 2.5 min，每个退火温度循环 2 圈，每四圈上升 一度，退火温度从 55升到 60，反应共 12 个循环，72延伸 10 min，4保存。 2.2.2.13 目的片段回收与纯化目的片段回收与纯化 用 promega 胶回收试剂盒（wizardsv gel and pcr clean-up system）回收 pcr 产物。 具体步骤如下： （1）取一个 1.5 ml eppendorf 管，记录装胶前后的重量； （2）配制 1.0 % 琼脂糖凝胶，待 pcr 产物完全跑开时进行切胶回收； （3）将胶上除了引物二聚体外的全部 pcr 产物挖出并置于新的 1.5 ml 离心管中； （4）加入结合液（membrane binding solution ） ，每 10mg 胶加 10l 结合液； （5）溶胶，65水浴约 10min，待其完全溶解后转移至柱上； （6）室温 1 min 温育，14000rpm 离心 1min，弃液； （7）加 700l 的洗脱液（membrane wash solution） ，14000rpm 离心 1min，弃液； （8）加 500l 的洗脱液（membrane wash solution） ，14000rpm 离心 5min，弃液； （9）14000rpm 离心 1min； （10）将柱子置于一个新的离心管上，加 25l nuclease-free water，室温放置 1 min，14000rpm 离心 1min，要收集液。 2.2.2.14 目的片段与目的片段与 pgem-t easy 载体的连接载体的连接 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 15 将 pgem-t4 easy 载体置冰上融化，避免反复冻融，取一个 0.5ml eppendorf 管，依次加入 以下试剂： 2t4 dna rapid ligation buffer 5.0l dna 回收片段 3.0l pgem-t4 easy vector（50ng/l） 1.0l t4 dna ligase（3u/l） 1.0l total 10l 反应条件：16反应过夜。 2.2.2.15 连接产物转化感受态细胞连接产物转化感受态细胞 （1）大肠杆菌(e.coli)dh5a 感受态细胞的制备(cacl2法) 用划线法将保存的 dh5a 菌种在 lb 固体培养基（无抗生素）平板上划出单菌落，37培 养过夜（1620h） ； 挑一 dh5a 单菌落接种到 5ml lb 新鲜液体培养基（无抗生素）离心管中，37 150r/min 振荡培养过夜； 次日取 500l（1%的接种量）加到 50ml 新鲜 lb 液体培养基（无抗生素）三角瓶中， 37 130r/min 剧烈振荡培养 23h 至其 od600为 0.40.5 之间； 将菌液转移到预冰冷的 50ml 离心管中， 置于冰浴中 20min， 于 4， 4,000rpm 离心 10min； 弃上清，将离心管倒置 1min 以使残留的培养基流尽； 将每份沉淀各加 10ml （10ml/50ml 培养液） 0.1mol/l 冰冷的 cacl2溶液， 轻缓重悬细胞， 于冰上放置 30min； 4000 rpm，4离心 10 min 收集菌体，用预冷的 2 ml 0.1 mol/l cacl2悬浮，置于 4冰箱 中备用（1224 h 内转化效率最高） ，或者加入 15%20%甘油，每 200 l 分装，-70保存备用。 （2）质粒 dna 转化大肠杆菌 在制备好的感受态细胞中加入待转化的质粒 dna 或回收产物 5 l，轻轻混匀，冰浴 30 min； 将离心管放到 42的循环水浴中热激 90 sec； 快速将离心管转移到冰浴中,使细胞冷却 34 min； 每管加 800 l lb 液体培养基，置于转速小于 225rpm 的摇床上，37振荡培养 45 min； 吸出 200l 摇好的培养液涂布到含相应抗生素的 lb 固体培养基上，用无菌的弯头玻璃 棒将菌液涂满整个平板表面； 室温放置 20 min，待菌液完全吸收后，倒置平板于 37培养箱，1216 h 可出现菌落。 2.2.2.16 重组质粒的蓝白斑筛选重组质粒的蓝白斑筛选 （1）在一事先制备好的含抗生素的 lb 固体琼脂平板上加 40 l x-gal 储藏液（以 20 mg/ml 的浓度溶于二甲基加酞胺中） 和 10 l 异丙硫代-d 半乳糖苷 （iptg） 溶液 （浓度为 200 mg/ml） ， 用无菌的弯头玻璃棒将其均匀地涂布于整个平板表面，置于 37培养箱使其充分吸收； 宁夏大学硕士学位论文 第二章 tsh 文库的构建 16 （2）取下层 200l 转化混合液加到含 amp 的 lb 固体平板上（对照取 100l） ，用涂棒轻轻 将其均匀涂开； （3）用报纸包好平板，取出超净工作台，放置 3060min，待平板表面干燥后，倒置平板， 37倒置培养 1216h； （4）于 4将平板放置数小时，使蓝色充分显现，带有 -半乳糖苷酶活性蛋白的菌落中间为 淡蓝色，外周为深蓝色，白色菌落偶尔也在中央出现一个淡蓝色斑点，但其周围无色。 2.3 结果与分析 2.3.1 rna 提取结果 2.3.1.1 rna 的浓度与纯度测定的浓度与纯度测定 分别取 n4 和 ld 缺水处理和对照生长的幼叶 23g 液氮研磨，用 trizol 法提取总 rna，将 提取的总 rna 经紫外分光光度仪读出其纯度和浓