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转基因苜蓿研究进展摘要：苜蓿是世界重要牧草作物，它既可以作为重要的饲料来源，又能起到保护生态环境的作用。本文概述了转基因技术在苜蓿抗逆性、抗病虫害、抗除草剂、品质改良以及新化合物生产等方面的研究进展，并对其限制因素作了一些分析。关键词：苜蓿；转基因苜蓿是世界重要牧草作物，在我国已有两千多年的栽培历史，且是我国栽培最广的豆科牧草。它具有适应性强、适口性好、营养丰富等优良品质，其营养价值居各种牧草之首，素有“牧草王”之美誉。苜蓿既可以作为重要的饲料来源，同时又可以改良土壤、防止水土流失，起到保护生态环境的作用。随着现代生物技术的日新月异，采用基因工程技术将外源基因人工整合到受体基因组中，从而获得转基因植物已成为可能，并得到越来越广泛的应用。本文旨在综述转基因技术在苜蓿抗逆性、抗病虫害、抗除草剂、品质改良以及新化合物生产等方面的研究进展情况，并分析其应用发展中的一些限制因素，以供大家参考。一、转基因苜蓿常用方法获得转基因苜蓿有多种方法，但生产中最常用的是通过根瘤农杆菌介导转化，因为通过其转化的外源基因表达要比通过电击转化等方法更稳定。根瘤农杆菌是自然存在于土壤中的一类细菌，它能引起许多双子叶植物的根瘤病害（亦称冠瘿病）。其致病原因是由于细菌通过伤口进入植物体，细菌染色体外的遗传物质，即ti质粒中的一个片段，转移到植物细胞内，进而整合到植物染色体组中并稳定维持。随着染色体的复制，致病基因表达导致形成肿瘤。所转移和整合的dna（t-dna）含有编码合成两种生长剂（生长素和细胞分裂素）以及一类氨基酸衍生物（冠瘿碱）的基因，合成的代谢物被农杆菌作为食物源。科学家们利用这一自然过程，用转化基因代替诱导根瘤产生的基因来获得转基因苜蓿（riva，1998）。二、转基因苜蓿研究进展1.抗逆性1.1 耐寒诸如干旱、寒冻、洪水等环境压力对苜蓿带来的伤害都会造成氧自由基的增加。一类叫超氧化物岐化酶（sods）的金属蛋白有清除氧自由基、把它们转变为过氧化氢和氧分子的功能。充分表达sod的转基因苜蓿就表现出更好的耐寒性（mckersie等，1999），来年也能减轻二次冻害（mckersie等，2000）。也有研究发现蔗糖能充当增加耐寒性的冷冻保护剂角色，而蔗糖磷酸合成酶（sps）可使碳水化合物从合成淀粉转向合成蔗糖。表达sps基因的苜蓿的田间试验证实了蔗糖含量增加能提高耐寒性（shearer等，2000）。1.2 耐盐土壤盐分是种植的一大问题，特别是在蒸发率较大的炎热地区更是如此。通过灌溉水带来的盐分积聚在土壤表层，削弱了植物吸水能力，从而延缓了植物生长。目前苜蓿的耐盐基因已被确认。公认的转录因子（alfin1）在苜蓿根部可增加耐盐msprp2基因的表达（wincov and bastola, 1999）。充分表达alfin1的转基因苜蓿表现出生长加快和耐盐性提高（winicov, 2000）。1.3 耐铝苜蓿对铝（al）的毒性敏感，它可导致根部发育受阻和低产。在苜蓿染色体上有4个数量性状位点（qtl）与耐铝有关，其中一个位点起主效作用（bouton，1997）。大多数植物的耐铝性与有机酸含量有关（fuente等, 1997; hocking, 2001）。带柠檬酸合成酶基因的转基因苜蓿，因为柠檬酸含量高，就比未转基因的苜蓿表现出更长、生长更佳的根部（rosellini等, 2002）。带苹果酸脱氢酶基因的转基因苜蓿，因为柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和醋酸含量的增加，耐铝性也相应增加（tesfaye等, 2001）。2.抗病虫害2.1 抗真菌植物抗毒素是当植物受外界病原菌侵袭时合成的、具有抗病原菌活性的一类低分子量抗菌化合物。它是植物的第二大代谢物，与苜蓿的广谱抗真菌能力有关（dixon，2001）。充分表达植物抗毒素基因的苜蓿可对一些尚无特效药的病原菌产生抵抗力，试验表明从花生植物抗毒素转基因而成的苜蓿对苜蓿假盘菌（可引起褐斑病）的抵抗力增强（hipskind and paiva, 2000）。同样地，充分表达异黄酮-o-转甲基酶（iomt）的转基因苜蓿对苜蓿假盘菌的抵抗力也增强（he and dixon, 2000）。几丁质和-1，3葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，几丁质酶和-1，3葡聚糖酶分别催化二者的水解反应，从而抑制真菌的生长。试验表明充分表达-1，3葡聚糖酶的苜蓿可减轻大雄疫霉菌（可引起根腐病）感染的严重性（masoud等, 1996）。2.2 抗虫目前已发现并被广泛应用的抗虫基因主要有两类：一类是来源于苏云金芽孢杆菌的-内毒素基因，简称bt毒蛋白基因；另一类是来自高等植物的蛋白酶抑制剂基因，简称pi基因（张智奇等，1996）。苏云金芽孢杆菌对多数鳞翅目（不同的蛾科和蝶科）的幼虫有毒杀作用，对少数鞘翅目（跳甲虫科）或双翅目（蝇科）幼虫也有毒性。bt毒蛋白来自苏云金芽孢杆菌形成芽孢时产生的伴孢晶体蛋白。它在昆虫的肠道中被昆虫蛋白酶在碱性条件下分解成较小的毒性多肽。这种毒性多肽引起消化系统麻痹，昆虫很快停止取食，最后导致昆虫肠壁细胞破坏而死亡（gill等, 1992）。目前bt转基因苜蓿已被用来控制苜蓿象鼻虫和三叶草根象鼻虫（mccaslin, 2002）。另据研究报道，通过插入一种昆虫蛋白酶抑制剂（pi），苜蓿可获得对昆虫的抵抗力。例如表达来自烟天蛾的抗弹性蛋白酶抑制剂的转基因苜蓿能减少蓟马的采食危害（thomas等, 1994）。3.抗除草剂5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（简称epsp合成酶）是真菌、细菌、藻类、高等植物等体内芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的合成酶。草甘膦除草剂施用后被植物迅速吸收,并随同化产物传导至整个植株，通过抑制epsp合成酶阻断了芳香族氨基酸的生物合成，对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质代谢等过程产生影响而导致植物死亡。在大肠杆菌中可找到一种对草甘膦不敏感的epsp合成酶。把这种合成酶转移进苜蓿就可以起到抗草甘膦效果（padgette等, 1995）。当前，此类转基因苜蓿还没有得到商业许可，然而地下交易却在扩大（mccaslin, 2002）。4.品质改良4.1 含硫氨基酸低含量的含硫氨基酸是羊毛生长的主要限制因素。为了改进羊毛生产，富含含硫氨基酸的蛋白编码基因已被转移进入苜蓿（higgins等, 1989）。例如向日葵种子白蛋白基因可增加苜蓿的含硫氨基酸含量，而且把一个内质网状组织保持信号加入转化基因可使向日葵种子白蛋白在苜蓿叶中大量积聚（tabe，1995）。玉米醇溶蛋白（可编码富含含硫氨基酸的种子贮藏蛋白）也被转移入苜蓿，以改善羊毛的品质（bellucci等, 1997; 2001）。4.2 木质素木质素是植物细胞壁的主要结构成分。它支持茎干，但却难于消化。木质素消化性的增加可以改善草料的营养品质。占木质素生物合成主导地位的类苯丙醇合成过程中有几种酶已被用来减少木质素含量或改变木质素成分，二者都可以改进苜蓿的消化性。在木质素生物合成最后阶段起催化作用的苯丙烯盐基乙醇脱氢酶通过反义结构受到功能限制，结果木质素含量没有改变，然而木质素成分却发生了改变（baucher等, 1999）。研究表明，限制咖啡酸-3-o-转甲基酶（comt）或咖啡酰辅酶a-3-o-转甲基酶（ccomt）的功能都可以引起木质素含量降低和木质素成分改变，其中ccomt对苜蓿消化性的改变作用更大（dixon等, 2001）。4.3 缩合单宁缩合单宁是一种重要的植物代谢产物，属多元酚类化合物。作为抗臌胀关键因子，它可与水溶性蛋白质相结合，降低其水溶性，甚至产生沉淀，因此缩合单宁可减少瘤胃中草料蛋白质迅速消化产生的泡沫，从而减少反刍动物臌胀病（tanner等, 1996）。试验表明苜蓿中缩合单宁含量增加可减少蛋白的溶解性（julier等, 2002）。目前从一年生蒺藜状苜蓿和拟南芥（阿拉伯芥）中已分离出缩合单宁基因（sharma等, 2002），这标志着利用基因工程技术预防臌胀病已经起步。5.新化合物生产5.1 酶利用苜蓿生产工业酶的好处在于可以用相对较少的花费得到大量的产品（austin and bingham, 1997）。目前美国农业部和威斯康星大学研究人员，从转基因苜蓿中提取肌醇六磷酸酶（植酸酶），用作非反当动物如鸡、猪的饲料添加剂，使其对磷的吸收提高到42%。从转基因苜蓿中提取这种酶比传统方法或经发酵处理要便宜（koegel等, 1999）。此外，利用苜蓿生产纤维素酶可显著降低把生物体转化为乙醇的成本（ziegelhoffer等, 1999）。5.2 抗体苜蓿也可用来生产诊断用单克隆抗体，如抗人igg抗体（血液中心常用试剂）已通过苜蓿生产，并被证明在功能上与通过杂交瘤生产是一样的，而且抗体含量在再三收割后和烘干干草中均保持稳定（khoudi等, 1999）。5.3 疫苗目前利用转基因技术生产经济有效的可食用疫苗已成为可能。如猪传染性胃肠炎（tge）疫苗已进行生产（tuboly 等, 2000）。肝片吸虫抗原基因也已成功导入苜蓿基因组中（黎万奎等，2003）。三、发展转基因苜蓿的一些限制因素如上所述，虽然转基因苜蓿应用广泛，前景也比较巨大，但其发展中也存在一些技术限制因素：1.基因发现和描述的比例，这是最直接的限制因素。基因发现有数种方法，包括查寻其他种类已知基因的同源性和/或者不同环境条件下的基因表现（miflin，2000）。表达特定性状的基因也可以通过dna标记物来区别。一旦基因被确认，它们就可以被分离或者克隆，然后转入植物并分析其对植物性状表达的效果。2.生物安全问题。在遵从有关政府的规定下，转基因苜蓿要形成商业栽培种需经过数年的田间试验。这主要是考虑到对生态环境和牲畜健康两方面的影响。如转化基因漂移进入近缘杂草就会改变物种间的竞争关系，破坏原有生态平衡；抗病虫害等基因不仅对害虫，对其他有益生物也可能致死；转基因苜蓿进入牲畜体内可能会引起某些过敏反应等等。这些商品化大规模环境释放可能带来的潜在风险也许要经过很长时间才能表现和监测出来。3.知识产权问题。基因工程中采用的许多工具和方法都涉及到知识产权的保护，例如植物促生长剂和选择性标记物等。获得使用许可将花费的代价使得现在开发的都是一些具有高利用价值的性状，对其他性状的研究利用缺乏关注。参考文献：1张智奇，等. 抗虫基因及其在植物上的应用. 吉林农业大学学报，1996，18（1）: 9195.2黄其满，等. 生物技术与苜蓿品质改良. 高技术通讯，2002，3: 101103.3桂枝，等. 我国苜蓿育种的研究进展. 天津农学院学报，2003，10（1）: 3741.4杨青川，等. rapd技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用. 草地学报，2003，11（1）: 2732.5黎万奎，等. 肝片吸虫抗原基因转基因苜蓿再生的研究. 四川大学学报(自然科学版)， 2003，40（1）: 144147.6austin，et al. the potential use of transgenic alfalfa as a bioreactor for the production of industrial enzymes. biotechnology and the improvement of forage legumes，1997，409424.7baucher，et al. down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (medicago sativa l.) and the effect on lignin composition and digestibility. plant mol. biol，1999，39: 437447. 8dixon. natural products and plant disease resistance. nature， 2001，411: 843847.9hipskind，et al. constitutive accumulation of a resveratrol-glucoside in transgenic alfalfa increases resistance to phoma medicaginis. mol. plant-microbe interact，2000，13: 551562. 10hocking. organic acids exuded from roots in phosphorus uptake and aluminum tolerance of plants in acid soils. adv. agron，2001，74: 6397.11julier，et al. effect of condensed tannins on protein solubility in legume forages. the 38th report of the north american alfalfa improvement conference, sacramento, ca， 2731，july 2002. 12khoudi，et al. production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. biotech. and bioeng，1999，64: 135143.13koegel，et al. alfalfa-produced phytase for supplementation of poultry and swine rations. asae-csae-scgr annual international meeting，1821，july 1999.14masoud，et al. constitutive expression of an inducible beta-1, 3-glucanase in alfalfa reduces the disease severity caused by the oomycete pathogen phytophthora megasperma f. sp. medicaginis, but does not reduce disease severity of chitin-containing fungi. trans. res， 1996，5: 313323.15mckersie，et al. iron-superoxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases winter survival without a detectable increase in photosynthetic oxidative stress tolerance. plant phys，2000，122: 14271437.16riva，et al. the agrobacterium tumefaciens gene transfer to plant cell. ejb electronic journal of biotechnology，1998.17sharma，et al. banyuls encodes anthocyanidin reductase act