肝移植相关基础研究进展课件

肝移植相关基础研究 中国活体肝脏移植研究所 南京医科大学第一附属医院肝脏移植中心 俞 悦 主要内容 活体肝移植 二二 全肝移植一 一 1. 临床背景 2. 国内外研究现状 1. 临床背景 2. 国内外研究现状 第一部分 全肝移植 u1963年，Starzl 完成人类首 例同种异体肝移植 u1983年，美国NIH确定肝移植 为终末期肝病的有效治疗手 段 u全球每年10000余例，累计完 成16万例左右 肝移植历史和现状 我国现状 u我国的肝移植起步于1977 年，由于供体缺 乏、预后不佳等多种原因，停滞了较长一 段时间。 u近几年，肝移植出现了全国性的大发展。 中国每年约1500例，迄今总例数约10000- 15000例。 面临问题 u 移植肝损伤 u 免疫排斥反应 u 肝癌或肝炎肝移植后疾病复发 u 供体缺乏 肝移植物损伤机制 炎症损伤 移植物失功能 氧化应激 微循环 缺血预处理 缺血再灌注损伤 保存液开发 缩短冷热缺血时间 移 植 前 移 植 中 移 植 后 抗氧化 免疫抑制 肝功能维持 免疫排斥 保存损伤 抑制炎症 改善微循环 保存液的自主开发 ZW液对大鼠移植肝缺血再灌注的保护及器官冷保存的应用研究 u 采用的ZW液含有植物药物，如川芎嗪、山莨菪碱、丹参 、苦参碱、苦黄等。 u 上述药物将都具有抗炎抗氧化保肝的作用，它们均作为 药物的单体成分，其化学结构、药代、药效和药理作用机 制明确，副作用很小，并已制备出多种剂型供临床选用 。 u个体差异。 u常用的免疫抑制剂都是供体抗原非特异性的。 抑制肝癌、肝炎肝移植后疾病复发 诱导供体抗原特异性的免疫耐受 免疫抑制剂的应用 HBV infection Chronic HBV CirrhosisHepatic Failure Liver Cancer Liver Transplant Candidates 20% 20%20%-50% HBV: Disease Progression Time: 20-30 yearsTime: 20-30 years 肝移植术后肿瘤、乙肝复发 肝移植术后肿瘤、乙肝复发 肝移植 病毒学 肝癌研究 u免疫抑制剂的应用，是否诱导肿瘤与病毒复发 诱导特异性的免疫耐受 u转座元介导的人IL-10基因抗大鼠肝移植排斥反应 u转FasL基因的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受 u腺病毒载体介导的CTLA4Ig表达对大鼠肝移植免疫的抑制 u导入MHC基因的自体骨髓细胞输注诱导猪肝移植免疫耐受 u雷公腾多甙对大鼠肝移植急性排斥反应的影响 CD4+CD25+调节性T细胞抗大鼠肝移植急性排斥反应 Adoptive transfusion of donor alloantigen activated CD4+CD25+ regulatory T cell in the rejection of DA-LEW liver transplantation. Surgery 建立DA-LEW大鼠急排模型 CD4+CD25+Treg分离、激活 Foxp3基因CD4+CD25+Treg功能研究 CD4+CD25+调节性T细胞体外扩增 观察排斥指标 拓展供肝来源 u 老年供肝、脂肪肝供肝等边缘性供肝 u 活体供肝 第二部分 活体肝移植 美 国 每年尸体 供肝约 4000例 实际等待供 肝者超过 20000例 供肝严重短缺！拓宽供肝来源，大势所趋！ 平均等待时间超过600天，等待期死亡率20%-25% 中国每年需要肝移 植的终末期肝病 超过10万例 中国每年实际肝移 植病例数不足 2000例 中 国 u减体积肝移植 u劈离式肝移植 u活体肝移植 （Living Donor Liver Transplantation, LDLT) u上述术式肝移植的供肝都是小 移植肝！ 解决全球性供肝来源匮乏有效途径 u广义上说，活体移植肝体积远低于正常肝脏，在理论上 ，LDLT的移植物都是小移植肝 u最常用评价方法： 移植物与受者体重比（GRWR）； 供肝体积（GV）和标准肝体积（SLV）之比 （ GV/SLV） u目前，学术界认为 临床上，小移植肝是指GRWR0.8%的移植物； 动物实验中，小移植肝是指GV/SLV小于50的移植 肝 什么是小移植肝？ 中国活体肝移植工作的开始 u1995年1月，本组（南京医科大学第一附属医院肝 脏移植中心）完成国内首例活体肝移植。 LDLT目前存在的问题 u外科技术 u移植物体积过小 u再生特点 u免疫学特点 uHCC受者肿瘤复发 u乙肝复发 u成人活体肝移植应用日趋广泛，全球已报道供肝者死亡达14例，供者面临更 大风险，供肝体积受到更严格限制 u小移植肝综合症已成为影响活体肝移植术后受体预后的关键原因 小肝综合征：术后持续性胆汁淤 积， 凝血机制紊乱，门静脉高压 ，大量腹水，肝功能恢复延迟 u小移植肝基础研究的目标是：最大限度保障供 肝者安全，获取供肝者最小量供肝，并同时满 足受者生理需要（即获取最小有效供肝量） 小移植肝基础研究的目标 u20世纪90年代中期（1995年）以后，随着部分肝移植 深入开展，小移植肝损伤机制与保护措施的基础研究 逐渐成为国际器官移植领域的热点课题 u小移植肝损伤机制复杂，国际上研究时间短，10余年 历史,文献少，很多环节尚不清楚 u根据小移植肝损伤机制，探索符合临床实践的小移植 肝保护措施，是这一领域研究重点 u集中于日本、香港、美国、韩国、中国南京等少数中 心 u2005年4月，国家卫生部批准在南京成立卫生部活体 肝脏移植重点实验室，重点研究方向是临床活体肝移 植和小移植肝基础研究 小移植肝基础研究国内外现状 小体积肝移植物损伤机制与再生特点 炎症损伤 功能维持 氧化应激 微循环 缺血预处理 缺血再灌注损伤 保存液开发 移 植 前 移 植 中 移 植 后 抗氧化 免疫抑制 促进肝再生 免疫排斥 保存损伤 门脉高灌注 肝再生 降低门脉压力 抑制炎症 改善微循环 主要研究内容 研究内容之一：小移植肝动物模型的 建立和相关研究 u建立大鼠小移植肝模型 u对不同体积小移植肝功能状况对照研究 u吻合肝动脉大鼠小移植肝模型 大鼠小移植肝模型建立 注：. 门静脉左支进入左叶后，在距基部约2-3mm的左叶实 质内分出中叶的左侧半（左中叶）门静脉支（箭头） 三种体积肝移植术后 移植物内AST 水 平变化比较 三种体积肝移植术后移植物内 IL-6水平变化比较 三种体积肝移植术后2h、24h 病理变化比较 u移植肝体积越小，门静脉和肝动脉灌注压力越高,组 织损伤越重，对肝功能影响越大 注： *P 0.05 vs 全肝组（Whole graft）; P 0.05 vs 50%小肝组（50% size） 三种不同体积肝移植手术后前后门静脉压力 变化比较 u肝动脉吻合可显著改善大鼠小移植肝功能，减轻组织 学损伤，促进肝再生 u吻合肝动脉的小移植肝模型更加符合活体肝移植临床 实际，为小移植肝基础研究提供良好载体 全肝组30%小肝组50%小肝组 CAB 术后24h, Cyclin D1 术后24h, PCNA u小移植肝术后再生强烈 ，可能与肝再生信号通路 的激活有关 研究内容之二：缺血预处理对大鼠小移植肝再生的 影响及相关机制研究 u缺血预处理对大鼠不同体积小移植肝术后肝再生 的影响 u 通常认为,缺血预处理对移植物有保护作用 。 对于30%小肝移植物，缺血预处理明显 加重损伤，抑制了肝再生 u 机制是降低肝内细胞因子水平，抑制细胞 周期相关蛋白表达 研究内容之三：腺苷A2A受体对小移植肝缺血再 灌注损伤保护作用及其机制的研究 u小移植肝缺血再灌注损伤机制研究 uA2A受体对小移植肝缺血再灌注后,氧化应激反应作用 、炎性反应作用、细胞凋亡作用研究 uA2A受体激活，可减轻小肝移植术后氧化应激反应,减少小 移植肝内炎性因子的表达 uA2A受体激活可降低小移 植肝细胞凋亡，维持肝 脏组织正常结构,可改善 受体生存率 u减体积肝移植大鼠的生存率低 u移植早期肝细胞再生能力受损 u移植后“小移植物综合征”（SFSS) u损伤机理 门静脉高灌注 缺血再灌注损伤 移植早期肝细胞的快速再生以及移植后肝功能支持是必须的。 研究内容之四：表达肝细胞生长因子的骨髓间充质干细 胞保护大鼠小肝移植物的研究 立论依据 肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF） uHGF具有促有丝分裂和细胞保护作用 uHGF是最强的促肝细胞再生剂 uHGF应用广泛 uHGF的致命弱点：半衰期小于15min u解决方法：转基因 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs） uMSCs为中胚层发育的早期细胞，具有多向分化潜能 ，可分化为肝细胞。 u骨髓干细胞由于其取材方便，而成为研究的热点。 u易于携带和表达外源基因。 体内外肝细胞来源的不同途径 研究内容之四：表达肝细胞生长因子的骨髓间充 质干细胞保护大鼠小肝移植物的研究 肝再生通路与细胞周期 IL-6/STAT3通路 CDK2/cyclinD CDK4/cyclinE 炎症损伤 HO-1, ET-1，iNOS, Erg-1，HSP70 有关肝纤维化的一些指标：血清总胆红素和谷丙转氨酶 水平；肝星形细胞-平滑肌肌动蛋白(-SMA)及其活化 程度，检测肝脏胶原分布的相对含量：肝脏羟脯氨酸、 层粘蛋白和透明质酸水平测定。 u构建腺病毒载体重组 子，体外感染骨髓间充 质干细胞，获得稳定表 达人HGF的HGF/MSCs uHGF/MSCs移植后， 实验组大鼠肝功能 改善，肝再生加快 ，受体生存率提高 B A P S HGF/MSCs BrdUTUNELHE * * * * C e a d bc f GFP+Alb GFP Alb PSHGF/MSCs a b dc B A GFP+AlbGFP AlbDAPI u 转基因间充质干细胞改善小移植肝生存率的可能机制 1、早期通过HGF的作用，促进肝再生，提高生存率； 2、后期通过MSCs与HGF的协同作用，降低炎性反应，保持肝脏正常结构， 预防移植肝纤维化 小结 1、在国内率先建立吻合肝动脉小移植肝模型，提供 了较为符合活体肝移植临床实际的研究载体 2、采用选择性腺苷A2A受体激活剂，具有简单易操 作的特点，显著减轻小移植肝损伤，为小移植肝 保护措施的临床应用提供了切实可行的途径 小结 3、通常认为，缺血预处理具有保护移植物作用。本组在 国际上首次提出，当移植肝体积小于30%时，缺血预处 理可能会加重移植肝损伤。同时探讨基因转导和T调节 细胞输注等多途径干预对小移植肝的影响。 4、在国际上首次将转肝细胞生长因子（HGF）基因的骨髓 间充质干细胞移植应用于小移植肝保护，有效延长了小 移植肝生存时间，为干细胞移植在小移植肝保护中的应 用提供了新思路 成果发表于Molecular Therapy、 Surgery、 Transpl Int 、Transpl Immunol国际著名SCI期刊，与香港、日本、欧美等国际 上著名中心同类研究水平相近，达国际领先 干细胞在肝脏疾病领域的应用 u自从1999 年和2000 年科学杂志连续两年将干细胞 的研究评为年度世界十大科学成就以来,关于干细胞及 其在临床上的应用等研究就蓬勃发展起来。 干细胞的定义 u干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能 的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细 胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组 织细胞，从而构成机体各种复杂的组织器官。 干细胞分类 干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。 u胚胎干细胞(embryonic stem cells ,ESC) 是来源于人 或动物胚胎内细胞团或原始生殖嵴的一种多能细胞系。 胚胎干细胞几乎可以向所有的成年组织分化。 u成体干细胞(adult stem cells , ASC) 存在于胎儿和 成人各种组织及器官中,来源广泛, 是一类具有多向分 化潜能的细胞群体,有横向分化(trans- differentiation) 能力。 胚胎干细胞和成体干细胞的特点 u胚胎干细胞 更具有全能性,但涉及伦理问题，存在免疫排斥问 题；胚胎干细胞可能分化为肿瘤样的组织；在临床应 用中受到取材困难等因素的限制。 u成体干细胞 不涉及伦理问题；组织不会生成肿瘤样组织；不存 在免疫排斥的问题。 成体干细胞在临床应用方面可能有更广阔的前景。 干细胞的多向分化潜能 u通常情况下，干细胞具有确定的分化方向及途径（纵向 分化）。 u如今发现，在特定条件下，干细胞根据其特异的微环境 的不同而发育成与其自身组织来源不同的组织细胞，称 之为干细胞的转分化/横向分化。 已被实验证实的多向分化潜能 u骨髓细胞骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞 、神经细胞； u肌肉细胞血液细胞； u神经干细胞血液细胞、骨骼肌细胞； u造血干细胞骨骼肌细胞、心肌细胞、肝实质细胞、胆 管和多种上皮以及内皮细胞； u肝卵圆细胞胰腺内分泌激素形成细胞。 干细胞分化为肝系细胞 u骨髓细胞是较早被认识的成体干细胞之一,人们早就利 用骨髓移植来根治造血系统恶性疾病。 u目前骨髓是肝系细胞主要的肝外来源的说法已经较为肯 定。有研究表明，骨髓干细胞在诱导因子的作用下能分 化为肝系细胞。 干细胞在肝脏疾病领域的应用 u我国是病毒性肝炎、原发性肝癌的高发区, 目前尚缺乏 广泛可行的有效治疗手段, 尽管肝移植可作为治疗肝衰 竭的有效手段, 但手术复杂、排斥反应、生存率不高等 缺点, 尤其是供体肝缺乏, 使得这一治疗措施难以广泛 推广。 干细胞在肝脏疾病领域的应用 u生物人工肝 如果体外能获得由SCs分化而来的大量的肝细胞, 用 于生物人工肝支持系统, 或SCs移植入体内，可扩增、 分化为肝细胞, 必将为肝衰竭的治疗带来新的曙光。 干细胞在肝脏疾病领域的应用 u干细胞作为细胞移植的细胞来源较肝细胞具有更大的优 势: 其只有约10m 大小,经门静脉注射后更易分散到 肝实质,避免阻塞肝窦发生门静脉高压,且能长期保持生 成肝细胞和胆管细胞的能力。 干细胞在肝脏疾病