病毒学实验第三次课34 流感病毒的收获及血凝效价测定课件

实验二 流感病毒的收获及 血凝效价测定 第一部分 流感病毒的收获 实验目的 掌握从鸡胚尿囊腔收获流感 病毒的方法，获得大量的病毒抗 原。 实验原理 将流感病毒接 种于鸡胚尿囊腔后， 病毒就在尿囊的内 胚层细胞繁殖，繁 殖12天后，病毒颗 粒释放至尿囊液中， 从而使尿囊腔中含 有大量病毒，通过收获尿囊液， 可以得到较大量的流感病毒。 实验材料及器械 1. 已接种流感病毒的十日龄鸡胚 2. 无菌镊子、眼科剪刀、玻璃吸管、 无菌EP管（1.5和10mL各一个） 3. 75酒精棉球 实验方法与步骤 收获时间根据不同的病毒而异，流感病 毒一般培养3648小时即可进行收获。 收获前一天晚上，将鸡胚于4冰箱过 夜（如果急于收获亦可于20放置1 小时左右），将鸡胚冻死，使红血球凝 固，这样可避免在收获时流出的血细胞 ，同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造 成病毒滴度的下降。 4 冷藏时间不宜过长，过长易造成 散黄，影响收获。快速冷冻时间也不易 过长，一旦鸡胚冻成冰块就无法收获。 2. 经过冰冻的鸡胚用碘酒、75酒精消 毒鸡胚气室部卵壳 3. 用无菌镊子将消毒 过的壳打碎，轻轻 揭去气室部位卵壳 ，撕去壳膜和绒毛 尿囊膜，并将鸡胚 轻轻推向一侧，压 住。 4. 用无菌吸管通过绒 毛尿囊膜进入尿囊 腔吸出尿囊液（无 大血管处轻轻吸取 清亮的黄色液体） 。收取的尿囊液可 无菌小瓶 第二部分 血细胞凝集实验测定 流感病毒效价 实验目的 掌握血凝试验的方法和原理，了解 流感病毒具有凝集鸡红细胞的能力，掌 握病毒类型的测定的一种方法。 血凝原理血凝抑制原理 实验材料及器械 1. 收获的尿囊液（即流感病毒） 2. 1%鸡红血球、0.85生理盐水 3. 血凝板、吸管、三角瓶 实验方法及步骤 1. 第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入 0.1ml 尿囊液。 2. 吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔， 从第3孔至第10孔每孔各加生理盐水 0.4ml。 3. 反复吹打34次第2孔，从混匀的第2 孔中丢弃0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混匀 ，再吸0.4ml至第4孔，依次稀释到第9 孔，第9孔经稀释吹打后吸出0.4ml， 弃去，第10孔为血球对照，即不加尿囊液。 以上各孔（从第1孔到第10孔）的病毒 的稀释度分别为： 孔 数 12345678910 稀 释释 度 病 毒 原 液 1： 10 1： 20 1： 40 1： 80 1： 160 1： 320 1： 640 1： 1280 空 白 对 照 注意：各孔内液体量应为0.4ml 4. 从第10孔开始，按10-1的方向，向每孔 加0.4ml 1鸡红血球，轻轻振荡均匀， 置室温45分钟后观察实验结果并记录， 各孔的总体积应为0.8ml。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 病毒原液 红细胞对 照 依次加入0.4ml 1鸡红血 球 实验结果判断 血凝结果以+、+、+、+、表 示。 红细胞均匀分布于孔底者为+； 红细胞均匀分布于孔底，但有卷边现象 为+，即不完全凝集； 红细胞在孔底形成一个中等大小环状， 四周和中心有凝集以两个加号+表示。 红细胞在孔底形成一个小团，边缘光滑 圆润者为，红细胞完全未被凝集； 实验中应注意的一些问题 1. 实验所使用的玻璃器材及有机玻璃板均应干 净，血凝板使用完毕及时处理，避免残留的 酸、碱和沉着的红细胞影响实验结果 2. 流感病毒是对温度比较敏感的病毒，标本置 于20时在一两个星期内会出现病毒效价 减少的现象，一般需要在70 存放。 3. 一般采取公鸡的红细胞，而且存放时间超过 一周就不可再用。红细胞采来后用PBS洗3到4 遍，直到上清很清亮，放置后如果上清变红 ，说明有溶血，则不可再用。 4. 温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结 果影响都很大。温度过高病毒毒力过强会出 现溶血，不利于判定。反应的时间不能太长