所以plk1的sirna具有抵抗癌细胞的增殖作课件

法尔目前任职于美国麻省理工学院，梅洛目前在美国哈佛大学法尔目前任职于美国麻省理工学院，梅洛目前在美国哈佛大学 工作。他们将分享工作。他们将分享10001000万瑞典克朗（约合万瑞典克朗（约合140140万美元）的奖金万美元）的奖金 。 20062006年年1010月月2 2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将20062006年度诺贝年度诺贝 尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁 法尔和克雷格法尔和克雷格 梅洛，以表彰他们发现了梅洛，以表彰他们发现了“ “RNARNA（核糖核酸）干扰（核糖核酸）干扰” ”机制。机制。 诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他 们们“ “发现了控制遗传信息流动的基本机制发现了控制遗传信息流动的基本机制” ”。公报指出，。公报指出，RNARNA干干 扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助 科学家开发出治疗疾病的新疗法。科学家开发出治疗疾病的新疗法。 梅洛(Craig Mello)生于1960 年，是被恐龙骨引入科学世界的 。梅洛童年时经常跟着父亲在美 国西部寻找化石。从那时起，他 就迷上了远古时代、地球历史和 人类生命的起源等问题。高中时 代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基 因工程方面。 法尔(Andrew Fire)1959年出 生在美国加利福尼亚州，本科在 加利福尼亚大学伯克利分校主修 数学，仅用3年时间就拿到学位 。与梅洛类似，他逐渐对涉及生 命奥秘的遗传学产生兴趣，并将 其作为自己终身的学术追求。 RNA干扰 RNA interference，RNAi 南通大学生命科学学院 谭湘陵 一、RNA干扰的发现 94年Cogoni等证明真菌中 亦有类似现象，此称为基基 因压制因压制(quelling)。 90年代初，美国和荷兰的两个转基 因植物实验组Rich Jorgensen和同 事,在对矮牵牛(petunias)进行的 研究中有个奇怪的发现:将一个能 产生色素的基因置于一个强启动子 后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵 的紫颜色,结果没看到期待中的深 紫色花朵,多数花成了花斑的甚至 白的。也就是说转基因的植株不仅 没有新基因表达，反而使原有的色 素基因也受到了抑制，Jorgensen 将这种现象命名为共抑制共抑制 (cosuppression) 一、RNA干扰的发现 1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在 试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans) 的par-1基因时，发现了一个意想不到 的现象。她们本想利用反义RNA技术特 异性地阻断上述基因的表达，而同时 在对照实验中给线虫注射正义RNA以期 观察到基因表达的增强，但得到的结 果是二者都同样地切断了par-1基因的 表达途径。这是与传统上对反义RNA技 术的解释正好相反。该研究小组一直 未能给这个意外以合理解释。 论文： Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620. 一、RNA干扰的发现 1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的 Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平 的基因沉默基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因 表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都 是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链微量双链RNARNA而引起。 当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基 因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反 ，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效 率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称 为RNA干扰。 论文： Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811. (A)Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. 一、RNA干扰的发现 在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物 、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到 人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小 鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。 2000年提出RNAi作用机制模型。 论文： Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296 Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-33 2001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现 象。Nature，2001，411（6836）：494498 RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。 二、RNA干扰的机制 dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链 Dicer：属于RNase 家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶 siRNA：small interfering RNA ，RNAi的关键效应分子，21- 23个nt大小的双链RNA RISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸内切、 外切以及解旋酶活性 RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，依赖RNA的 RNA聚合酶，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传 递 预备知识： 基因沉默 二、RNA干扰的机制 转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS) TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基 因沉默。对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是 因为基因特异的甲基化而导致； PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细 胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。 基因沉默 目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的 分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑 制相应基因的表达。均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介 导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步： 二、RNA干扰的机制 第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNase 样的特异核酸酶切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 siRNA的两条单链末端为5-磷酸和3-羟基，且3端均有2-3 个突出的核苷酸。果蝇中的RNase样核酸酶称为Dicer。 Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。 Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中 被发现。 二、RNA干扰的机制 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解 旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex，RISC)。 活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在 RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶 基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 解，从而干扰基因表达。 RNAiRNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内， RNAiRNAi能达到基因敲除的效果。能达到基因敲除的效果。 RNAi的放大效应机制 二、RNA干扰的机制 siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA 依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的 dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解 而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割 的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环 过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR） 。 Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002. RNAi是转录后水平的基因沉默机制； RNAi具有很高的特异性； 只有dsRNA才能诱导产生RNAi； 只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰 ； 注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解； RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表 型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应 基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的； 二、RNA干扰的机制 RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征： 二、RNA干扰的机制 RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至 传播至整个有机体以及可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型 。 dsRNA不得短于21个碱基，大于30 bp的dsRNA不能在哺 乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的 基因表达受抑和凋亡； RNAi作用迅速，mRNA快速降解； RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效 应，否则只产生短暂的沉默反应。 RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征： 三、RNA干扰的应用 1.基因功能研究 由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以 特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可 以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表 明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种 表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段 ，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比， 这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来 RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志 着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 三、RNA干扰的应用 2.病毒性疾病的治疗 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细 胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发 RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周淋 巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从 而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫 应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增 加。 艾滋病 三、RNA干扰的应用 2.病毒性疾病的治疗 Shlomai 和 Shaul 设计了各针对HBV基因19nt的两种 pSUPER载体：pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。 已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X- siRNA或 core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89% 、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染 core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了 所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的 mRNA）。 HBV 三、RNA干扰的应用 2.病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使 细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有 HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗 原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了 siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。 HCV 三、RNA干扰的应用 2.病毒性疾病的治疗 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已 证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞 进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30 个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了 重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病 毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这 些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。 其它病毒 三、RNA干扰的应用 3.肿瘤治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表 达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的 手段治疗各种恶性肿瘤。 (1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因， (2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达， (3)RNAi可应用于抑制基因扩增。 Li等在3个肝癌细胞系Hep3B、HepG2、SNU449中对cyclin E 的研究中发现，转染siRNA组48 h后生长抑制均达到90，而 对照组无作用，3天后凋亡率分别为16 、44和3l，而对 照组仅为l。 三、RNA干扰的应用 3.肿瘤治疗 Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员 ，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase3，caspase7 发挥其抗凋亡作用 。现在研究已证实survivin基因参与了肝 癌的发生与发展，并且还与化疗的耐药性相关。降低survivin 基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡、抑制 肝癌细胞的生长，还可增强其对化疗的敏感性，从而提高肝 癌治疗的整体疗效。 CHENG等通过RNAi抑制肝癌细胞SMMC7721中survivin基 因的表达，使细胞株中survivin基因表达几乎缺失，凋亡指数 增加156，肝癌细胞生长被抑制。 三、RNA干扰的应用 3.肿瘤治疗 MDR (Muhidrug resistance)是肿瘤化疗失败的主要原因，形 成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR基因编码的糖蛋白过 度表达，其中，MDR1对于细胞的多重耐药性起着重要的作用 。Nieth等表明，特异siRNA可以抑制MDR1基因的表达，从而 显著降低肿瘤细胞的耐药性。 PLK1基因在很多种癌症时都呈高度表达，当使用RNAi技术减 少其表达后，所有癌细胞的PLKlmRNA和蛋白水平都有显著 降低，如MCF-7乳腺癌细胞的PLKlmRNA下降了7O ，蛋白水 平下降了90 ，而且细胞凋亡率提高了百分之几至50 不等。所 以，PLK1的siRNA具有抵抗癌细胞的增殖作用，是一种治疗 癌症的新途径。 三、RNA干扰的应用 4.药物开发 利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物 开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛 选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在 药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析 ，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应 化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候 选药物。 四、RNA干扰的研究方法 一般技术路线 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的设计 1.从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记 下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究 结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量 偏高的更为有效。 2.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大 鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序 列。例如使用BLAST 3.选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多 个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的设计 4.一个完整的siRNA实验应该有阴性对照。作为阴性对照的 siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和 mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序 列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 5.计算机软件辅助设计，如Rational_siRNA_design.xls等。 6.Internet资源的应用： 目前已证实的siRNA序列 /techlib/tb/tb_502.html /mmcmanus/www/siRNADB.html 互联网上的帮助 / / / 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 1.化学合成siRNA 是最贵的方法，但是却是最方便的许多公司都可以根据用 户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格 高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs 的 成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效 的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量 siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因 素。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 2. 体外转录合成siRNA 相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选 siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。 体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合 成siRNAs较高浓度得到的效果。 不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能 提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有 一定的限制。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化 学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究 。 四、RNA干扰的研究方法 3. 用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA 序列以便找到一个有效的siRNA。 这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可 以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用 体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。 在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以 直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证 目的基因被有效地抑制。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效 siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。 不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基 因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因，虽然现在多数 的研究显示这种情况通常没有发生。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的 siRNA进行研究，特别是基因治疗。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 4.利用质粒或病毒载体表达siRNA 多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III) 中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表 达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。 之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞 中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个 ）U来终止转录的。 使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链， 退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 siRNA表达载体的构建 四、RNA干扰的研究方法 由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经 过测序以保证克隆的序列是正确的。 不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷， 特别是当载体在实验中确实有效的时候。 siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长 期研究的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续 抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有 助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细 胞由于转染效率低造成的问题。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优 势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免 由于质粒转染效率低而带来的种种不便。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间 的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。 适用于长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和 测序等较为费时、繁琐的工作）。 siRNA的制备 除质粒载体外，科研人员已经成功地采用逆转录病毒载体、 腺相关病毒载体和慢病毒载体将表达siRNA的DNA模板序列 转移入哺乳动物细胞。现在许多学者正在加紧腺病毒载体的 siRNA转移研究 。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5. PCR方法制备siRNA的表达框架 usiRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一 种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表 达而无需事前克隆到载体中。 u这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNA pol III 启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。 u和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序 等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。 u因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来 筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。 四、RNA干扰的研究方法 u如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最 有效的siRNA后，可以直接构建siRNA表达载体。 u构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长期研究。 u主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新 型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决 了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制 备。 u最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启 动子； u不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了 ）。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5种siRNA制备方法的比较 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5种siRNA制备方法的比较 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的导入 1.细胞的导入 siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将 其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。 例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%，但 是其转染效率只有10%，那么总的抑制率只有9%。 目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。 但是有专门的RNA转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可 用于多种真核细胞的RNAi研究。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的导入 siRNA导入细胞的常用方法： 1）磷酸钙转染 2）DEAE-葡聚糖介导的转染 3）电穿孔 4）脂质体载体介导（目前有的较多） 5）显微注射技术 6）DNA载体转染（病毒等） 各种方法适用于不同的细胞，但总的