太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎杂交及杂种优势的初步研究.pdf

目录 viii 目录 摘要 i abstract . iv 目录 viii 第一章 综述 . 1 1.1 杂交育种和杂种优势概述 1 1.1.1 杂交育种的原理和方法 . 1 1.1.2 杂种优势的理论基础 . 2 1.1.3 杂种优势利用的简史与现状 . 3 1.2 海洋贝类杂交育种的研究进展 4 1.3 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的生物学特征及相互关系 . 5 1.3.1 太平洋牡蛎的生物学特征 . 5 1.3.2 葡萄牙牡蛎的生物学特征 . 6 1.3.3 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的关系 . 6 1.4 本论文的研究背景及意义 7 第二章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的亲本鉴定 . 9 引言 . 9 2.1 材料与方法 9 2.1.1 材料 . 9 2.1.2 方法 . 9 2.1.3 数据分析 . 10 2.2 结果 10 2.2.1 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎亲本的形态鉴定 . 10 2.2.2 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎亲本的分子鉴定 . 11 2.3 讨论 13 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 . 15 引言 . 15 3.1 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎杂交子一代的生长和存活的比较 . 15 目录 ix 3.1.1 材料与方法 15 3.1.2 结果 . 17 3.1.3 讨论 . 20 3.2 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎杂交及自交子代遗传多样性的比较 . 21 3.2.1 材料与方法 . 21 3.2.2 实验设计及取样 . 21 3.2.3 ssr 标记及分析 21 3.2.4 结果 . 22 3.2.5 讨论 . 24 第四章 杂种牡蛎和纯种牡蛎生理生化的比较 . 26 前言 . 26 4.1 蛋白质的比较 26 4.1.1 实验材料、取样及样品处理 . 26 4.1.2 粗蛋白的测定方法 . 26 4.1.3 统计分析 . 26 4.1.4 结果 . 27 4.1.5 讨论 27 4.2 脂肪及脂肪酸的的比较 28 4.2.1 实验材料、取样及样品处理 28 4.2.2 脂肪和脂肪酸的测定方法 28 4.2.3 杂种优势率的计算 . 28 4.2.4 统计分析 . 29 4.2.5 结果 29 4.2.6 讨论 . 35 4.3 总抗氧化能力的比较 36 4.3.1 实验材料、取样及样品处理 36 4.3.2 总抗氧化能力的测定方法 . 36 4.3.3 统计分析 . 37 4.3.4 结果 . 37 4.3.5 讨论 . 37 目录 x 第五章 遗传与环境的关系 . 39 引言 . 39 5.1 室内条件下逆境中的杂种优势 39 5.1.1 温度对杂种和纯种牡蛎幼虫期生长和存活的影响 39 5.1.2 温度、盐度对成贝的生长、存活、生理生化的影响 . 43 5.2 野外条件下逆境中的杂种优势 50 5.2.1 越冬过程中生长、存活、生理生化的变化 50 5.2.2 度夏过程中生长、存活、生理生化的变化 . 56 总结、创新点及后续工作 . 64 参考文献 . 66 发表的文章 . 73 致谢 . 74 第一章 综述 1 第一章 综述 1.1 杂交育种和杂种优势概述 1.1.1 杂交育种的原理和方法 在遗传学上，严格地说，只要有一对基因不同的两个个体间进行交配，便是杂交 （hybridization） 。由杂交产生的子代个体称为杂种（hybrid） 。但在实际育种和生产中，杂 交育种（cross breeding）一般是指不同的品系、品种、养殖群体间，甚至不同地理群体、 种群、亚种、种以上分类单元间的交配，这种杂交既可以发生在个体水平也可以发生在群 体水平。杂交可以使生物的遗传物质从一个群体转移到另一群体，是增加生物变异性的一 个重要方法。杂交并不产生新基因，而是利用现有生物资源基因和性状重新组合，将分散 于不同群体（个体）的基因组合在一起，建立起理想的基因型和表型（腾爽爽，2009） 。 杂交的生物学特征表现在：能急剧地动摇遗传的保守性，使杂种的遗传可塑性增加； 能迅速而显著地提高杂种生活力，获得杂种优势；杂交能丰富遗传多样性，提供更加广 泛的遗传基础（张国范，2009） 。 亲本选配决定杂种后代的遗传基础，是杂交育种成败的关键。杂交育种的基本方法是 通过选择适合的亲本，配置合理的杂交组合以达到培养优良新品种的目的。亲本选配的一 般原则：亲本优点多，主要性状突出，缺点少又较易克服，双亲的优缺点能克服；亲 本之一最好为当地优良品种；杂交亲本在生态型和系统来源上应有所不同；杂交亲本 应具有较好的配合力。 杂交根据亲本的亲缘关系分为种间杂交和种内杂交。种间杂交包括了科间、亚科间和 属间杂交；种内杂交又可分为近亲杂交和非亲缘杂交。杂交的方式根据亲本的品种数目包 括单交和复交，复交又包括了三交、双交和四交。杂交能够促使遗传物质重组（性状重组、 基因互作产生新性状、积累基因产生累加作用） ，进行性状改良。但杂交的积极作用并非 任何杂交组都有，一般来说，杂交难以产生全新的性状。但有可能出现部分新性状，有时 还能把双亲的优良性状综合起来，部分或全部表现出来，表现为介于双亲之间的中间性状 或杂种优势。 第一章 综述 2 1.1.2 杂种优势的理论基础 杂种优势（heterosis）是指两个或两个以上不同遗传类型（不同基因型）的物种、品 种或自交系杂交产生的杂种第一代，在生长势、生活力、生殖力、抗病性、产量和品质上 比亲本的一方或双方优越的现象。 杂种优势是生物界的普遍现象，目前，其遗传理论的发展远落后于实践中所取得的成 就，这就限制了杂种优势的进一步利用和预测。杂种优势是极为复杂的遗传现象，关于其 理论基础存在很多的假说，但是每一种假说都很难完善的说明这一现象，现将主要假说介 绍如下： （1）显性假说：显性假说首先由 davenport（1908）提出，jones（1917）又进一步将其补 充为显性连锁假说，简称显性假说，为解释杂种优势的经典数量遗传学理论。该假说认为 大多数显性基因有利于个体的生长发育，相对应的隐性基因则不利于生长发育。如选用不 同的亲本系进行杂交，那么由一个亲本带入子代杂合子中的某些隐性基因会被另一亲本的 显性基因所覆盖，从而增加了杂合子的生长势。一般用三种不同的遗传效应来解释杂种优 势：有利显性基因对不利隐性基因的抑制作用；显性基因的累加效应，如果两个杂交 亲本具有的基因不全部是显性的，那么它们杂交的后代会因显性基因的累加效应而产生杂 种优势；非等位基因间的互作，也即一个基因座受到另一个或多个基因座的影响，因而 会使一个性状受到抑制或增强，这种促进作用可通过杂交而表现出杂种优势。 （2） 超显性假说：超显性假说由 shull（1908）首先提出，得到了 east 和 hull 等人的支持， 同为解释杂种优势的经典数量遗传学理论。该假说认为杂种优势是等位基因间的相互作 用，由于具有不同作用的一对等位基因在生理上相互作用，使杂合个体比任何一个纯合个 体在生活力和适应性上更为优越，而杂种优势源于基因型不同的配子结合而产生的一种刺 激发育的效应。按照这一假说，杂合等位基因的贡献要大于纯合显性基因和纯和隐性基因 的贡献，所以又称为等位基因异质结合假说。 （3）上位假说：上位假说由 hayman 和 mather（1955）首先提出，该假说主要强调的是 非等位基因间的互作，有时表现显性上位，有时表现隐性上位，当上位基因表现出相互抑 制性质时，则子一代可表现为倾向低值亲本。上位性是指非等位基因间的相互作用，当两 对等位基因在一起相互作用时，其基因型值偏离两者相加之值，即为上位性基因的作用。 上位性效应是数量性状遗传的重要组分之一。 除上述假说外，还有基因平衡和遗传平衡假说、活性基因效应假说、有机体生活力假 第一章 综述 3 说、基因网络假说、杂种自组织理论等假说。虽然杂种优势的各种理论或假说在解释杂种 优势现象的某些方面有其独到见解，也有一些试验结果作为依据，但是杂种优势不光与遗 传有关，还与环境有关，一种理论很难概括它。随着分子生物学技术的不断建立和日臻完 善，为人们认识和利用杂种优势现象提供了良机，分子标记、连锁图谱的构建和 qtl定位 等都有力的推动了杂种优势遗传学基础的研究。 国内外研究者应用 rflp、 rapd 和 mrna 差异显示技术等方面开展了大量工作，但目前来看还远远不够，距阐明杂种优势的遗传基 础仍相距甚远。 1.1.3 杂种优势利用的简史与现状 欧洲在产业革命之后，开始了作物杂种优势利用的研究。如法国学者 kolreuter，在 1761-1766 年育成了早熟优良的烟草种间杂种，并提出种植烟草杂交种的建议。mendel （1865）通过豌豆杂交试验，也观察到杂种优势现象，并首先提出了杂种活力这个术语。 darwin（1877）观察并测量了玉米等作物的杂种优势现象后，提出了异花授粉有利和自花 授粉有害的观点。其后，许多学者对玉米做了一系列研究，终于导致玉米成为生产中大规 模利用杂种优势的第一个代表性作物。 shamel（1898-1902） 、shull（1905-1909） 、east（1908）和 blurls（1910）先后进行了 玉米自交系选育与杂种优势的研究。shull（1908）首次提出了“杂种优势”这一术语和选 育单交种的基本程序，从遗传理论上和育种模式上为玉米自交系间的杂种优势利用奠定了 基础。 统计资料表明，1934 年美国玉米杂交种只占玉米种植面积的 0.40%，到 1944 年玉米 杂交种面积已占 56%，在美国玉米带各州所占面积已达 90%，到 1956 年全美已普及了玉 米杂交种。在 1960 年以前，生产上种植的主要是双交种和一部分三交种与品种群体。由 于自交系水平的提高，1963 年后开始推广玉米单交种。迄今为止，生产上种植的主要是单 交种，还有小部分三交种和品种群体。 目前，杂种优势利用最好的是植物尤其是农作物。我国杂交水稻的研究开始于 1964 年，70 年代前期完成了籼型和梗型水稻三系配套，70 年代中期开始推广种植杂交水稻， 到 1990 年杂交水稻种植面积达 1600 万平方米，占全国水稻面积的 50，中国杂交水稻的 大面积推广，开创了自花授粉作物杂种优势利用的先例，处于国际领先地位。我国杂交高 粱的研究始于 20 世纪 50 年代后期，到 60 年代后期，育成并推广了一批高粱杂交种，现 第一章 综述 4 在高粱杂交种也已普及，约占高粱总面积的 80%。油菜杂种优势的研究始于 60 年代中期， 经过 20 多年的研究，已育成秦油 2 号、华杂 2 号等几个杂交组合，正在进行示范推广， 据初步统计，1990 年秋播杂交油菜面积已超过 40 万平方米，在国际上处于领先地位。四 川省利用核不育系配制的棉花杂交种，已在生产中利用，每年的推广面积占该省棉田的 25%-30%。目前我国年推广面积占全国植棉面积的 10%左右。 从 20 世纪中叶开始，畜牧业中杂种优势利用得到广泛普及，在猪、鸡、兔等小家畜 生产中，杂种优势利用已日益成为主要的繁育方法；肉牛饲养业以二元轮回和三元轮回杂 交为主；肉用山羊和水牛主要采用引入杂交的方式；奶牛和绵羊正在探索品系间杂交的方 法获取杂种优势。杂种优势利用已成为现代养殖业的一种重要繁育手段。 在渔业方面，国外和国内对鲤鱼进行了广泛的杂交研究，当前鲤鱼的养殖品种几乎都 是采用的具有优良性状的杂交子一代。奥尼罗非鱼在我国南方地区已形成规模化、集约化 养殖，在罗非鱼产品中逐渐成为主流产品，其正是优良的杂交子一代。鲍的杂交育种以日 本研究较多，国内的研究开始较晚，但是发展很快，目前中国鲍鱼的养殖大国地位，就与 杂种优势的产业化应用有密切的关系。 1.2 海洋贝类杂交育种的研究进展 国外贝类杂交育种或利用杂种优势的工作开始于 20 世纪 60 年代，这是在贝类人工育 苗成功的基础上。贝类杂交的研究始于牡蛎也多见于牡蛎，今井丈夫（1961）首先开展了 不同地理群体牡蛎的杂交实验，但杂种优势不甚明显，这对后来的研究产生了一定的负面 影响（张国范，2004） 。上个世纪 80 年代以后，欧美又有人陆续研究杂交问题，主要集中 在牡蛎， 尤其是太平洋牡蛎的研究。 imai 和 sakai （1961） 、 menzel （1974） 、 numachi （1977） 、 huvet（2002）等人进行太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的杂交，都获得了成功。imai（1950） 、 numachi（1977） 、stiles(1973，1978)等人对太平洋牡蛎与美洲牡蛎进行杂交实验，发现能 够成功受精，但幼虫很难存活。numachi（1977） 、robinson(1990)、cooper（1990） 、banks （1994）等人发现太平洋牡蛎的精子可与熊本牡蛎的卵细胞受精，有可能产生能存活的杂 种。imai 和 sakai（1961） 、downing（1988，1991）等人报道了太平洋牡蛎可与近江牡蛎 进行很有限的受精，但是受精卵可以存活。bayne 等（1999）比较了长牡蛎自交组与杂交 组的摄食行为和代谢效率，结果显示总体上杂种的摄食效率和生长速度都要高于自交后 代，同时还发现虽然杂种的表现都要好于自交后代，但在正反交组合中存在显著差异。 第一章 综述 5 beattie（1987）比较 2 龄太平洋牡蛎的实验中发现杂交子代在壳长、总重及干肉重上都明 显高于全同胞交配的子代。 宫本廉夫（1988）和小池康一（1995）对日本大鲍和盘鲍的杂交进行深入研究，发现 杂交组合生长率比各自的自交组合快。leighton（1982）对红鲍、粉红鲍、绿鲍和白鲍进 行人工杂交， 结果显示红鲍绿鲍的杂交子一代具有明显的杂种优势。 cruz 和 ibarra （1997） 进行了 catarina 扇贝 argopecten circularis 两个群体的杂交实验，结果表明，杂种优势在第 15 天为 3.5，到第 17 天时达到 6.8；正反交的存活率显著不同，存在明显的母本效应。 国内，众多学者也开展了贝类的杂交育种的研究。柯才焕（2000）等以杂色鲍、皱纹 盘鲍和盘鲍为亲本，张起信（2000）等、孙振兴（2001）等以日本大鲍和皱纹盘鲍为亲本， 欧俊新（2002）等以皱纹盘鲍和盘鲍，王云（2006）等以皱纹盘鲍和日本西式鲍为亲本， 先后进行了杂交育种研究。郑怀平（2004）对海湾扇贝，常亚青（2002）对栉孔扇贝进行 杂交研究，取得较好的结果。还有牡蛎（周茂德，1982；吕豪，1994） ，马氏珠母贝、解 氏珠母贝和大珠母贝间的杂交（魏贻尧等，1983） 。 1.3 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的生物学特征及相互关系 1.3.1 太平洋牡蛎的生物学特征 太平洋牡蛎(crassostrea gigas)在系统分类学上属软体动物门（mollusca） 、双壳纲 （bivalvia） 、珍珠贝目（pterioida） 、牡蛎科（ostreidae） 。太平洋牡蛎是一种适应性强，广 温广盐性种类。从冬季结冰的俄罗斯远东沿岸到夏季水温可达 40的东南亚，从盐度在 0.010 左右的临近河口地区到盐度常年在 0.040 的澳大利亚南澳州水域， 此种牡蛎都能正常 生长，自然繁殖。贝壳呈长条形，坚厚，一般壳高 140-330mm，长 57-115mm，高比长约 大 3 倍，已知最大的长达 722mm。左壳稍凹，壳顶附着面小，右壳较平如盖，背腹缘几乎 平行，壳表面淡紫色、灰白色或黄褐色。自壳顶向后缘环生排列稀疏的鳞片，略呈波状， 层次甚少，没有明显放射肋。壳内面瓷白色，韧带槽长而宽大，闭壳肌痕大，位于壳的后 部背侧，呈棕黄色马蹄形。 太平洋牡蛎是世界上经济价值最高的牡蛎种类，是一种个体大，养殖周期短，产量高， 肉质肥美的优良贝类，在日本、欧洲、澳大利亚、中国等世界各地都有大量养殖。自 1993 年以来，太平洋牡蛎在所有水生动物中养殖产量最高，据世界粮食农业组织（fao）2008 第一章 综述 6 年统计，2006 年太平洋牡蛎世界产量达到 459 万吨。在我国，1979 年浙江省首先从日本 引进进行育苗及养成试验，后全国各地都有试养，现在太平洋牡蛎以长江为界主要分布在 中国北方沿海。尽管中国渔业统计年鉴中没有区分牡蛎的具体种类，但估计我国太平 洋牡蛎的产量约占牡蛎总产量的 1/3。 1.3.2 葡萄牙牡蛎的生物学特征 葡萄牙牡蛎(crassostrea angulata)在系统分类学上属软体动物门（mollusca） 、双壳纲 （bivalvia） 、珍珠贝目（pterioida） 、牡蛎科（ostreidae） 。此种牡蛎壳形极不规则，有长形、 圆形、椭圆形、三角形等，视生长环境不同而有较大差异。左壳凹陷，右壳有轻微突起， 左壳附着面小。右壳有明显的，放射褶或一层层同心的鳞片存在，左壳有放射肋存在。壳 面为青色、黄色或褐色。壳内面白色，闭壳肌痕浅褐色，长型。韧带槽小，壳顶腔较深， 有的较浅。也有的为长形，壳表面光滑，只在壳的边缘有轻微放射褶痕迹，壳面呈黄色， 夹杂有少量褐色条纹。 葡萄牙牡蛎是一种非常重要的经济贝类，有证据显示葡萄牙牡蛎在 16 世纪由亚洲引 入葡萄牙，然后在欧洲开始大量养殖。在我国，以长江为界主要分布在中国南方沿海，在 中国南方高度丰富的僧帽牡蛎与欧洲的葡萄牙牡蛎为同一种，其产量甚至高于太平洋牡 蛎，约占牡蛎总产量的 50-60。 1.3.3 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的关系 葡萄牙牡蛎在 16 世纪初就由亚洲引入葡萄牙，在欧洲开始推广养殖，太平洋牡蛎在 1970 年由日本引入欧洲来代替葡萄牙牡蛎，两种牡蛎均是世界性分布，同是重要的经济贝 类，但二者的分类地位一直存在争议。 葡萄牙牡蛎首次被描述是在南欧而太平洋牡蛎是在日本，因为地理分布的不同，太平 洋牡蛎和葡萄牙牡蛎分别由 thunberg（1793）和 lamarck（1819）命名。葡萄牙牡蛎最早 被认为是葡萄牙地区的特有物种， 没有把它与太平洋牡蛎进行比较， 随着交通运输的发达， 大量的太平洋牡蛎被引进欧洲，发现与葡萄牙牡蛎在形态上非常相似。在形态上，两种牡 蛎幼虫壳的形态难以区分（其他牡蛎可以） ，具有极高的生物相似性，ranson （1948，1960） 第一次提出它们是同一个种；leit o（1999）通过染色体组型分析认为同其他牡蛎相比， 第一章 综述 7 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎具有极高的基因相似性； mathers （1974） 、 buroker （1979） 、 mattiucci 和 villani（1983）等人通过等位酶标记的研究发现这两种牡蛎间没有显著差异；menzel （1974）观察到它们的杂交后代具有正常的有丝分裂和减数分裂；imai 和 sakai（1961） 、 menzel（1968,1974） 、huvet（2002） 、leit o（2006）等人通过人工杂交能够成功获得杂交 后代；且 huvet（2004）提出证据证明两种牡蛎可以在自然环境下杂交。 也有许多学者认为这两种牡蛎不是同一个种，它们之间是有差异的。ofoighil（1998） 和 boudry（1998）通过对细胞色素氧化酶亚基 i（coi）基因的分析提出太平洋牡蛎与葡 萄牙牡蛎具有明显的遗传差异；huvet（2000）使用微卫星标记分析出两种牡蛎间具有轻微 但却显著的遗传差异；heral（1986） 、bougrier（1986） 、parache（1989）等人认为两种牡 蛎的表型有所不同，在法国，太平洋牡蛎的生长速度是葡萄牙牡蛎的两倍，其产量更高； goulletquer（1999） 、haure（2003）等人进行生态生理的研究（氧消耗、投喂和呼吸活动） 提出它们在生长上具有不同。 huvet （1974） 等人认为它们应属于亚种关系， 实际上早在上世纪 70 年代， menzel （1974） 就把它们归为了两个亚种。王海燕（2010）通过 16s rrna 和 coi 基因的研究，分析出两 种牡蛎间的序列差异大于它们各自的种内差异，但是同其他牡蛎相比，二者间的序列差异 又是最小的，它们的关系介于种间和种内，应为亚种关系。 1.4 本论文的研究背景及意义 牡蛎是世界水产养殖产量最高的种类。 据世界粮农组织统计， 全世界仅太平洋牡蛎养 殖产量在 2003 年就已达到 440 万吨。我国是贝类养殖大国，同时也是牡蛎养殖大国，2009 年，牡蛎养殖产量达 350.3782 万吨，占养殖贝类总产量的 32.55%。近 10 年来我国牡蛎产 量一直呈上升趋势。目前，我国养殖的牡蛎多为巨蛎属（crassostrea）种类，如长牡蛎也 称太平洋牡蛎 c. gigas、近江牡蛎也称赤蚝 c. ariakensis、香港巨牡蛎也称白蚝 c. hongkongensis、葡萄牙牡蛎也称僧帽牡蛎 c. angulata 等。尽管中国渔业统计年鉴中没 有区分牡蛎的具体种类，但估计我国太平洋牡蛎的产量约占牡蛎总产量的 1/3。而葡萄牙 牡蛎主要养殖在我国南方，其产量甚至高于太平洋牡蛎。随着养殖规模的扩大，我国牡蛎 养殖产量在不断提高的同时， 育苗难、 死亡率升高、 生长慢、 个体小、 出肉率低、 “水蛎” 机 会上升等问题也逐渐凸显，严重影响了牡蛎的产量和效益。因此，如何获得生长快速、经 济性状较好、品质高的优良品种已成为解决牡蛎养殖产业可持续发展的关键。 第一章 综述 8 众所周知，杂交是动植物遗传改良的重要手段，其目的就是为了获得杂种优势。牡蛎 的种间杂交也是贝类杂交育种中研究最早、最多的，但绝大多数巨蛎属的种间杂交是不成 功的（gaffney，1993） 。然而，贝类亚种间、不同地理群体间及家系间杂交取得了可喜的 进展，大多都能获得正的杂种优势。因此，杂交作为传统的遗传育种方法，在较长的时期 内，将仍然是贝类育种的首选方法，随着分子生物学技术的进一步发展，各种贝类遗传图 谱的建立，传统的育种方法与分子标记辅助育种相结合将是海水养殖贝类育种的必然趋 势。 广东汕头南澳岛（县）地处北回归线上，亚热带气候，常年水温处于 15-30之间， 适宜生物生长的时期长，非常适合发展海水贝类养殖。牡蛎养殖也是南澳海水养殖的龙头 产业。汕头南澳养殖的牡蛎一直认为是太平洋牡蛎，但我们采用 16srrna 测序发现，这 种牡蛎实际是葡萄牙牡蛎。近年来，南澳养殖的牡蛎（葡萄牙牡蛎）也存在上述问题。为 此，我们计划利用与之亲缘关系非常接近的太平洋牡蛎与之杂交来改良当地养殖牡蛎的品 种特性，以解决南澳牡蛎养殖中存在的问题。 本论文以太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎的群体为亲本，通过杂交获得杂交后代，从环境、 生理、生化等方面系统的探讨杂交后代是否能够获得杂种优势，具有以下意义： （1）南澳岛本地牡蛎育苗困难，表现在死亡率高，所使用的苗种均是从福建购入， 养殖成本增加。引入太平洋牡蛎进行杂交育种，期望杂交子代在幼虫期获得成活率方面的 杂种优势，实现本地繁育苗种，降低养殖成本。 （2）南澳岛本地养殖的葡萄牙牡蛎在稚贝期和成贝期出现死亡率升高、生长慢、“水 蛎”现象，且度夏困难，养殖时间难以超过一年，太平洋牡蛎 2-3 年内均有快速生长，期望 杂交子代在稚贝及成贝期能够获得生长速度、存活率方面的杂种优势。 （3）对杂交子代和自交子代进行营养成分的比较，包括蛋白质、脂肪及脂肪酸，尤 其是不饱和脂肪酸，期望杂交子代获得营养成分方面的改良。 （4）总抗氧化能力作为反映机体清除自由基能力的重要指标之一，对于研究其维持 内环境稳定和抗逆抗病能力具有重要意义，对杂交子代和自交子代进行总抗氧化能力的比 较，来探讨杂交子代抵御环境病害的能力是否增加。 第二章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的亲本鉴定 9 第二章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的亲本鉴定 引言 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎均是世界性分布，是两种优良的经济贝类，在我国的牡蛎养 殖中，它们的养殖量最大。长期以来，分类主要是靠形态进行的，但是太平洋牡蛎与葡萄 牙牡蛎形态变化大，尤其是后者形态极不规则，生长环境不同而有较大差异，单靠形态分 类指标，有些种类或个体区分难度很大。本实验使用来自山东省青岛的太平洋牡蛎养殖群 体和广东省汕头的葡萄牙牡蛎养殖群体作为亲本，进行杂交实验。通过形态比较和分子鉴 定，对亲本的种类进行确认，保证实验的准确性。 2.1 材料与方法 2.1.1 材料 实验所用的太平洋牡蛎 （crassostrea gigas） 取自山东青岛的养殖群体， 葡萄牙牡蛎 （c. angulata）取自广东汕头南澳岛的本地养殖群体。 2.1.2 方法 形态鉴定：太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎各随机取 90 个，清理干净，使用游标卡尺测量 壳长、壳宽、壳高和闭壳肌痕高，各随机取十个外形拍照，解剖后对闭壳肌拍照， 分子鉴定： 基因组 dna 的提取：dna 的提取使用东盛生物的基因组 dna 快速提取试剂盒。 引物： 线粒体 16s rrna 基因扩增的引物 16sar （5-cgcctgtttatcaaaaacat-3） 和 16sbr （5-ccggtytgaactcagatcaygt-3） （palumbi et al. 1991） ；线粒体细胞色 素氧化酶亚基 i （coi） 扩增的引物 lco1490 （5-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3） 和 hco2198（5-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3） （folmer et al. 1994） 。 pcr 扩增：反应体系包括 pcr mix（2.0 mm mgcl2，150 m dntps，0.2 m 各引 物，20 ng 模板 dna） ，2.5l 10 buffer，1u taqdna 聚合酶。pcr 反应条件：95预变 性 5 min； 变性 95 1 min，退火 51（coi）和 57（16s rrna）1 min，72延伸 1 min， 30 个循环；最后 72延伸 10 min。 第二章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的亲本鉴定 10 产物检测和测序：所有的产物使用 1.5琼脂糖凝胶电泳检测。pcr 产物纯化后， 使用 abi prism 377xl dna 测序仪测序。 2.1.3 数据分析 将测得的 16 s 序列同 genebank 中登录 crassostrea 属的牡蛎序列进行系统发育分析。 2.2 结果 2.2.1 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎亲本的形态鉴定 2.2.1.1 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎外形的比较 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的形态特征如图 2-1 所示。太平洋牡蛎贝壳呈长条形，高比 长约大 3 倍，贝壳表面呈黄褐色，夹杂一些黑色条纹，具有排列稀疏的鳞片，略呈波浪形， 层次较少，放射肋不是很明显；葡萄牙牡蛎壳形极不规则，有长形、圆形、椭圆形等，壳 面以黄色、黑色为主，夹杂些褐色或青色条纹，有放射褶或一层层同心的鳞片存在，图中 在处理过程中已经脱落，多数壳顶腔较深，有的较浅。 图 2-1 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的形态特征 fig 2-1. shell morphological characteristics of crassostrea gigas and c. angulata 注：左图为太平洋牡蛎；右图为葡萄牙牡蛎 2.2.1.2 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎闭壳肌痕的比较 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎闭壳肌痕的特征如图 2-2 所示。太平洋牡蛎壳内面瓷白色， 闭壳肌痕大，位于壳的后部背侧，呈深褐色马蹄形；葡萄牙牡蛎壳内面为白、黄、黑、棕 第二章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的亲本鉴定 11 色的混合，铰和部不明显，闭壳肌痕浅褐色、深褐色都有，浅褐色的多一点。 图 2-2 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎闭壳肌痕的特征 fig 2-2 . muscle scar characteristics of crassostrea gigas and c. angulata 注：左图为太平洋牡蛎；右图为葡萄牙牡蛎 2.2.1.3 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎壳长/壳宽、 壳高/壳宽和壳高/壳长、壳高/闭壳肌痕高的比 较 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎表型值长/宽、高/宽和高/长比值的比较如表 2-1 所示。太平 洋牡蛎与葡萄牙牡蛎的长/宽比值分别为 1.75 和 1.76， 没有显著差异； 高/宽比值分别为 3.70 和 3.14，太平洋牡蛎的高/宽比值显著大于葡萄牙牡蛎；高/长比值分别为 2.12 和 1.83，太 平洋牡蛎的高/长比值显著大于葡萄牙牡蛎；高/痕高比值分别为 6.46 和 5.94，没有差异。 表 2-1 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎长/宽、高/宽、高/长和高/痕高的比较 tab 2-1. the comparison between crassostrea gigas and c. angulata in l/w、h/w、h/l and h/ah 长/宽（l/w） 高/宽（h/w） 高/长（h/l） 高/痕高（h/ah） 太平洋牡蛎 1.75a（0.07） 3.70a（0.07） 2.12a（0.08） 6.46a（1.72） 葡萄牙牡蛎 1.76a（0.11） 3.14b（0.09） 1.83b（0.15） 5.94a（1.21） 注：上标字母为纵列比较（p 1.0 时， 杂交产生了显著的杂种优势；当 hp 0.05），下同。 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 18 4 个实验组 gg、aa、ga 和 ag 在第 2、8、14 天的壳长、平均生长速度及它们的杂 种优势列于表 3-1。两个杂交组 ga 和 ag 的壳长在整个幼虫期都显著地大于两个自交组 gg 和 aa。幼虫期的生长速度也与壳长相一致，即杂交组的生长显著地快于自交组，4 个 实验组的生长速度依次为 gaagggaa。 由于 4 个实验组合幼虫培养在相同的环境下， 这种差异应归因于遗传效应，即杂交产生了显著的杂种优势。生长的杂种优势在 3 个日龄 时均为正值，并且随日龄增加呈增长趋势；同时，卵源自于葡萄牙牡蛎的杂种优势均大于 卵源自于太平洋牡蛎的杂种优势。 杂交组和自交组幼虫期的存活率及杂种优势列于表 3-2 中。 ga 组和 ag 组的存活率在 8 日龄和 14 日龄时都显著地高于自交组 gg 和 aa。杂交获得了显著地杂种优势，8 日龄 和 14 日龄的杂种优势率分别为 76.8和 107.7， 并且卵源自于太平洋牡蛎的 a 组获得的 改良大于 g 组。 表 3-2 幼虫期的存活率（%） （a）和杂种优势（b） tab 3-2. survival rate (a) and heterosis (b) at larvae stage 实验组 幼虫日龄 8 14 a gg 55a 25a aa 40b 20b ga 88c 48c ag 80c 45c b hp 4.87 9.6 h/ 76.8 107. 7 3.1.2.2 稚贝期生长、存活及杂种优势的比较分析 gg、aa、ga 和 ag4 个实验组在第 60、90、105 天的生长及杂种优势如表 3-3 所示。 来自北方的 gg 组始终最小， 且在第 90 和 105 天与其余三组具有显著性差异。 两个杂交组 ga 和 ag 始终未出现显著性差异，但 ag 组始终与自交组有显著性差异。4 个实验组的生 长速度从高到低依次为 ag、ga、aa 和 gg，其值分别为(mm d- 1)0.535、0.492、0.464 和 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 19 0.273。gg 组和其余三组具有显著性差异，但其余三组间未出现显著性差异。杂交组的杂 种优势为 29，g 组获得的杂种优势为 80.22，a 组获得的杂种优势为 15.3。 如表 3-4 所示，三次所测得的成活率始终是 ag 最高，gg 最低。但 ag 与 ga、aa 始终未有显著性差异，在第 60 天和 90 天，ag 与 gg 有显著性差异，第 105 天四组间都 未有显著性差异。存活的杂种优势为 9.27，g 组获得的杂种优势比 a 组大，其值分别为 9.89、8.68。 表 3-3 稚贝期的生长（a）和杂种优势（b） tab 3-3. survival rate（a）and heterosis (b) at juvenile stage 实验组 幼虫日龄 生长速度 60 90 105 (mm d - 1) a gg 10.38a（2.59） 14.38a（2.24） 22.67a（3.81） 0.273a aa 11.24ab（3.61） 20.86b（5.17） 32.10b（6.46） 0.464 b ga 11.50 ab（2.97） 22.01bc（4.70） 33.62bc（5.42） 0.492 b ag 12.17 b（2.33） 23.02c（3.31） 36.24c（8.06） 0.535 b b hp 2.38 1.51 1.60 1.52 h/ 9.48 27.78 27.55 29.00 表 3-4 稚贝期的存活率（a）和杂种优势（b） tab 3-4. survival rate (a) and heterosis (b) at juvenile stage 实验组 幼虫日龄 60 90 105 a gg 62.26a 68.97a 75.8a aa 80.85b 81.63ab 80.6a ga 82.35b 84.31ab 83.3a ag 85.19b 89.09b 87.6a b hp 1.31 1.80 3.02 h/ 17.07 15.14 9.27 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 20 3.1.3 讨论 太平洋牡蛎（crassostrea gigas）是一种优良的养殖品种，具有个体大，养殖周期短， 产量高，肉质肥美等优点，依赖于环境条件，它一年就可生长到 60-100mm（guo, 2009） 。 这个种是中国北方沿海的地方种，但中国养殖太平洋牡蛎却是从上世纪 80 年代从日本和 澳大利亚引进的外来种（guo, 2009） ，主要养殖在我国北方沿海。尽管中国渔业统计年 鉴中没有区分牡蛎的具体种类，但估计我国太平洋牡蛎的产量约占牡蛎总产量的 1/3。 而僧帽牡蛎主要养殖在我国南方，其产量甚至高于太平洋牡蛎。研究表明，中国南方的僧 帽牡蛎是和欧洲的葡萄牙牡蛎（c. angulata）是同一个种，而与中国北方的太平洋牡蛎在 外形上有些差异，可考虑作为太平洋牡蛎的一个亚种（wang et al., 2010） 。太平洋牡蛎与 葡萄牙牡蛎由于极其相似，曾经被误分类为同一物种。但是，alexandra leit o（1999）运 用 g 显带技术显示两种牡蛎具是不同的进化谱系；ofoighi（1998）和 boudry（1998）通 过线粒体细胞质铬氧化酶亚基（coi）基因的研究清晰的显示出遗传差异；huvet 也认为 两种牡蛎具有轻微但显著的差异。我们也通过 16s rrna 测序分辨出两种牡蛎，为实验奠 定了理论基础。 由于太平洋牡蛎的经济价值高，且是世界性分布，所以在进行遗传改良时，常用太平 洋牡蛎与其他牡蛎进行杂交。但是杂交往往不能够成功，表现在不能受精、受精卵不能孵 化、幼虫期死亡率高等几个方面，在国外的报道中，能够与 c. gigas 产生杂交后代的就只 有 c. rhizophorae、c. angulata 这两种。本研究在国内进行了 c. gigas 与 c.angulata 的杂交 实验，证实了在中国南方海域这两种牡蛎的杂交能够成功。由于生殖隔离是物种鉴定的最 基本的依据，所以种间杂交很难产生可存活的且具有繁殖能力的后代，而太平洋牡蛎与葡 萄牙牡蛎的杂交属于亚种间的杂交，所以更容易产生可存活的后代，这点在国外也已获得 证实。 汕头南澳岛曾被认为是广东省最大的太平洋牡蛎养殖基地，但是通过我们的分析南澳 岛现在养殖的牡蛎其实是葡萄牙牡蛎。南澳岛养殖的葡萄牙牡蛎近年来也出现了诸多问 题，且在本地育苗困难，我们希望通过本研究及杂交这一常规而有效的方法解决南澳牡蛎 养殖中存在的问题，为地方经济发展服务。 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 21 3.2 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎杂交及自交子代遗传多样性的比较 3.2.1 材料与方法 材料来源参照 3.1.1。 3.2.2 实验设计及取样 使用 2010 年 7 月建立的杂交和自交群体，在 2011 年 7 月从 4 个遗传组中分别随机取 40 枚，取出闭壳肌样品用于 dna 的提取，闭壳肌分别用 95酒精固定。使用微卫星分子 标记技术来分析 4 个遗传组间的遗传差异。 3.2.3 ssr 标记及分析 3.2.3.1 dna 的提取和微卫星 dna 的扩增 表 3-5 引物的位点、引物序列和退火温度 tab 3-5. microsatellite loci, their primer sequence and tm 位点 locus 引物序列 primer sequence (53) 重复序列 repeat array 退火温度( c) anneal.temp ucdcg-107 tcctgactgggcagttttct ggatgtgatgctggctatga (tatc)n (cata)n 53 ucdcg-140 tgctcaattcacagcaatcag tctgactgctgaacagcaaaat (ct)n 60 ucdcg-153 gcagcagcttcagagtgaaa caaaatctggtggaccttcg (gat)n 57 ucdcg-157 gggggatgtcggagaagtat aacagagaaaggtggattttagga (ga)n (taga)n 58 ucdcg-202 aatgaaaatgatgatgaggatga tgcatgtcgaacaaatccat (gata)n 50 dna 的提取使用东盛生物的基因组 dna 快速提取试剂盒。 使用 li gang 和 hubert 等（2003）开发的太平洋牡蛎微卫星引物，筛选出 6 条多态性 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 22 较高的引物用于分析。表 3-5 列出了所用引物的基本信息。 pcr 反应体系为 20 l， 包括 8 l 2pcr mix； 1 l 正反引物； 0.8 l 模板 dna； 9.2 l ddh2o。 pcr 反应程序使用 touchdown pcr(td pcr)程序，94预变性 3min；94变性 30s， 相应退火温度上升 10 30s，每下降 1进行 1 个循环；最后在 tm值上循环 20 次；72 延伸 7min；4下保存。 pcr 产物的检测在 6聚丙烯酰胺凝胶中分离，eb 染色，最后于凝胶成像系统 （bio-rad 720br/01438）中记录电泳结果。 3.2.3.2 数据统计与分析 用于多态性分析的遗传学参数有：等位基因数目（the number of allele，a） 、有效等位 基因数目（the effect number of allele，ae） 、观测杂合度（observed heterozygosity，ho）和 期望杂合度（expected heterozygosity，he） 、香农氏遗传多样性指数（shannons index，s） 。 3.2.4 结果 位点 ucdcg-140 和 ucdcg-202 在四个遗传组中 ssr 扩增的多态性图谱如图 3-1 所示。 图 3-1 位点 ucdcg-140 和 ucdcg-202在四个遗传组中 ssr 扩增的多态性 fig 3-1. polymorphisms among four different genetic groups at locus of ucdcg-140 and ucdcg-202 注：上图为位点 ucdcg-140；下图为位点 ucdcg-202 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎产生的杂交后代和自交后代的遗传多态性指标如表 3-6 所 示，5 个等位基因在四个遗传组中共得到 16 个等位基因（有效等位基因数 11.18） 。gg、 aa、ga 和 ag 在各位点的平均等位基因和有效等位基因分别为 3.00、3.20、3.00、2.80 和 2.1729、2.3278、2.2442、2.1980。各位点具有等位基因 2 到 4 个，每个位点平均有 3 个 等位基因（有效等位基因 2.24） 。观测杂合度的范围为 0.0250-0.7500，期望杂合度的范围 为 0.1597-0.6741，平均观测杂合度和期望杂合度分别为 0.3000、0.3200、0.3100、0.2850 第三章 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎群体间杂交子代及遗传多样性的比较 23 表 3-6 太平洋牡蛎与葡萄牙牡蛎产生的杂种和纯种牡蛎的遗传多态性 tab 3-6. allelic variability in hybrid and purebred oysters produced from two closely related species crassostrea gigas and c. angulata. 参数 遗传组 位点 ucdcg-107 ucdcg-140 ucdcg-153 ucdcg-157 ucdcg-202 平均值 a gg 2 3 3 4 3 3.0000 aa 3 3 3 4 3 3.2000 ga 3 3 3 4 2 3.0000 ag 2 3 3 3 3 2.8000 ae gg 1.1900 2.0164 2.4078 3.0389 2.2115 2.1729 aa 2.7754 2.3686 1.6763 3.0681 1.7505 2.3278 ga 2.2472 2.5417 2.0793 2.7850 1.5679 2.2442 ag 1.8089 2.8597 1.8307 1.4974 2.9935 2.1980 ho gg 0.0250 0.0750 0.7500 0.5750 0.0750 0.3000 aa 0.1000 0.4000 0.5000 0.2000 0.4000 0.3200 ga 0.1000 0.4250 0.5250 0.2250 0.2750 0.3100 ag 0.1250 0.5500 0.6500 0.0500 0.0500 0.2850 he gg 0.1597 0.5041 0.5847 0.6709 0.5478 0.4934 aa 0.6397 0.5778 0.4034 0.6741 0.4287 0.5447 ga 0.5550 0.6066 0.5191 0.6409 0.3622 0.5367 ag 0.4472 0.6503 0.4537 0.3322 0.6659 0.5099 p gg 0.000* 0.000* 0.1462 0.2190 0.000* aa 0.000* 0