外输泵抑制剂nmp通过调节群体感应系统和自溶抑制鲍曼不动杆菌生物被膜的机制研究（13级）

2016 大学生创新训练项目 题目：外输泵抑制剂NMP通过调节群体感应系统和自溶抑制鲍曼不 动杆菌生物被膜的机制研究 指导老师：王学林 于录 团队成员： 王超越 丁少明 金波 外输泵抑制剂NMP通过调节群体感应系统和自 溶抑制鲍曼不动杆菌生物被膜的机制研究 鲍曼不动杆菌为不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌，广泛存在 于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿 生殖道中，为条件致病菌。鲍曼不动杆菌（Ab）是医院感染的重要病 原菌。近年来的感染在增多，且其耐药性日益严重，已引起临床和微 生物学者的严重关注。Ab主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌 尿系感染、继发性脑膜炎等。Ab在医院的环境中分布很广且可长期存 活，对危重患者和CCU及ICU中的患者威胁很大，也将此类感染称做 ICU获得性感染。国内耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌发展很快，最近 又出现“全耐药”的鲍曼不动杆菌（Pan drug resistant acinetobacter baumanii），在台湾以及内地均已出现，应引起高度 警惕。 一.鲍曼不动杆菌（Ab）简介 随着研究和调查的深入，积累数据的增加，抗菌药物的耐药性问题已 引起各国政府，相关国际组织如WHO和OIE的重视，问题已显得非常严 重。当前，临床分离的鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物产生的耐药现象 在国内外已极其普遍，多重耐药菌正呈逐年增加之势，由鲍曼不动杆 菌引起的感染普遍存在，且耐药水平越来越高，防治日益棘手16， 致使鲍曼不动杆菌病的发病率仍然高居不下，成为当前鲍曼不动杆菌 耐药性的最大特点。而由细菌生物被膜引起的感染性疾病在临床治疗 上出现了巨大的困难17。至今未见针对细菌生物被膜的商品化抗菌 药物，所以，发现针对鲍曼不动杆菌生物被膜的抑制剂迫在眉睫。 二.抑制鲍曼不动杆菌生物被膜的必要性 由于外输泵表达的增强导致细菌群体感应系统和自溶的增加， 而群体感应系统和自溶与细菌生物被膜形成密切相关18。这样，使 用外输泵抑制剂抗菌能同时降低细菌生物被膜和外输泵介导的耐药性 ，起到一举两得的作用。同时，通过对外输泵抑制剂调节群体感应系 统和自溶抑制细菌生物被膜的机制研究，进一步研究细菌的耐药性机 制，对于临床应用具有重大意义19，采用有效的、可以临床应用的 耐药抑制剂降低细菌的耐药性。本研究将阐明NMP对鲍曼不动杆菌生 物被膜作用的分子机制20，为将NMP作为先导化合物进一步开发应 用奠定基础。 三.外输泵抑制剂NMP通过调节群体感应系统和自溶 抑制鲍曼不动杆菌生物被膜的机制原理 细菌耐药性（Resistance）又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的 耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降12。目前，细菌耐药性越 来越严重，缺少有效的、可以临床应用的耐药抑制剂。形成生物被膜（Biofilm） 是细菌抵抗不利外界环境所形成的一种形式，细菌生物被膜是指细菌粘附于固体 或有机腔道表面形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形 成的膜状物13。细菌间的多糖蛋白复合物形成孔道维持细菌物质代谢。常见的形 成细菌生物被膜的临床致病菌有金黄色葡萄球（Staphylococcusaureus）、大 肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆（ AcinetobacterbaumanniiA.baumannii）等14。细菌生物被膜介导（ Mediated）的耐药性能导致药物对细菌的最低抑菌浓度（MIC）提高10-100倍 15，外输泵介导的耐药性也是细菌固有的重要重要耐药机制，能显著提高细菌对 几乎所有抗菌药物的耐药性，故急需阐明开发细菌生物被膜和外输泵抑制剂。基 于鲍曼不动杆菌的致病性和严重耐药性，急需开发新型抗鲍曼不动杆菌药物。 已有报道表明：外输泵抑制剂能够细菌生物被膜，但是具体机制不清。我们 的前期研究初步证明：外输泵抑制剂能够通过调节群体感应系统和自溶抑制鲍曼 不动杆菌生物被膜，在本研究中，我们将通过分子生物学手段阐明这一机制。 四.细菌耐药性（Resistance） 1.内容 （1）通过结晶紫染色分析eDNA考察NMP抗鲍曼不动杆菌生物被膜活性 ； （2）使用荧光定量PCR分析NMP对鲍曼不动杆菌RND和adeABC表达的 抑制能力； （3）借助分析NMP对鲍曼不动杆菌群体感应系统AHLS信号分子的影响； （4）利用明胶酶谱分析NMP对鲍曼不动杆菌自溶成分自溶素的影响； 2.重点难点 本研究的重点是通过结晶紫染色分析eDNA考察NMP抗鲍曼不 动杆菌生物被膜活性，并以此为基础进一步分析NMP的机制研究；研究 难点是使用荧光定量PCR分析NMP对鲍曼不动杆菌RND和adeABC表达 的过程中内参的设定。 五.实验研究内容及重点难点 1、项目特色： 鲍曼不动杆菌是国际上感染重要致病菌之一，我们选择鲍曼 不动杆菌为模型菌，使实验更具代表性和一般性； 2、项目创新点： （1）本研究不同于以往的研究局限于一个因素的研究，而 是通过自溶和QS群体感应系统两个因素对细菌生物被膜进行研究 ，比以往的实验更具创新性； （2）目前，国内外致力于群体感应系统和细菌生物被膜的形 成机制的研究，未见将外输泵抑制剂、自溶、群体感应系统和细菌 生物被膜联系起来，具有创新性。 六.项目特色及创新点 1、优越的团队条件： （1）组内成员：王超越 丁少明 金波 （2）团队条件：我们团队一直对科学实验有着浓厚的兴趣，积极探 索、善于发现、勇于创新、吃苦耐劳、善于思考、具有较强的语言表达能 力。在学习上，我们努力学习，积极向上，奋力拼搏,王超越同学在2014 和2015年获得二等奖学金，同时在2015年被评为院优秀学生；丁少明和 金波同学在2014年高教社杯全国大学生数学建模联赛中获得吉林省赛区一 等奖。在生活上，我们细心负责，乐于沟通，真诚待人。 2、充分的前期准备： 从大一到大三一直都喜欢做实验，