生物工程专业毕业论文强冬性小麦抗冻蛋白基因iri的克隆及表达研究

目 录中文摘要（关键词）1外文摘要（关键词）1前言2第一章 强冬性小麦IRI基因的克隆.41材料与方法51.1实验材料51.1.1植物材料51.1.2处理方法51.1.3菌种和相关质粒51.1.4试剂.51.1.5生物软件. 61.1.6所用到的仪器.61.1.7所用到的引物.71.2实验方法71.2.1小麦总RNA提取71.2.2反转录合成第一链cDNA71.2.3IRI基因全长的扩增81.3结果与分析91.3.1小麦叶片总RNA的提取101.3.2IRI基因的分离101.3.3氨基酸序列比对.111.4讨论.12第二章 IRI基因的原核表达. 132.1材料和方法. 132.1.1菌种和载体132.1.2酶和试剂. 132.1.3 pET30a-IRI表达载体的构建及转化132.1.4 IRI蛋白的原核表达172.1.5 SDS-PAGE电泳分析172.2结果与分析172.2.1目的片段PCR产物结果.172.2.2 PET30a载体小提结果. 182.2.3 pET30a-IRI重组表达质粒的鉴定结果.182.2.3.1菌落PCR结果. 182.2.3.2酶切鉴定结果. 182.2.4重组质粒pET30a-IRI在BL21(DE3)中的诱导表达. 192.3讨论. . 19第三章 转基因载体的构建. 213.1材料和方法. . 213.1.1研究材料. . 213.1.2实验方法. .213.2结果与分析243.2.1引物PCR扩增结果243.2.2分步双酶切结果. .243.2.2.1 NCO I单酶切结果243.2.2.2BstE II单酶切结果253.2.3重组PCAMBIA1301-IRI转入DH5中，菌落PCR结果.253.3讨论 25结论27参考文献28致谢. 30 摘 要小麦（Triticum aestivum L.）是全球种植面积最大的粮食作物之一。小麦的抗寒力是限制小麦产量的主要因素之一。因此研究小麦的抗寒机理，对于提高小麦的抗寒力有着重要的理论意义。本文以强冬性小麦M808为试验材料，从低温诱导的小麦幼苗叶片中克隆出IRI基因的全长编码区并对其进行后续原核表达以及转基因研究。1.以抗寒力较强的M808为试验材料，设计简并引物，通过RT-PCR方法，从低温处理的M808幼苗叶片中克隆出4条小麦IRI基因全长序列，分别被命名为 TaIRI3、TaIRI4、TaIRI5、TaIRI6，其中TaIRI3、TaIRI4的序列长度均为 867 bp，编码 288 个氨基酸；TaIRI5、TaIRI6 的序列长度均为 858 bp，编码 285 个氨基酸。TaIRI5和TaIRI6与来源于小麦的TaIRI1基因和大麦的一个IRI基因亲缘关系较近，而TaIRI3、TaIRI4与TaIRI5、TaIRI6亲缘关系关系相对较远。2. 将IRI基因插入pET-30a表达载体合适位点，获得了pET-30a-IRI大肠杆菌表达载体。转BL21大肠杆菌菌株，经37 ，1mM IPTG诱导IRI融合蛋白的表达。3. 构建转基因载体，将IRI基因插入到PCAMBIA1301载体合适位置，为下一步通过转基因进行IRI基因功能研究奠定了基础。关键词：小麦；抗寒力；抗冻蛋白；基因克隆；体外表达AbstractWheat (Triticum aestivum L.) is one of the largest crop cultivation areas in the world and cold hardiness of wheat is one of the restrictive factors of crop improvement. Therefore, it has important theoretical significance for studying the cold hardiness of wheat to improve the cold hardiness of wheat. In this study we chose winterness wheat M808 as materials，IRI full-length genes are cloned from wheat seedlings during cold acclimation can be used to construct the IRI gene recombinant and to induce the expression of IRI protein and genetic transformation research for the next step. 1. Using the cold-resistant wheat cultivar M808 as test material. Four IRI full-length genes have been cloned by RT-PCR from cold inducible wheat seedlings leaves. They were named as TaIRI3, TaIRI4, TaIRI5, and TaIRI6. TaIRI3, TaIRI4 sequence lengths are 867 bp, which encode 288 amino acids. TaIRI5 and TaIRI6 sequence lengths are 858 bp, which encode 285 amino acids. TaIRI5 and TaIRI6 have a close relationship with TaIRI1 from wheat and IRI gene from barley. There is a far relationship between TaIRI3, TaIRI4 and TaIRI5, TaIRI6.2. Putting gene IRI into the pET - 30a suitable site, we successfully got the carrier expression vector. Then it was used to transform E. coli BL21, we will induced IRI fusion protein expression by 1mM IPTG at 37.3. Constructing transgenic carrier, in this work we insert gene IRI to PCAMBIA1301 proper position,this will laid a foundation for the next step on genetically engineered gene function of gene IRI.Keywords: Wheat (Triticum aestivum L.); Cold hardiness; Antifreeze protein; Cloning；Expression in vitro前 言低温所造成的冷害是影响许多植物产量和分布的主要环境因素。根据植物对低温的反应不同，可以将植物分为两类：一类是不抗寒植物，也称冷敏感植物；另一类是抗寒植物，也称冷不敏感植物。不抗寒植物原产于热带和亚热带地区，1012的非冰冻低温即可引起对植物生命活动的伤害。抗寒植物生长于温带地区，对低温都有一定的抵抗能力，但在不同植物之间又存在差异,。冷害是指零度以上低温对植物体所造成的伤害。引起冷害的温度一般为010，植物对低温敏感度与其原产地密切相关。冷害本质上是低温对植物体造成的生理损伤1。低温作用于植物会引起植物体内一系列生理、生化和分子生物学上的变化，使植物光合作用降低，呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强，导致植物受到伤害，产量下降，严重影响植物正常生长发育，更严重时还会造成植物死亡23。1.抗冻基因IRI与小麦抗寒性的关系低温是导致作物减产及植物死亡的重要原因之一。至今，低温对植物的伤害尚未找到根本的解决途径。因此，探索植物抗玲性的生理机制及其遗传因素不仅具有理论意义，在解决生产实际问题中也有广泛的应用价值。抗冻基因IRI全名Ice Recrystallization Inhibition，是小麦在遭受冷环境时，能够诱导表达出抵御冰冻害的抗冻蛋白又称冰结晶抑制蛋白，使小麦具有一定的抗冻能力，从而避免冰冻害对自身生长发育的影响21。抗冻基因IRI属于多基因家族，目前研究表明：IRI-1和IRI-2两条基因均能在冷诱导时表达出冰结晶抑制蛋白又称抗冻蛋白。抗冻蛋白最初是在极区海鱼中发现的一种低温特异蛋白质，它能阻止细胞内冰核的形成与生长，维持细胞的非冰冻状态，提高生物的抗冻性。Weiser最先提出，植物在抗寒锻炼中合成了新的蛋白质，其中包括抗寒锻炼的一系列酶，在这些酶的催化下，合成抗寒的物质基础。自20世纪60年至今，已经在鱼类、昆虫、真菌、无脊椎动物和脊椎动物发现抗冻蛋白的存在，植物抗冻蛋白的研究较晚。直到1992年，加拿大Griffith4首次获得了植物内源AFPs，他们从经过低温锻炼的可以忍受胞外结冰的冬黑麦（Secale cereale）叶片质外体中得到并部分纯化了抗冻蛋白。Antikainen等（1997）的研究发现，低温驯化后，AFPs只在抗冻的单子叶植物叶片质外体中积累。Kuiper等（2001）发现在多年生黑麦草（Loliumperenne）中的抗冻蛋白两侧各有一个缚冰域，这两个缚冰域能折叠成-转角，以增加其缚冰能力。黑麦的每个抗冻蛋白虽然仅含一个缚冰域，但是它们能聚集在一起形成寡聚体，从而产生多个缚冰域。1992年，简令成比较研究了4个不同抗寒性冬小麦品种在抗寒锻炼中蛋白质合成的变化，发现新合成的蛋白质种类数量与品种抗寒性成正相关。新近克隆到的植物抗冻蛋白基因还包括黑麦草1117kD的AFPs的cDNA。冬黑麦中3117 kD的AFPs的cht9基因，2418kD的AFPs的cht46基因。来自冬黑麦中的这2个抗冻蛋白基因，均已被转化到大肠杆菌中。检测结果表明，表达蛋白具有抗冻活性。随着研究的不断深入，已发现抗冻蛋白具有以下特性：抗冻蛋白的第一个显著特性是热滞效应。大量研究发现，抗冻蛋白降低溶液冰点的效率比一般溶质要高。在较低浓度下，抗冻蛋白降低溶液冰点的效应随其浓度增加而增强，在较高浓度下，这种效应逐渐趋于饱和。抗冻蛋白的效应可与NaCl等溶质的效应相加而共同使冰点大幅度降低。一般溶液(如NaCl，蔗糖溶液等)的冰点等于熔点，而抗冻蛋白在其溶液中只影响结冰过程，几乎不影响熔化过程，能以非依数性形式降低水溶液的冰点，对熔点影响很小，所以导致水溶液的熔点和冰点出现差值。这种现象叫做热滞效应，因而抗冻蛋白也被称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白5。抗冻蛋白的第二个特性是冰晶形态效应。抗冻蛋白有抑制冰晶生长的作用，而且这种作用在不同的方向上有强弱之分，因而引起冰晶形态的改变。冰通常以平行于晶格基面(a轴)的方式生长，在垂直基面(c轴)很少生长，因此冰晶格呈扁圆状。低浓度的抗冻蛋白优先抑制冰沿a轴生长，因此冰晶格的六边柱表面变得明显。而在高浓度的抗冻蛋白下，冰晶格主要沿c轴生长，形成六边双棱锥及针形晶体。有研究者认为，抗冻蛋白的这种作用，可以在生物体内调节胞外冰晶的生长形态，以尽量避免冰晶对细胞膜造成机械损伤6。 抗冻蛋白的第三个特性是抑制冰晶的重结晶。所谓重结晶是指在已经形成的晶体颗粒之间进行生长重分配，大的愈大，小的愈小。这种情况多发生在温度波动之时，往往对生物造成致命伤害。而抗冻蛋白具有抑制重结晶的作用，所形成的晶体体积小而比较均匀。抑制冰的重结晶对于某些生物特别是耐冻生物具有更重要的意义，而且引人注意的就是重晶化的抑制作用比冰晶生长的抑制作用更容易达到，即只需要少量抗冻蛋白(20gmL-1)，就有较高的重晶化抑制活性7。 因此抗冻基因IRI在冷环境中，诱导表达出的抗冻蛋白能够提高小麦抵抗冰冷环境的能力，从而提高其产量。2.强冬性小麦抗寒基因的研究现状与展望冬小麦作为耐寒力较强的越冬植物其抗寒性与冷诱导蛋白和抗冻蛋白密切相关,Kontogiorgos et al8。Takumi9从小麦中克隆了Wcor15基因，发现其与小麦Wcor14、WCS19和WLT10具有一定的同源性，证明了这些基因均属于COR基因家族的成员，将Wcor15转入烟草后发现其抗寒力有所提高。Badawi10分离了15个CBF基因，将其分别归并于CBF基因家族的5个类群里，同时与其它物种的CBF基因进行了系统进化分析。Badawi等在冬小麦中分离了两个ICE基因TaICE41和TaICE87，将TaICE87在拟南芥中过量表达后发现其使拟南芥AtCBF2和AtCBF3表达水平提高，进而提高了植株的抗寒力。目前对于小麦抗寒机理方面的研究主要集中在冷诱导蛋白COR及其转录因子上，而对于抗冻蛋白的研究相对较少。在小麦族中抗冻蛋白也被称为重结晶抑制蛋白（Ice Recrystallisation Inhibition，IRI）或IAPs(Ice-active proteins)。Sandve11从黑麦草和大麦中分离了15个IRI蛋白基因，并与水稻、拟南芥等相应同源基因进行了分子进化分析。Krishnanand12从黑麦草中分离了5个IAPs基因，比较结果表明其均具有IRI类似基因的典型结构特征，同时存在一定的差异。对其中3个基因进行体外表达和功能分析发现，IAPs均具有抑制重结晶的活性。Tremblay13等从冬小麦中分离了2个IRI蛋白基因TaIRI1和TaIRI2，并对两个基因进行了体外表达分析，但对于IRI蛋白基因的功能分析及遗传转化未做详细研究，限制了对IRI基因功能和表达调控机制的全面了解。冬小麦品种米808引自乌克兰，在无雪覆盖的条件下，经三年大面积试种实践表明，可耐受-30低温，在辽宁省铁岭以南可安全越冬，具有极强的抗寒性，谢立勇14。目前对于冬小麦米808抗寒蛋白的研究主要集中在冷诱导蛋白基因的克隆及功能分析上，而对于抗冻蛋白IRI基因家族组成和功能的研究相对较少，IRI基因家族成员间相互影响的研究尚未见报道22。本项目以米808为研究材料，对小麦IRI基因进行分离和鉴定，克隆其全长编码区，并对所克隆基因进行原核体外表达分析和转基因载体构建。这些将为阐明小麦低温胁迫过程中IRI基因表达调控机理以及更详尽的揭示小麦抗寒分子机制提供重要参考，同时为发掘新型抗寒基因和通过转基因技术提高小麦的抗寒力奠定理论基础。第一章 强冬性小麦IRI基因的克隆1.材料与方法1.1 实验材料1.1.1 植物材料强冬性小麦（Triticum aestivum L.）米 808（M808），由沈阳农业大学生物科学技术学院郭志富老师提供。1.1.2处理方法试验材料为强冬性小麦（Triticum aestivum L.）米 808（M808），精选籽粒饱满的小麦种子，将小麦表面用 75% 的酒精消毒，然后将种子放在垫有湿润滤纸的培养皿上，置于 25 恒温培养箱中发芽，保持种子充分湿润。待幼苗生长7 d 左右时，将小麦幼苗置于置于 4 冰箱中低温胁迫处理 24 h，低温处理过的幼苗用于提取RNA。1.1.3菌种和质粒试验所用大肠杆菌菌株 E.coli Top10 和 DH5 为沈阳农业大学生物技术中心保存。质粒载体 pMD-18 T购自 TaKaRa 公司。1.1.4试剂Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2000 DNA Marker、T 4连接酶、DNase I、TRNzol-A+Total RNA Reagent植物总RNA提取试剂盒、RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、氨苄青霉素（Amp）、RNasin、RNaseA、RNAsafe、X-gal、IPTG 等购于天根生化科技（北京）公司。M-MLV反转录酶购于 TaKaRa 公司；低熔点琼脂糖为Sigma 公司产品。液氮纯度为99.999%，由沈阳特种气体厂提供。LB培养基（1L）：细菌培养用胰化蛋白胨 10.0 g 细菌培养用酵母提取物 5.0 g NaCl 10.0 g 在 950 mL 去离子水中加入以上各溶质，充分搅拌溶解，滴加 5 molL-1 NaOH（约0.2 mL）调节 pH 值至 7.0，加入去离子水至总体积为 1 L（固体培养基每L加15 g琼脂粉），121 高压蒸汽灭菌 20 min。100 mgmL-1 氨苄青霉素（Amp）贮液：称取 100 mg Amp 溶于 1 mLddH2O中，用 0.22 m 滤器过滤除菌，-20 保存。0.1 molmL-1IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：称取 2 g IPTG 溶于 8 mL ddH2O中，充分混合溶解后定容至 10 mL，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，每份1 mL， -20保存。20 mgmL-1 X-Gal（5-溴-4-氯-3吲哚- D-半乳糖苷）：称取 1 g X-Gal 置于 50 mL离心管中，加入 40 mLDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后定容至 50 mL，每份 1 mL，-20 避光保存。0.1% DEPC（焦炭酸二乙酯）：取 1 mLDEPC，用去离子水定容至 1000 mL容量瓶中，剧烈振荡15 s，37 过夜。10 gmL-1 EB溶液（溴乙锭）：1 mg 溴乙锭加入 100 mL去离子水中，充分溶解后转移至棕色瓶中，室温避光保存。工作时稀释到 0.5 gmL-1。10TBE Buffer（pH 8.3）： Tris 108 gNa2EDTA2H2O 7.44 g硼酸 55 g定容至1000 mL，室温保存。上样缓冲液（6）：称取溴酚蓝 250 mg，加重蒸水 10 mL，室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 40 g，加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，混匀后加重蒸水定容至 100 mL，于4 冰箱保存备用。0.1 molL-1 CaCl2 溶液：11.1 g 无水 CaCl2，加入 10 mL1molL-1 的Tris-HCL溶液（pH 8.0），充分溶解定容至 1 L，高压灭菌，4 保存。含 15% 甘油的 0.1 molL-1 CaCl2 溶液：无水 CaCl2 1.11 g，甘油 15 mL，加入 ddH2O定容至 100 mL，充分溶解，高压灭菌，4 保存。DNase 储存液的配制：将 DNase 干粉（1500 Kunitz 单位）溶解在 550 L RNase-free ddH2O 中，轻柔混匀，分装后-20 贮存，可保存 9 个月。1.1.5生物软件应用的生物软件为 Primer 5.0、DNAMAN等。1.1.6主要仪器BIO-RAD PTC-200型PCR仪；BIO-RAD凝胶成像仪；HERMLEZ 233 MK-2台式微量冷冻离心机；超纯水仪（PALLPL 5243）；HITACHI SCR 20 BA 高速冷冻离心机；DYY-8 B稳压稳流电泳仪；HH-6恒温水浴锅；MP 200 A分析天平；MS2旋涡仪。1.1.7实验中所用到的引物IRI保守区扩增简并引物：TaIRIe-F：5-AGGATATCATGGCGAAATGC(G / T)GGCTG-3TaIRIe-R：5-GCCAAGCTTTCATTCATCTCCTACG-3TaIRIe22-F：5-AGGATATCCTGCCGGCGACGAGC-3TaIRIe22-R：5-GCCAAGCTTTCATTCATCTCCTGTT-3蓝色加粗为保护碱基，红色斜体为限制性内切酶位点1.2试验方法1.2.1小麦总 RNA 的提取采用TRNzol-A+Total RNA Reagent试剂盒提取小麦总 RNA。提取前准备：塑料制品：将枪头、EP管、枪头盒等，浸泡于0.1% DEPC溶液中过夜，高压灭菌，烤干备用。玻璃制品：0.5 molL-1 NaOH 浸泡研钵 10 min，用水洗净甩干，高压灭菌。准备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-free ddH2O、75% 乙醇（用Nase-free ddH2O配制）提取步骤：（1）样品处理：取 0.1 g 冷诱导处理的新鲜的小麦幼苗叶片在液氮中充分研磨成粉末，研磨要迅速，最好不要超过 1 min。加入 TRNzol-A+，大约每 100 mg 叶片使用1 mLTRNzol-A+。涡旋剧烈震荡混匀。（2）将匀浆样品在 1530 放置 5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。（3）4 12000 rmin-1离心 10 min，取上清（离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量 DNA，上清中含有 RNA）。（4）每使用 1 mLTRNzol-A+ 加 0.2 mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡 15 s，室温放置 3 min。（如不能漩涡混匀，可手动快速颠倒混匀 2 min）。（5）4 12000 rmin-1离心 1015 min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（约 500 L）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置 2030 min。（6）4 12000 rmin-1离心 10 min，去上清。离心前 RNA 沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。（7）加入1 mL 75% 乙醇（用RNase-free ddH2O配置）洗涤沉淀。每使用 1 mL TRNzol-A+ 至少用 1 mL 75% 乙醇对沉淀进行洗涤。（8）4 5000 rmin-1 离心 3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸沉淀。（9）RNA 沉淀置超净工作台上室温放置晾干（不要晾的过干，RNA 完全干燥后会很难溶解，大约晾干 23 min 左右即可），根据试验需要，加入 30100 LRNase-free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解 RNA。于 -70 保存备用。总 RNA 完整性检测：取 5 L RNA样品，于 1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳，150 v，15 min，结束后在BIO-RAD凝胶成像系统上观察并照相，通过观察 28 S rRNA 和 18 S RNA 的相对迁移率、亮度确定总 RNA 的完整性。完整的 RNA 条带 28 S rRNA的迁移率小于 18 S rRNA，其亮度是 18 S rRNA的 2 倍左右，并且整个泳道上没有明显的弥散现象。1.2.2 反转录合成第一链 cDNA第一链 cDNA 合成按 TIANGEN 公司的 TIANScriptM-MLV 说明书操作，具体步骤如下：（1）将以下成分加入到一个无核酸酶的离心管中：OligodT 2 LdNTP mixture（10 mM） 2 L总 RNA 5 LRNase-free ddH2O 4 L（2）70 加热 5 min后迅速在冰上冷却 2 min。简短离心收集反应液后加入以下各组分：5First-Strand Buffer 4 L0.1 M DTT 1 LRNasin（40 UL-1） 1 L（3）加 1 L（200 U）TIANScriptM-MLV反转录酶并轻轻用移液器混匀。（4）42 温浴 50 min。（5）95 加热 5 min 终止反应，置冰上进行后续试验或冷冻保存。1.2.3 IRI基因全长的扩增在植物 EST 库和 Genbank 中广泛查询 IRI 的相关序列信息，利用 Primer 5.0 软件结合 Blastn 进行序列比对分析，得到已经克隆的IRI基因的两端保守序列，设计 IRI 的简并性引物 IRIF，IRIR，以反转录得到的 cDNA 为模板, 以TaIRIe-F和TaIRIe-R 为引物以一下反应体系和反应程序进行 PCR 扩增：PCR反应体系：10X PCR Buffer 2.5LdNTP 1.2LTaIRIe-F/TaIRIe-F (10 M) 1.0/1.0 LcDNA 2 LTaq DNA polymerase 0.4LddH2O up to 25LPCR反应程序：94 5 min94 30 s53 1min30 s 30个循环72 45 s72 10 min4 保存1.3结果与分析1.3.1小麦叶片总RNA的提取采用 TRNzol-A+Total RNA Reagent 试剂盒提取小麦总 RNA 进行琼脂糖电泳检测，电泳结果显示 28S、18SrRNA 条带清晰，浓度比约为2：1，在电泳条带区没有弥散现象，说明提取的 RNA 未降解，符合后续的试验要求（图3-1）。图1-1 总RNA提取的电泳图谱1.3.2 IRI基因的分离：1 2 3 41000bp750bp图1-2 TaIRIe22-F和TaIRIe22-R组合，不同的退火温度下，PCR结果电泳图1.Marker 2.52度退火温度结果 3.53度退火温度结果 1 2 3 4 1000bp750bp 图1-3 TaIRIe-F和TaIRIe-R组合，不同的退火温度，PCR结果电泳图1.Marker 2.53度退火温度结果 3.54度退火温度结果 4.55度退火温度结果900bp左右1000bp750bp图1-4 TaIRIe-F和TaIRIe22-R组合，退火温度为53，PCR电泳结果得到IRI基因的全长序列,对克隆产物测序后的序列结果和在 NCBI 上的比对结果进行分析，结果表明所克隆的片段均具有 IRI 基因的典型结构特征，其中有些为同一基因的不同区段，整合后确定了 4 条不同的序列，分别被命名为 TaIRI3、TaIRI4、TaIRI5、TaIRI6，其中TaIRI3、TaIRI4的序列长度均为 867 bp，编码 288 个氨基酸；TaIRI5、TaIRI6 的序列长度均为 858 bp，编码 285 个氨基酸。1.3.3氨基酸序列比对将4条序列（TaIRI3、TaIRI4、TaIRI5、TaIRI6）与之前别人已测出的小麦TaIRI1（Triticum aestivum L.，AY968588）、黑麦草（Lolium perenne L.，EU680850）、大麦（Hordeum vulgare L.，EU887261）、发草（Deschampsia caespitosa L.，FJ663043）、羊茅（Festuca ovina L.，EU684537）等小麦族的其它序列进行氨基酸序列分析和比对，结果表明，4 条序列均与具有小麦族 IRI 基因的典型结构特征，都含有亮氨酸富集重复区（LRR，leucine-rich repeat）和以NxVxG为重复单元的重结晶抑制区（RI，recrystallization inhibition），这些功能域在植物抗寒机理中起重要作用。4 条序列均与已知小麦族同类基因存在相同的功能域，又与小麦族同类基因间存在明显差异。图1-5 IRI基因的氨基酸序列比较图1.4讨论IRI基因家族对小麦族物种抗寒性提高具有重要的作用，但目前所报道的 IRI 基因家族成员数目有限，只有黑麦草、大麦、发草、羊茅等小麦族的物种，因而限制了对IRI基因家族详细的进化分类分析，日后有待于进一步发掘小麦族物种中其它的 IRI 基因变异类型。本试验中所得到的 4 个IRI基因与小麦族中的小麦、黑麦草、大麦、发草和羊茅的相应基因氨基酸序列进行分析和比对。结果表明，来源于小麦族不同物种的所有IRI基因氨基酸序列具有较高的相似性，均包含两个功能区：亮氨酸富集重复区（LRR，leucine-rich repeat）和以NxVxG或NxVxxG为重复单元的功能域重结晶抑制区（RI，recrystallization inhibition）。这两个区域被认为可能与IRI蛋白抗冻特性密切相关（Sandve et al，2007）。IRI基因存在较高保守性的同时，在个别区域也存在较多的氨基酸变异，尤其是在IRI基因的两个重要的功能区域，这些变异很可能导致IRI基因家族不同成员间的功能差异。第二章 IRI基因的原核表达克隆的基因只有通过宿主细胞中的表达才能进一步研究其功能和调控机理，同样也只有通过表达才能获得克隆基因所编码的蛋白质Badawi M17为进一步研究及验证克隆的IRI的结构与生物学功能，本试验以大肠杆菌作为宿主，构建了pET30a-IRI原核表达载体，并进行表达。2.1材料和方法2.1.1菌种和载体大肠杆菌菌株DH5、BL21（DE3），表达载体pET30a均为本实验室保存。2.1.2酶和试剂Hind、EcoR、低分子量蛋白质Marker为大连宝生物公司产品；质粒提取试剂盒为北京天根公司产品。2.1.3 pET30a-IRI表达载体的构建及转化设计引物，在引物的5端添加限制性内切酶位点，PCR扩增IRI片段，用EcoRV和HindIII同时双酶切IRI片段和pET30a（+）载体质粒，酶切后的IRI片段和pET30a（+）质粒连接后转化 E.coli Top10感受态细胞，克隆经HindIII和EcoRV双酶切鉴定后确定为pET- IRI原核表达载体。（1）引物的设计 根据IRI全长和原核表达载体选择酶切位点，并在5端和3端添加限制性内切酶位点，在酶切位点外添加保护碱基。设计的引物如下：TaIRIe-F：5-AGGATATCATGGCGAAATGC(G / T)GGCTG-3 TaIRIe22-R：5-GCCAAGCTTTCATTCATCTCCTGTT-3 蓝色加粗为保护碱基，红色斜体为限制性内切酶位点（2）插入片段的PCR扩增PCR反应体系和反应程序按照1.2.3进行然后利用DNA凝胶电泳回收试剂盒将目的片段进行回收，放在-20冰箱中保存备用。（3）载体质粒和PCR产物的酶切和连接 1. 按照下面的酶切体系对PCR产物和载体质粒同时进行双酶切，酶切体系： 10X K buffer 2 l PCR产物质粒载体 5 l HindIII 1 l EcoRV 1 l ddH2O 11 l 总计 20 l酶切反应在37下进行3到4小时即可。2. 将全部样品加入琼脂糖胶中电泳后分别切胶回收IRI片段和pET30a片段。 3. 酶切后的IRI片段和pET30a片段在10l连接反应体系中进行16连接过夜。连接体系： sterile water 2 l 10X T4DNA Ligase buffer 1 l 插入片段 5 l 载体质粒 (50 ng/l) 1 l T4 DNA Ligase 1 l 总计 10 l原核表达载体构建示意图如下： 用EcoR V和Hind 进行双酶切，然后用Ligase将载体和目的片段进行连接 （4）大肠杆菌 DH5 感受态细胞的制备：1.从超低温冰箱中取出 DH5 菌种，置于冰上。在超净工作台上用烧过的接种环插入冻结的菌中，然后在 LB 固体培养基平板上交错划线，于37 过夜培养直至长出单斑。2.取 1 支无菌的摇菌试管，在超净工作台上加入 2 mL LB（不含抗生素）培养基，用烧过的接种环挑取良好单斑接种于试管中，37 摇床培养过夜。3.取 0.5 mL 上述菌液转接到含有 50 mL LB 培养基的三角烧瓶中，37 下 250 rpm 摇床培养 2-3 h，直至 OD600 值达到 0.4 左右。以下操作除离心以外，都在超净工作台上进行。4.将菌液倒进预冷无菌的 50 mL 离心管中，于冰上放置 10 min，然后于 4，4000 rpm 离心 10 min。5.将离心管倒置 1 min 以倒尽上清液，加入 10 mL冰冷的 0.1 molL-1CaCl2 溶液，悬浮细胞，插入冰中放置 30 min。6.4，4000 rpm 离心 10 min，弃上清液，倒置 1 min，加入 4 mL 冰冷的预含 15% 甘油的 0.1 molL-1 CaCl2 溶液垂悬细胞，冰上放置 5 min。7.在超净台上按每管 100 L 分装到 1.5 mL 离心管中，可以直接用作转化实验或者立即放入-70 超低温冰箱中保存。（5）重组质粒转化大肠杆菌DH5感受态细胞取5l连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，涂布于含50 g/ml卡那霉素（ kanamycin）的LB平板上，37，过夜。 转化过程如下：1. 从-70冰箱中取出一定数量的100l感受态细胞悬液(如有必要，包括一管测试质粒阳性对照)。将小管迅速置于冰上使之除了管盖都在冰浴中。冰浴融化5-10分钟。2. 将5l连接产物或适量质粒DNA直接加入细胞中，手指轻弹管底部混匀。冰浴放置30分钟。确保除了管盖其他部分都置于冰中。 3. 42水浴热击45S , 不可摇动。 4. 迅速置于冰浴冷却3-5分钟。5. 向管中加入900L LB液体培养基(不含抗生素)，37，250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。6. 将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含抗生素的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养过夜（12-16小时）。（6） pET30a-IRI重组表达质粒的鉴定 从LB平板上挑取6个白色单菌落，分别稀释到10l无菌水中，取2l做菌落PCR，剩下8l添加到1ml含抗生素的LB液体培养基中，37、250rpm振荡培养约3小时。（7）菌落PCR鉴定 以上述2l菌落为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系及PCR程序同1.2.3。（8）酶切鉴定根据菌落PCR的结果挑选两个阳性克隆在5mlLB液体培养基中，37，250rpm过夜培养。富集4.5ml 菌液提取质粒，20l体系酶切提取的质粒，37反应4h。反应结束后，将全部酶切产物于1琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。酶切体系： 10X K Buffer 2 l Plasimid 5 l HindIII 1 l EcoRV 1 l ddH2O 11 l 总计 20 l(9)重组质粒转入BL21表达菌取5l重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于含50 g/ml卡那霉素（ kanamycin）的LB平板上，37，过夜。 转化过程同上。然后按以上同样的方法进行菌落PCR和酶切鉴定。质粒小提：收集过夜菌体：取1.5 ml培养物倒入Eppendorf管中，12000 r/min离心l min，去上清。富集两次。将细菌沉淀悬浮于150 l预冷Solution 中，加入Rnase A，充分涡旋，置于冰上5 min。 加350 l Solution (现用现配)，轻柔颠倒数次，置于冰上5 min。 加入250 l冰上预冷Solution，轻柔颠倒数次，置于冰上5 min。 12000 r/min离心10 min，将上清液转入另一新Epepndfor管中，加入等体积氯仿-异戊醇抽提蛋白，重复23次。 将上清液转入另一干净Eppendorf管中，加入2倍体积预冷无水乙醇，充分混匀后20放置l h。12000 r/min离心10 min，弃上清，吸干残余物液体。 用1 ml70%无水乙醇洗涤质粒DNA沉淀，5000 r/min离心3 min，弃上清，空气中干燥后加入50 l超纯水溶解，4保存。（9）测序取2-