FISH技术在血液疾病诊断中的应用ppt演示课件

荧光原位杂交（FISH）技术 血液肿瘤诊疗中的应用 1. 一、技术 二、质控 三、 临床应用 四、多技术结合应用案例 技术术理 论论 2. 1950-19601960-19701970-19801980-1990 显带时显带时 期 非显带时显带时 期 1888 提出 染色 体 1914 染色 体 畸 变导 致肿 瘤 1956 确定 染色 体46 条 1958 应用 于血 液学 1960 发现Ph 染色体 CML 显带技 术高速 发展 G/R 多种血 液病相 关异常 核型被 发现 FISH 中期/间间期 多色 FISH 微阵列技术 aCGH、aSNP CGH技术术 分子遗遗 传传 细细胞遗传遗传学发发展简简史 3. FISH技术术的发发展 1990年FISH 1992年CGH 1996年24色FISH （SKY、M-FISH、RX-FISH） 2001年array CGH 4. 技术术原理 AG G C T A T TC C G A T A COVALENT BOND F F Specimen DNA FISH Probe DNA 5. 操作步骤 FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备 ） 探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针 ） 探针标记 杂交（76变性10min、37杂交10h） 洗脱 DAPI复染 荧光显微镜检测 结果分析 6. FISH技术术的特点 操作简便，稳定，人员培训较快 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，24小时就可以完成检测 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞 皆可以被检测 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞 7. FISH技术术的局限性 异常检测检测取决于能否获获得相应应探针针 三体检测检测敏感性高于单单体或缺失 骨髓、外周血标标本较实较实体瘤、石蜡切片好处处理 不能检测检测全基因组组异常（间间期FISH） 8. FISH主要仪仪器 FISH分析工作站（荧荧光显显微镜镜、分析照相软软件 ） 荧荧光原位杂杂交仪仪 恒温水浴槽 高速离心机 培养箱 微量加样样器 pH仪仪 9. FISH技术术比较较 FISHSKY M- FISH RX-FISHCGHaCGH 全染色体扫描 平衡易位 部分 不平衡易位 部分 倒位 部分 缺失 部分 扩增 部分 非整倍体 分辨率 1-10 kb2-10 Mb2-10 Mb3 Mb10-100kb 10. FISH探针针种类类 着丝粒探针 位点探针 涂染探针 11. 双色单单融合探 针针 12. 额额外信号探 针针 13. 双色双融合探针针 14. 正常 异 常 15. 双色分离探 针针 16. 数量、位点探针针 17. 人类细类细胞遗传遗传学命名 18. nuc ish(CEP82)400 nuc ish(BCR,ABL)2400 nuc ish(BCR,ABL)3,(BCR con ABL2)380/400 nuc ish(MLL2)400 nuc ish(MLL2)(5MLL sep 3MLL1)100/200 nuc ish(CEPX2)2/(CEPX,CEPY)1398 19. A: nuc ish(ABL,BCR)2 B: nuc ish(ABL 2,BCR 3) ABL BCR A ABL BCR B 20. A: nuc ish(ABL,BCR)3(ABL con BCR2) B: nuc ish(ABL,BCR)4 (ABL con BCR3) C: nuc ish(ABL 3,BCR 2) (ABL con BCR1) ABL BCR B BCR ABL AC ABL BCR 21. TEL AML1 A: nuc ish(TEL2,AML13)(TEL con AML11) B: nuc ish(TEL1,AML14)(TEL con AML11) C: nuc ish(TEL2,AML15) AML1 TEL/AML1 A AML1 TEL B C 22. ABC D5S721 D5S721 D5S721 EGR1 EGR1 EGR1 A: nuc ish(D5S23/D5S7211,EGR11) B: nuc ish(D5S23/D5S7212,EGR11) C: nuc ish(D5S23/D5S7213,EGR11) 23. 质质量控 制 24. 质质量管理内容 商品探针针、自配试剂验证试剂验证 标标准化流程及规规范化操作（前处处理、实实验验操作） 规规范判读标读标准 建立本实验实验室判读阈值读阈值 建立临临床生物参考区间间 25. FISH操作流程 样样本制备备：细胞、骨髓、外周血、组织 等 制片：细胞悬液滴片或石蜡组织 切片 预处预处理：2SSC，固定液，NaSCN 酶消化：胃蛋白酶，蛋白酶K 变变性：温度 杂杂交：互补结 合，温度 洗涤涤：无附离子溶液，PH，温度 复染：DAPI II 读读片 ： 荧光显微镜，滤镜 26. FISH技术术要 点 样样本浓浓度、切片厚度、细细胞状态态 充分低渗与固定 制片环环境温度与湿度 探针针充分混匀 变变性液pH与温度 橡皮泥严严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂变剂 27. 规规范判 读读 规规范正常和异常信号 杂杂交成功率75% 计计数数量、方法： 单单人，分别别于不同区域各连续连续计计数200个细细 胞 双人，每人于不同区域各计计数200个细细胞 28. 计计数规规 范 29. 信号判读误读误 差 30. 分离信号误误 判 31. 石蜡切片误误 差 32. 建立阈值阈值 选选取正常样样本10-20份建立针对针对探针针的假阳性率 统计统计方法 x+3SD 分布（95%可信区间间） 结结合临临床逐步建立生物参考区间间 33. 结结果及报报告 34. 35. 临临床应应 用 36. FISH临临床应应用 检测检测染色体数目与结结构异常 疗疗效分析 鉴鉴定标记标记染色体 检测检测早期复发发 鉴鉴定移植后早期复发发 鉴鉴定肿肿瘤细细胞的细细胞系列 基因定位、病灶组织组织定位 37. FISH常用探针针的组组合应应用 探针种类检测目的 慢性粒细胞白血病（CML）： BCR/ABL (融合探针) BCR/ABL/ASS1 t(9;22) t(9;22)伴ASS1基因缺失 38. 探针种类检测目的 急性髓系白血病（AML）： PML/RARa (融合探针) RARat(15;17) AML1/ETO (融合探针)t(8;21) MLL（11q23）(分离探针)t(v;11) CBFB（16q22）(分离探针)inv(16)；t(16;16) EVI1(3q26) (分离探针)t(3;3);inv(3) 39. 探针针种类类检测检测 目的 急性淋系白血病（ALL）： BCR/ABL (融合探针针)t(9;22) TEL/AML1 (融合探针针)t(12;21) TCF3/PBX1 (融合探针针)t(1;19) MLL（11q23）(分离探针针)t(v;11) IGH（14q32）(分离探针针)t(v;14) 40. 探针针种类类检测检测 目的 骨髓增生异常综综合征（MDS）： CEP8 (位点探针针)+8 EGR1/D5S721（5q31;5p15.2） (双位点探针针) -5；del(5q31) D7S486/CEP7（7q31;7p11-7q11） (双位点探针针) -7；del(7q31) D20S108（20q12）(位点探针针)del(20q12) EVI1(3q26) (分离探针针)t(3;3);inv(3) 41. 探针针种类类检测检测 目的 淋巴瘤、慢性淋巴细细胞白血病： RB-1（或D13S319)（13q14）(位点探针针) del(13)(q14) IGH（14q32）(分离探针针)涉及IGH基因异常初筛 P53（17p13.1）(位点探针针)P53基因缺失 CCND1/IGH (融合探针针)CCND1t(11;14) MYC（8q24）(分离探针针)IGH/C-MYC涉及MYC基因异常初筛 ATM（11q22.3）(位点探针针)ATM基因缺失 CEP12 (位点探针针)+12 BCL6（3q27）(分离探针针)涉及BCL6基因异常初筛 BCL2（18q21）(分离探针针)IGH/BCL2涉及BCL2基因异常初筛 42. 探针种类检测目的 多发性骨髓瘤（MM）：（建议应用CD138分选细胞） RB-1（13q14）(位点探针)RB-1基因缺失初筛检测 IGH（14q32）(分离探针)涉及IGH基因异常初筛 P53（17p13.1）(位点探针)P53基因缺失 CKS1B/CDKN2C（1q21;1p32.3） (双位点探针) 1q21扩增;del(1p32) FGFR3/IGH (融合探针)t(4;14)IGH阳性标 本后续检测 MAF/IGH (融合探针)t(14;16) CCND1/IGH (融合探针)t(11;14) MAFB/IGH (融合探针)t(14;20) 43. 探针种类检测目