超声辅助酶解法提取马齿苋总生物碱.doc

超声辅助酶解法提取马齿苋总生物碱摘要：超声波辅助纤维素酶解法提取马齿苋中总生物碱，溴甲酚绿比色法测定生物碱含量，结合正交试验研究超声波辅助纤维素酶提取马齿苋中总生物碱的最佳提取条件是：50，100min，ph=5，酶为3mg/g，马齿苋生物碱的提取率为0.3624%。关键词：马齿苋；生物碱；提取；紫外分光光度法马齿苋是马齿苋科一年生肉质草本植物，民间俗名长命菜、瓜子菜、安乐草等。全草均可入药，是药食同源的植物，作为传统中药草，早在明朝李时珍本草纲目就对它有详细介绍。近年来研究表明，马齿苋中的有效成分如生物碱、多糖、黄酮、蒽醌等1，不仅有抗心血管疾病2和抗氧化3的功效，而且具有很高的抗癌作用4，许多生物碱是抗癌的有效成分5，有文献记载马齿苋含有生物碱6-7。白冰等8研究发现马齿苋降糖作用与马齿苋中的生物碱类和多糖类组分的-葡萄糖苷酶抑制活性有关，并阐明了马齿苋降血糖作用的机制。目前，荷兰、英国和法国等西欧国家已人工繁育出马齿苋蔬菜专业品种，美国已开发出多种马齿苋保健食品9。马齿苋生物碱的成分复杂，据文献报道主要是以酰胺类结构为主10，因此，对于马齿苋生物碱的提取主要集中于总生物碱的提取。马齿苋中总生物碱的提取工艺有乙醇提取11和超声波法10。超声波法作为正在发展的新兴技术，与传统提取工艺相比，具有快速、高效、节能等优点，该法是利用超声波增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高天然产物溶出速度和溶出次数，缩短提取时间的浸提方法。酶解法是利用纤维素酶或果胶酶将植物细胞壁的纤维成分水解或降解，进而缩短提取时间的浸提方法。而将超声波和纤维素酶解法联用提取马齿苋中总生物碱尚无文献报道。本文利用超声波辅助纤维素酶解法对马齿苋总生物碱的提取进行研究，以期确定最佳工艺条件，为工业化生产提供理论依据。1 实验部分1.1仪器与试剂仪器：agilent8451紫外分光光度计（美国agilent）；phs-3型酸度计（上海精密科学仪器有限公司 ），离心机，超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），旋转蒸发仪re-52aa（上海生化仪器厂）。材料及试剂：野生马齿苋（采集于滨州惠民农田），纤维素酶（30units/mg），盐酸，石油醚，（60-90），咖啡因（滨州市药检局订购），无水乙醇，溴甲酚绿，所用试剂均为分析纯。1.2标准溶液的配置配成咖啡因醇溶液，质量浓度为1.0mg/ml，溴甲酚氯缓冲溶液11；准确称量溴甲酚氯125mg ，用浓度为0.2mol/lnaoh溶液12.50ml溶解后，加入邻苯二甲酸氢钾2.55g，加少量蒸馏水溶解后，转移至250ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度摇匀。用ph计校正使ph=4.42。1.3生物碱的提取分离和测定1.3.1总生物碱的提取和分离将十月份采摘的马齿苋全草洗净晒干粉碎呈粉末状。准确称取5g马齿苋干草，加入适量的纤维素酶，取50ml已调好酸度的盐酸水溶液置于超声波仪器中提取， 对提取液用浓氨水调ph=9-10，石油醚萃取3次，合并萃取液蒸干石油醚，得生物碱固体。1.3.2马齿苋生物碱的测定将生物碱精制品乙醇定容10ml，用刻度移液管准确移取1ml上述溶液至10ml 的容量瓶中，分别加入溴甲酚氯缓冲溶液和2ml无水乙醇溶液用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后用试剂空白为参比，于波长620nm处测定其吸光度。1.3.3马齿苋生物碱提取率的计算将提取液测得的吸光度代入标准曲线方程可计算出生物碱含量c（mg/ml），则生物碱提取率为：1.4标准曲线的绘制用刻度移液管准确移取咖啡因乙醇溶液于0ml，0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml于0，1，2，3，4，5，6号10ml容量瓶中再分别加入1ml溴甲酚氯缓冲夜和2ml无水乙醇溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用0号容量瓶中溶液为空白参比，于620nm处测定1，2，3，4，5，6号容量瓶试剂的吸光度，得到直线方程a= 11.0969c-0.11252，r2=0.99978。经过线性回归处理得到咖啡因的标准曲线（如图1）。图1咖啡因标准曲线2 实验结果与讨论2.1单因素实验 因超声波仪器的最大超声功率为400w，超声频率45khz，条件均较温和不会破坏生物碱的结构，本实验均在400w，45khz条件下结合其他条件提取。2.1.1酶解温度对生物碱提取率的影响称取1.0g马齿苋5份分别置于5个平底烧瓶中，各加入纤维素酶3mg及50ml水，分别置于温度为40、45、50、55、60超声波清洗容器中，超声酶解100min，趁热抽滤各提取液，冷却后测吸光度，得到酶解温度对生物碱提取率的影响关系图（如图2）。图2 酶解温度对生物碱提取率的影响2.1.2时间对生物碱提取率的影响称取1.0g马齿苋5份分别置于5个平底烧瓶中，各加入纤维素酶3mg和50ml ph=5的盐酸溶液，在50超声环境中提取，分别提取30min、60min、90min、120min、150min，趁热抽滤各提取液，冷却后测吸光度，得到时间对生物碱提取率的影响关系图（如图3）。图3 时间对生物碱提取率的影响2.1.3酶解ph对生物碱提取率的影响称取1.0g马齿苋5份分别置于5个平底烧瓶中，各加入纤维素酶3mg，再分别加入ph为4、5、6、7、8的盐酸水溶液50ml，在50的超声环境中提取100min，趁热抽滤各提取液，冷却后测吸光度，得到ph对生物碱提取率的影响关系图(如图4)。图4 ph对生物碱提取率的影响2.1.4酶用量对生物碱提取率的影响称取1.0g马齿苋5份分别置于5个平底烧瓶中，分别加入纤维素酶1mg、2mg、3mg、4mg、5mg，再分别加入50ml盐酸溶液，在50的超声环境中提取100min，趁热抽滤各提取液，冷却后测吸光度，得到酶用量对生物碱提取率的影响关系图（如图5）。图5 酶用量对生物碱提取率的影响2.2正交实验通过上述单因素实验，得出了单个因素的最适条件，但超声酶解各因素之间是相互影响的，为进一步探讨最佳提取条件。将温度（a）、时间（b）、酸度（c）、酶用量（d）4个可能有交互影响的因素在400w，45khz超声条件下进行了4因素3水平l9（34）正交实验。因素水平设计见表1，实验结果见表2。表1 正交实验的因素与水平水平（a）温度（b）时间min（c）酸度（d）酶用量mg14060422501005336015064表2 l9(34)正交实验结果编号温度时间酸度酶用量提取率/%111110.2955212220.2805313330.2666421230.3224522310.3624623120.3316731320.2762832130.2820933210.2029k10.84260.89410.90910.8608k21.01640.92490.80580.8883k30.76110.80110.90520.8710k10.28090.29800.30300.2869k20.33880.30830.26860.2961k30.25370.26700.30170.2903r0.08510.04130.03440.0092为进一步确定各因素对生物碱提取率的影响程度，对表2中的数据进行方差分析和显著性检验（见表3）。表3正交实验方差分析方差来源离差平方和自由度均方f值酸度0.0113363120.0056681587.98597768温度0.0027693420.0013846721.49405819时间0.0022851620.0011425817.73612860误差总和0.0001288420.000064420.0165196680.00206496通过正交实验研究，超声波辅助酶解酶用量对生物碱提取率的影响最小，而 a、b、c三因素对提取率的影响显著，而d因素对提取率的影响不显著7。根据以上分析，可以得到影响实验结果的因素的显著顺序为cabd。3 结论通过研究超声波辅助酶解的温度、时间、酸度及酶用量对马齿苋生物碱提取的影响，结合正交实验设计，得到马齿苋总生物碱的最佳提取条件：酶解温度50 、ph为5 、提取时间为100min、酶用量为3mg/g。在最佳提取条件下，马齿苋生物碱的提取率为0.3624%。通过正交实验数据进行了方差分析和显著性检测，分析结果表明，各影响因素对生物碱提取率的显著性影响顺序为：酸度温度时间酶用量。 通过实验结果表明，该方法对马齿苋总生物碱的提取率高，为马齿苋生物碱提供了一条较好的提取工艺，为马齿苋生物碱保健食品的开发具有一定的理论指导价值。参考文献1孟凡清, 武荣贵. 马齿苋的药用价值评价j. 林业勘查设计, 2008(1):77-78.2贺圣文,刘同美,尤敏,等.马齿苋对家兔实验性高脂血症的防治作用j.中草药,1997,28(04):221-223.3贺圣文,刘同美,尤敏,等.马齿苋对家兔体内抗氧化能力的影响j.中草药,1997,28(05):284.4曾宪伟,操家璇,李玉萍,等.马齿苋生物碱对a-549细胞的抑制作用j.江西食品工业, 2009,01期:024-026.5徐小龙,邹建国,刘燕燕,等.药用生物碱的应用与分离纯化技术j.食品科学,2009,30(15):238-241.6胡月英, 宣明盛.云南抗癌中草药m.昆明.云南人民出版社,1982,180-185.7南京药学院编.中草药（中册）m.南京.江苏人民出版社,1976,197.8 白冰, 李玉萍, 叶军, 等. 马齿苋活性成分中-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选j.安徽农业科学,2009,37(2):657-658,600.9 cheng-jie chen, wan-yinwang, xiao-liwang, et al.anti-hypoxic activity of the ethanol extract from portulaca oleracea inmicej.journal of ethnopharmacology, 2009, 124:246-250.10徐鹤, 张海悦, 蔡苗. 超声波辅助提取马齿苋总生物碱的研究j. 食品工业科技, 2011,32(7):316-319.11王仲英,李香兰,宣春生.马齿苋总生物碱的测定j.太原理工学报,2001,32(2):197-198.ultrasound bath-assisted enzymatic hydrolysis procedures as extraction technology of the total alkaloid from portulacaabstract：total alkaloid from portulaca was extracted by ultrasound bath-assisted enzymatic hydrolysis procedures, through bromine cresol green colorimetric determinating alkaloid content. combined with the orthogonal experiment research, best condition of total portulaca