NY336-1998

N Y 336- 标准起草单位:中国农业大学。木标准卞要叔草人:梅汝鸿、徐维敏、蒋慧敏。中华人民共和国农业行业标准增产菌筛选方法36抱杆菌(增产菌的筛选技术指标、筛选方法。本标准适用于芽抱杆菌增产菌新菌株的筛选。2引用标准列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修汀，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 3309 2Y 337产菌采用了从植物体内分离内生共生芽泡杆菌菌株的筛选方法，经过菌株纯化、生物测定、菌株鉴定、复壮促活，筛选出的菌株通过两年两点田间试验和多点试验，选择能够稳定提高植物产量、改进品质、增强抗逆性，并且经安全性测定，对人、畜及植物无毒、无害，对环境无污染的菌株，供生产使用。h，严格进行表面消毒，然后捣碎制成悬浮液，沉淀。h,色和镜检，选取芽泡杆菌的单菌落移到斜面培养基上编号、培养，择生物测定较佳纯菌株再进行田间试验。病等效果好的菌株，并经安全性检查对人、畜及植物无毒，对环境无污染的菌株，才可提供生产使用。杀死杂菌。在28度下培养1824 h，括种子、植株或块(根)茎，置于含芽抱杆菌浓度有101悬浮液中浸泡1 一一一一一一a)徉本植株应与所选的增产菌施用作物相一致;b)要选择在产量、品质或各种抗逆性方面比同类植株有明显优势的植株;c)选好样品植株后，进行编号、登记，立即分离或置于4菌操作室或超净工作台、灭菌锅、水浴箱、冰箱、温箱、灭菌研钵和研棒、灭菌管(5 0 磁力振荡器、灭菌平皿、灭菌试管、无菌水、酒精灯、接种环、显微镜、玻片、灭菌玻璃球。试剂,氧化钠、盐酸、漂白粉、品红、孔雀绿和香柏油等。2. 生化试剂)、蛋白陈(生化试验)、琼脂(生化试剂)g,蛋白陈10 g,氯化钠，琼脂2030 g,蒸馏水1 000 3培养基制法将琼脂加热化开，加牛肉汁和蛋白陈，再加热溶解，用。il 的盐酸或0. 1 氢氧化钠溶液调装三角瓶或试管置灭菌锅内，在。1 、叶、花和果实、种子或块茎(根)组织冲洗24 h，严格进行表面消毒，然后取组织入装有40 200分离表皮以内的细菌，漂白粉液表面消毒再振荡，静置0. 5 灭菌吸管取5 -5 无菌研钵研碎后，水浴锅内恒温处理20 后用灭菌移种环蘸取试管内处理液，在牛肉膏蛋白陈培养基平板上划线划线方法:先在培养皿平板的半边顺序划线，再将培养皿转90,，将移种环灭菌后从第二条线处开始顺序划线(或用无菌涂棒，将菌液均匀地涂布在平板表面，必要时采用稀释平板法或单菌落)，置28下培养24 菌落大小、形状、圆或不规则形，边缘毛状，菌苔厚或薄，起皱、泽透明或暗等不同特征、染色和镜检。涂片，挑选不同类型单菌落(如菌落不纯应进行纯化)，分别用灭菌接种环在选定的菌落边缘上蘸取少许菌体，置盛有to 成细菌悬浮液;再用无菌微吸管或无菌接种环蘸取悬浮液1一3滴，加在洁净玻片上，并用无菌接种环将菌液滴36菌液干燥后即可染色、观察。菌体染成红色或紫色，芽抱不着色。用以下特殊染色法将菌体和芽抱染成不同颜色(菌体红色，芽抱绿色)，便于观察。试剂:染色剂1为5%孔雀绿水溶液，染色剂5/藏红水溶液或。品全色步骤:于干燥的涂片上加染色剂I，在酒精灯上加热1 意勿使染色液沸腾和干燥)，用水洗去多余的染液，再加染色剂正染15s，然后用水洗去染液，用吸水纸吸干后置显微镜下观察。涂片标本放在显微镜的载物台上，将高倍镜对准后，再加月1苟香柏油浸镜头观察操作时注意:在玻片上加油滴后，用显微镜的自动止降装置将油浸镜头下移到油滴中，到停止下降为止。然后用微调钮上调对准焦点，进行观察。使用完后，用擦镜纸将镜头和镜台上多余油擦去，再用脱纸棉团蘸取少许二甲苯轻擦镜头油污，立即用擦镜纸将二甲苯擦去。通过镜检，凡芽抱染成绿色，菌体染成红色的则可确定为芽抱杆菌。将芽抱杆菌的菌落编号，并转移到斜面培养基上，置28温箱中培养24 h，取出放在冰箱保存，待生物测定。5. 3室内生物测定5. 口径18 托盘夭平、血球计数器、显微镜、振荡器、试管、三角瓶、冰箱、温箱。土1份，草炭匀装入小花盆内备用。2. 3. 6编号保存待测的菌株，转移到斜面上，件下培养24 取菌苔于无菌水试管或三角瓶中，在振荡器上振荡2而n，充分混匀制成芽抱菌量为1护个/血球计数器在显微镜下计数)。芽率不低于95%，种子经催芽露白后，选发芽长势一致的种子，在待测菌悬浮液(08个/干种子表面水分，盆播种10粒，每个菌株播种不少于10盆。一管理，尽量使各处理的生长环境(如采光、温度和湿度等)均匀一致。查幼苗总鲜重、根鲜重和地上部鲜重每个菌株重复生测3出生测效果显著而稳定的菌株进行田间试验。5间试验)两个不同生态区选择同种作物性能的平均表现，增产效果稳定性及区域的适应性。行两年两点的田问试验，明确供试验菌株增产试验地块要平坦，肥力要均匀一致。每一菌株为一处理，以清水为对照，小区随机区组排列或成对区组排列区面积不小于60 m，以0. 013 3 h。为宜，要设保护行和隔离带。，每一处理至少重复3次，3菌剂制备将室内生物测定所得到的菌株经发酵生产制成粉状菌剂，供田间试验用。1拌后以75g/37),翻动数次，使菌剂均匀地附在种子表面晾干种子表面的水分，即可播种(每公顷用种量超过15o 增加相应的菌11r )。52喷雾将菌剂以75150 g/适量的水稀释配制成悬浮液(见37)，)苗按75g/37)，进行浸蘸根(秧)苗，使菌液均匀地沾附在根(秧)苗匕，稍晾于即可栽植扦插。小区的水肥管理要一致;b)喷雾时应避免不同菌株间的相互感染，灌溉时严禁小区间串水;。)尽量减少鸟、兽、虫、病的危害。选的目标不同，其记载内容和要求指标也不同。以提高某种作物产量为目标时，则应对影响产量的性状进行重点观察记载;以提高某种作物抗病性为目标时，应对该作物的某种仁要病害和防治程度进行观察记载;以改进某种作物品质为目标时，则应对其影响品质的指标进行调杏记载对同一种农作物，有同一种筛选目标时，所有观察记载项目都要相同，才有可比性。可参照作物考种方法进行设计。距确定的作物(如玉米、高粱)和穴植作物(如马铃薯、甜菜)，以株或穴为基本抽样单位;对条播和撒播作物(如小麦)，以1 样要严格定点、定株或严格随机取样，避免出现人为误差。8数据整理和结果分析将所得结果按不同区组处理，以表格形式汇总，然后进行方差分析，比较各处理差异的显著性，并找出效果最佳的菌株。)计算一对数据之间差异数平均数d:,照平均数按式(2)计算成对数据差异