橡胶中的蛋白质定量测试(D5712-10)中文整理版.doc

橡胶中的蛋白质定量测试（D5712-10）1 仪器、设备1.1 离心机:性能至少为 6000g.离心管 :容量为50mL和 lOmL，对蛋白质吸附力小的聚丙烯管。1.2 分光光度计和比色皿。1.3 旋涡混合器。1.4 微量移液管、容量瓶1.5 聚丙烯管:容量为50 ml和10 ml，对蛋白质吸附力小的聚丙烯管2 试荆2.1 所用水均为重蒸馏水.所用试剂均为分析纯或相当纯度的试剂。2.2 抽提试剂:0.02 mol/L,pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液。2.3 改进的Lowry蛋白质试验试剂。2.3. 1 试剂A: 碱性酒石酸溶剂 2.22g碳酸钠，0.44g氢氧化钠，0.18g酒石酸钠溶解在100纯水中2.3.2 试剂B:硫酸铜溶液7.0g溶解在100ml纯水中2.3.3 试剂C:碱性铜酒石酸溶液 150ml的试剂A+1ml的试剂B 2.3.4 试剂c-1: 碱性酒石酸溶液 150ml的试剂A+1ml的纯水2.3.5 试剂D 稀释的福林溶液 10ml +10ml水2.3.6 标准蛋白母液溶液0.1g卵蛋白溶解在100ml磷酸缓冲溶液中2.3.6.1 蛋白质标准溶液的制备用缓冲液稀 释 蛋白质母液，制备如下系列的蛋白质标准溶液:0，2，10，35，100，和200ug/mL2.3.7 脱氧胆酸钠(DOC),0.15 % (质量/体积),0.15 g脱氧胆酸钠溶解在100ml水中。2.3.7 三氯乙酸(TCA):72% (质量/体积),72g三氯乙酸溶解在100mL水中。2.3.8 磷钨酸(PTA): (质量/体积) 72%72g磷钨酸溶解在100mL水中3 测定步骤.3.1 蛋白质的抽提3.1.1 在整个抽提过程中，应用pH =7.4的磷酸盐缓冲溶液作为抽提介质，其温度应保持在(25士6;) )3.1.2.准确称取试样(1士0.01)g(精确到0.0001 g),剪成1cmX4 cm大小的片状，置于50ml聚丙烯管中，按试样量:抽提试剂体积在5-10之间比例移取抽提试剂磷酸缓冲溶液于装有试片的聚丙烯管中，使被测试样全部均匀地浸泡在抽提试剂中，并保持在(25士5 ，抽提2h，在刚开始，中间，以及结束的时候搅动试样。3.1.3 将抽提液倒人50ml离心管中。在大于500*g 的条件下离心15min，小心注出上层清液，或者用0.45um的过滤膜过滤，收集滤液，立即进人下步操作。否则必须将上层清液在2-8贮存，贮存时间不超过24h.3.2 蛋白质的沉淀与浓缩3.2.1 分别移4ml，磷酸缓冲溶液（空白)、标准蛋白质溶液(五个)和手套抽提液分别置于10mL聚丙烯离心管中，各加入0.4mL DOC，用旋涡混合器混匀，室温条件下静置10min;然后各加人0.4mL,现制的TCA：PTA=50:50(体积比)的溶液，用旋涡混合器混匀，在室温条件下静置30 min。3.2.2 将上述离心管在6000 X g条件下离心30min。倾去上层清液，把离心管倒置在滤纸上，让水流千。3.3.3移取最小体积(根据固体沉淀的量可为1.OmL-4.0 ml,)的NaOH溶液到各离心管中(包括空白，标准蛋白质溶液)，用旋涡混合器混匀，必要时可用超声水浴，使沉淀溶解。在(3士1)条件下，重溶解蛋白质溶液可贮存24h3.4 比色检验3.4.1 分别移取1.2m再溶解蛋白质溶液(包括空白，标准蛋白试剂)于聚丙烯管中，各加人2.5mL试剂C，立即用旋涡混合器混匀，室温下静置15min3.4.2 再加入0.3mL的试剂D，立即用旋涡混合器混匀，室温下静置30min3.4.3 加人试刘D后1h内，移取1 m以3.4.1溶液到比色皿中，在750 n 波长处对照空白测定其吸收，取三份平行样测定值的平均值。4 结果表示4. 1 计算4.1.1 标准曲线以蛋 白 质 标准溶液的浓度与吸光度的对应关系制备标准曲线。4. 1.2 浓度确定直接 从 标 准曲线的线性部分确定样品的蛋白质浓度。4.2 结果样品 中 蛋 白质含量(ug/g)按下式计算:可抽提的蛋白质含量=VC/（Fm）式中:V-抽提液的体积,mL;C- 从 标准 曲 线上侧得的蛋白质浓度，ug/g;F-浓 缩 因 子，F=4mL/再溶解蛋白质沉淀所用NaOH的体积，mL;m- 被 抽 提 的手套质量，g.所缺试剂及仪器设备1.旋涡混合器。2.聚丙烯管 3. 酒石酸钠（sodium tartrate CAS号：6106-24-7）4.五水合硫酸铜（Copper sulfate pentahydrate，CAS:7758-99-8） 5. 福林酚试剂(2N,酶活测专用Folin-Ciocalteus phenol Reagent) 6.卵蛋白（ovalbumin，CAS号: 9006-59-1）7. 脱氧胆酸钠(DOC，Sodium Deoxycholate，