《蛋白质合成后加工》PPT课件.ppt

第二章 蛋白质翻译后的加工、定位 以及翻译的调节 不论是原核还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质需定 位于细胞特定的区域，有些蛋白质合成后要分泌到细胞外，这 些蛋白质叫做分泌蛋白。 在细菌细胞内起作用的蛋白质一般因靠扩散作用而分布到 它们的目的地。如内膜含有参与能量代谢和营养物质转运的蛋 白质；外膜含有促进离子和营养物质进入细胞的蛋白质；在内 膜与外膜之间的间隙称为周质，其中含有各种水解酶以及营养 物质结合蛋白。 真核生物细胞结构更为复杂，而且有多种不同的细胞器， 它们又具有各不相同的膜结构，因此合成好的蛋白质还要面临 跨越不同的膜而到达细胞器，有些蛋白质在翻译完成后还要经 过多种共价修饰，这个过程叫做翻译后处理。 第一节 蛋白质的分泌和加工修饰 一、蛋白质的分泌 1.细菌中蛋白质的越膜 细胞的内膜蛋白，外膜蛋白和周质蛋白是怎样越过内膜而到 其目的地的呢？绝大多数越膜蛋白的N端都具有大约15-30个以疏 水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。信号肽的疏水段能形 成一段螺旋结构。在信号序列之后的一段氨基酸残基也能形成 一段螺旋，两段螺旋以反平行方式组成一个发夹结构，很容 易进入内膜的脂双层结构，一旦分泌蛋白质的N端锚在膜内，后 续合成的其它肽段部分将顺利通过膜。疏水性信号肽对于新生肽 链跨膜及把它固定的膜上起一个拐棍作用。之后位于内膜外表面 的信号肽酶将信号肽序列切除。当蛋白质全部翻译出来后，羧端 穿过内膜，在周质中折叠成蛋白质的最终构象（见下图）。 2.真核生物蛋白质分泌 真核生物不但有细胞核、细胞质和细胞膜，而且还有许多膜 性结构的细胞器，在细胞须内合成的蛋白质怎样的到达细胞的不 同部位呢？了解比较清楚的是分泌性蛋白质的转运。 像原核细胞一要，真核细胞合成的蛋白质N端也有信号肽也 能形成两个-螺旋的发夹结构，这个结构可插入到内质网的膜 中，将正在合成中的多肽链带进内质网内腔。 80年代中期在胞浆中发现一种由小分子RNA和蛋白质共同组 成的复合物，它能特异地与信号肽识别而命名为信号肽识别颗粒 。它的作用是识别信号肽与核糖体结合并暂时阻断多肽链合成。 内质网外膜上有SRP受体，当SRP与受体结合后，信号肽就可插入 内质网内腔，被内质网内膜上的信号肽酶水解除去SRP与受体结 合后，信号肽就可插入内质网进入内腔，被内质网内腔上的信号 肽酶水解除去，而信号肽后序肽段也进入内质网内腔，并开始继 续合成多肽链，SRP对翻译阶段作用的重要生理意义在于：分泌 蛋白及早进入细胞的膜性细胞，能正确折叠、进行必要的后加工 与修饰并顺利分泌出细胞（见下图）。 现以哺乳动物的胰岛素为例说明这种分泌过程。胰岛素由 51个氨基酸残基组成，但胰岛素mRNA的翻译产和在兔网织红细 胞无细胞翻译体系中为86个氨基酸残基，称为胰岛素原，在麦 胚无细胞翻译系统中为110个氨基酸残基组成的前胰岛素原，后 来证明，在前胰岛素原的N末端有一段富含疏水氨基酸的肽段做 为信号肽，使前胰岛素原能穿越内质网膜进入内质网内腔，在 内腔壁上信号肽被水解。所以在哺乳动物细胞内，当多肽链合 成完成时，前胰岛素原已成为胰岛素原。然后胰岛素原被运到 高尔基复合体，切去C肽成为成熟的胰岛素，最终排出胞外。像 真核细胞的前清蛋白，免疫球白轻链，催乳素等都有相似的分 必方式 。 从核糖体上释放出来的多肽链，按照一级结构中氨基酸 侧链的性质，自行卷曲，形成一定空间结构，过去一直认为 ，蛋白质空间结构的形成是靠其一级结构决定，不需要另外 的信息。近些年来发现许多细胞内蛋白质正确装配都需要一 类称做“分了伴侣”的蛋白质帮助才能完成，这一概念的提出 并未否定“氨基酸顺序决定蛋白空间结构”这一原则。 而是对这一理论的补充，分子伴侣这一类蛋白质能介导 其它蛋白质正确装配成有功能活性的空间结构，而它本身并 不参与最终装配产物的组成。目前认为“分子伴侣”蛋白有 两类，第一类是一些酶，例如蛋白质二硫键异构酶可以识别 和水解非正确配对的二硫键，使它们在正确的半胱氨酸残基 位置上重新形成二硫键，第二类是一些蛋白质分子，它们可 以和部分折叠或没有折叠的蛋白质分子结合，稳定它们的构 象，免遭其它酶的水解或都促进蛋白质折叠成正确的空间结 构。 二、蛋白质合成后的加工修饰 前体蛋白是没有活性的，常常要进行一系列翻译后加工，才 能成为有功能的成熟蛋白。而“分子伴侣”蛋白质合成后折叠成正 确空间结构中起重要作用，对于大多数蛋白质来说多肽链翻译后 还要进行下列不同方式的加工修饰才具有生理功能。 1.氨基端和羧基端的修饰及信号肽去除 在原核生物中几乎所有蛋白都是从N-甲酰蛋氨酸开始，真核 生物从蛋氨酸开始。甲酰基经酶水解而除去，蛋氨酸或者氨基端 的一些氨基酸残基常由氨肽酶催化而水解除去。因此，成熟的蛋 白质分子的N-端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。同时，某些蛋白质 分子氨基端要进行乙酰化，在羧基端也要进行修饰。 某些蛋白氨基端有一段1530个氨基酸残基的顺序，这段顺 序称信号肽，与蛋白质传送到特定的细胞器、膜，或分泌出细胞 外有关。信号肽在运送过程中通常由专一的酶催化而水解除去。 2.氨基酸残基的修饰 (1)甲基化修饰 某些蛋白质中的赖氨酸残基需要甲基化，某些谷氨酸残基 的羧基也要甲基化，以除去负电荷。 (2)羧化修饰 某些蛋白质，如凝血酶等凝血因子，含有多个r羧基Glu ，这一羧基是由需Vit K的酶催化下进行的。 (3)加辅基 蛋白质与辅基的结合也是在翻译之后进行的，如乙酰CoA 羟化酶的辅基，生物素和细胞色素C的血红素。 3.共价修饰 许多的蛋白质可以进行不同的类型化学基团的共价修饰， 修饰后可以表现为激活状态，也可以表现为失活状态。 （1）磷酸化 磷酸化多发生在多肽链丝氨酸、苏氨酸的羟基上，偶尔也 发生在酪氨酸残基上（磷酸化分子式如下图），这种磷酸化的 过程受细胞内一种蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白质可以增加 或降低它们的活性，例如：促进糖原分解的磷酸化酶，无活性 的磷酸化酶b经磷酸化以后，变居有活性的磷酸化酶a。而有活 性的糖原合成酶I经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶D，共 同调节糖元的合成与分介。 （2）糖基化 糖蛋白的糖链是蛋白质合成之后，在通过高尔基体时，经 过糖化而形成的。质膜蛋白质和许多分泌性蛋白质都具有糖链 ，这些寡糖链结合在丝氨酸或苏氨酸的羟基上，例如红细胞膜 上的ABO血型决定簇。也可以与天门冬酰胺连接。这些寡糖链是 在内质网或高尔基氏体中加入的（见下图）。 （3）羟基化 胶原蛋白前链上的脯氨酸和赖氨酸残基在内质网中受羟 化酶、分子氧和维生素C作用产生羟脯氨酸和羟赖氨酸，如果 此过程受障碍胶原纤维不能进行交联，极大地降低了它的张力 强度。 （4）二硫键的形成 真核细胞合成的某些蛋白质，往往能自发地折叠形成其天 然构像，分子内的半胱氨酸的巯基之间形成共价键二硫键。 二硫键在稳定蛋白质空间构型中起着重要作用。例如胰岛 素分子的成熟是借核糖体上释放的前胰岛素原经自发折叠、形 成二硫键，然后再切除C肽而形成的。 4.亚基的聚合 有许多蛋白质是由二个以上亚基构成的，这就需这些 多肽链通过非共价键聚合成多聚体才能表现生物活性。例 如成人血红蛋白由两条链，两条链及四分子血红素所 组成，大致过程如下：链在多聚核糖体合成后自行释下 ，并与尚未从多聚核糖体上释下的链相连，然后一并从 多聚核糖体上脱下来，变成二聚体。此二聚体再与线 粒体内生成的两个血红素结合，最后形成一个由四条肽链 和四个血红素构成的有功能的血红蛋白分子。 5.水解断链 一般真核细胞中一个基因对应一个mRNA，一个mRNA 对应一条多肽链，但也有少数的情况，即一种三思而行 翻译后的多肽链经水解后产生几种不同的蛋白质或多肽 。例如哺乳动物的鸦片样促黑皮激素原初翻译产物为 265个氨基酸，它在脑下垂体前叶细胞中，POMC初切割 成为N-端片断和C端片段的-促脂解激素。然后N端片 段又被切割成较小的N端片断和工9肽的促肾上腺皮质激 素。而在脑下垂体中叶细胞中，-促脂解激素再次被 切割产生-内啡肽；ACTH也被切割产生13肽的促黑激 素（-melanotropin）。 6.蛋白质自我剪接 1990年，Hirata等首次报道一种新的蛋白质加工方式蛋 白质自我剪接。他们发现，酿酒酵母基因TFP1表达成两种蛋白 ，较大的（69103）是液泡HATPase的催化亚基，它来自 TFP1基因5编码区和3编码区，较小的（50103）是由该基 因中央区编码。 他们证明，这两种蛋白是同一条多肽链经过自我剪接产生 的，较小的蛋白是被切割下来的部分，较大的蛋白由切除较小 蛋白后再连接而成（见图2-1）。 图2-1 蛋白质自我剪接 切除 连接 1994年，Perler等将蛋白质自我剪接中被切除的肽段命名 为蛋白内含肽（intein），也称蛋白内含子或内蛋白子，将位 于蛋白内含肽两侧、切除部位再连接形成的产生蛋白称为蛋白 外显肽（estein），又称蛋白外显子或外蛋白子。 蛋白内含肽的基因不是单独的开放阅读框，它插入在蛋白 外显肽的基因中，和内含子的区别在于它可以和蛋白外显肽的 基因一起表达，而不是在mRNA阶段被切除。 蛋白质自我剪接在原核生物和单细胞真核生物中均已发 现。迄今已在20多种生物的近30种蛋白质分子中发现蛋白内 含肽，这些蛋白质大约一半参与核酸代谢。 蛋白内含肽常具有一定的生物活性，如核酸内切酶的活 性。此外，许多蛋白内含肽插入至蛋白质高度保守区（如活 性中心附近），其作用是一方面迫使蛋白质前体必须经过剪 接才能成熟，另一方面也有利于蛋白内含肽自我保护。 第二节 新合成蛋白的定位及折叠 细胞内合成的蛋白质，有些被简单地传送到细胞质，有 些被转运到各种细胞器，有些被分泌到细胞外，有些是要插入 到细胞膜或其它生物膜。 那么，在核糖体上新合成的蛋白质是如何识别并达到它特 定的部位呢？ 一、新合成蛋白的定位 1.分泌蛋白质 核糖体上合成的分泌蛋白位于真核细胞的粗面内质网膜上 或在原核细胞的细胞内膜上。 真核细胞合成的分泌蛋白最终将被转移至分泌小泡中。这 些分泌过程的化学基础是分泌蛋白的前体大都有“信号肽”。 信号肽位于成熟蛋白的氨基端，约1530个氨基酸残基， 多数具有疏水侧链。 内质网表面的核糖体受体能识别80S核糖体，使80S核糖 体结合于内质网上。内质网表面的信号肽受体识别信号肽， 因而正在生长着的肽链就凭借信号肽的疏水性穿透膜，进入 内质网。 这样，肽链就在内质网内不断地延长，并且信号肽将被 肽酶水解除去。然后，多肽链被传递至高尔基体，生成分泌 泡，再分泌出细胞外。 还有一种分泌蛋白，合成后先到溶酶体，然后再分泌出 去发挥作用，这类蛋白也需要信号肽。 2.膜蛋白 膜蛋白也是由附着在粗面内质网上的核糖体合成的。膜 蛋白的信号肽起着引导作用，其羧基端的疏水顺序使它能附 着于膜质结构的双脂层。 3.细胞器蛋白 在胞浆中合成的线粒体蛋白，要运输到线粒体的各个部 位，如外膜、膜间隙、内膜及基质。 这类蛋白质需要氨基端的延伸肽（extension peptide ），延伸肽是疏水性的，线粒体上存在着识别它的受体，可 帮助线粒体蛋白的正确定位。 二、蛋白质的折叠 1.新生肽段折叠研究中的新观点 长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装的主导学说，因 此，在研究新生肽段折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠 研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽 段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分 子帮助，不需要额外能量的补充，就应该能自发的折叠而形成 它的功能状态。 1988年，邹承鲁指出新生肽段折叠在合成早期已开始，而 不是合成完后才开始，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行 构象调整，先形成的结构会作用于后合成肽段的折叠，而后合 成的结构又会影响前面已形成的结构调整。因此，在肽段延伸 过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样 ，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九 十年代一类具有新生物功能的蛋白，分子伴侣的发现，以及更 广泛意义上说帮助蛋白质折叠的辅助蛋白的提出，说明细胞内 新生肽段折叠一般说需要帮助，而不是自发进行。 2.分子伴侣在蛋白折叠中的作用 蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠 大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成 一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该 有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本 不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成 分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确、 充分、必要的。 实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过 程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径 的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的 功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之 结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用， 阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这 样必然促进折叠向正确方向进行。 分子伴侣的两个主要的特点： Hsp70 系统包括Hsp70、Hsp40 和GrpE。它们能作用于新 合成的蛋白质、跨膜运输的蛋白质和在胁迫下变性的蛋白质。 这个系统的名字反应了Hsp70蛋白质最初是通过热激 (Heatshock)作用的诱导发现的。Hsp70 和Hsp40 蛋白质都 能独立地与其结合底物。 分子伴侣系统由一个很大的寡聚复合体组成。这种寡聚复合 体形成的结构可使未折叠的蛋白质插入(温度升高会使热激蛋 白质的产生增加，这些蛋白质的作用是减小蛋白质在热变性中 被破坏的程度；很多热激蛋白质都是分子伴侣)。 3.分子伴侣的作用机制 实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。 有的分子伴侣 具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有 细菌Pseudomonas cepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴 侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱 基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般分子伴 侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现 在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。 由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成 疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过 程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水 表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫 氰酸酶（Rhodanese）分子-helix的疏水侧面。但是只有- sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。 最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内 的分子伴侣，用一种affinity panning的方法检查Bip与有 随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy- X-Hy-X-Hy motif与Bip j结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、 Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够 进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球 体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽 结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结 构表明，多肽结合在它的 -sheet区。GroEL中，约40kD的 153-531结构域是核苷酸的结合区。 分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的 一种模型认为分子伴侣常常以多聚体形式而形成中心空洞的结构 ，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体 GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中 空的非对称笼状结构，推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间 空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现 GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段， 已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。 由此，也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位 ，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或 若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部 位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈 层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链 的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或 所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构， 经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制 不正确的折叠 以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个 新名词“DNA chaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣 是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分 子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定 程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA 的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA 的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须 克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴 侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定 在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的 ，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA 分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有 关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心 法则当前主要问题有密切关系。 4.分子伴侣和酶的区别 与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有 两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(PDI); 另一个是肽基脯氨酸 顺反异构酶(PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二 硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳 定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量 丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时 ，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构 酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的亚基;又是微粒 体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点 结合蛋白等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力 ，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低 ，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分 子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白 ，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋 白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。 蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处 于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相 互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个 慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成 却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异 性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度 存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这 些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键 异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合 ，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折 叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催 化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋 白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥 ，而是密切相关，协调统一的。 分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该、 也不能够划一条绝对的分界线。酶最主要特性就是催化生化 反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合， 从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的 折叠方向反应，这可理解成间接的催化肽链的折叠。从表观 上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。 最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明 显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重 聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系 统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。 三、组蛋白密码 遗传特异性由基因组碱基序列决定，序列变化导致细胞行为 改变。但是科学发展到今天，这已不是问题的全部。有人提出“ 表观遗传学“概念，表观遗传学的一个典型例子就是抑瘤基因异 常甲基化与肿瘤相关。随着转录调控研究的深入，一种新的调节 机制 -“组蛋白密码“日益被科研工作者重视，组蛋白密码信息 存在于转录后组蛋白修饰等过程中。 在真核细胞的细胞核中，核小体是染色质的主要结构元件。 核小体主要由四种组蛋白（H2A,H2B,H3和H4）构成。这四种组蛋 白和缠绕于组蛋白的DNA共同组成了核小体。每个组蛋白都有进 化上保守的N端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通 路的靶位点，从而导致转录后修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化 、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化 、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点， 改变染色质结构和活性。 一般来说，组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色质区域 的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达 水平。而组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达。乙酰化 修饰和甲基化修饰往往是相互排斥的。在细胞有丝分裂和凋 亡过程中， 细胞对外在刺激作出的每一个反应几乎都会涉及到染色 质活性的改变，这一改变就是通过修饰组蛋白，变换组蛋白 密码实现的。既然几乎每一种生物学过程都有特定的组蛋白 修饰标记，那么特定的组蛋白修饰标记就能反应相应的特定 生物学过程。因此通过组蛋白修饰系列抗体特异性地识别靶 蛋白修饰形式，就能简化对组蛋白修饰的研究。 染色质的转录活性与组蛋白修饰相伴（见下表）。总体 上来说，组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有关，而组 蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录增强或转 录抑制。 组蛋白修饰与转录状态表 转录激活 转录抑制 乙酰化 增加 降低 赖氨酸甲基化 组蛋白H3 K4 组蛋白H3 K9，K27,K79 精氨酸甲基化 组蛋白H3 R2,R17,R26 降低 组蛋白H3 R4 有丝分裂过程也与特异性组蛋白修饰有显著的相关性。在 有丝分裂过程中，有数个组蛋白磷酸化反应，其中大多数由 Aurora B激酶催化。特异性组蛋白修饰可在有丝分裂的不同阶 段检测到，在细胞核分裂中发挥多种功能（见表2）。 组蛋白修饰于有丝分裂表 分裂间期 G2/M 分裂早期 分裂晚期 H3 S10 Phos +/- + + + H3 S28 + + + + CENP-A Ser 7 Phos - - + + H4 K20 Me + + + + 组蛋白修饰还参与DNA损伤和凋亡。在凋亡的级联反应中， 激酶（包括CHK1和CHK2）的主要底物之一是组蛋白衍生物H2A.X ，H2A.X的磷酸化是凋亡早期最早标志之一。在凋亡后期， Caspase激活蛋白激酶Mst1, Mst1使组蛋白H2B的14位丝氨酸磷 酸化。这一修饰在染色质浓缩步骤中可检测到，是凋亡途径良 好的标记物。也有报道称在凋亡过程中发现组蛋白H2B的32位丝 氨酸磷酸化。 随着组蛋白密码学说的进一步完善，研究者将能: 1.更好地 开发新药。研究组蛋白密码对药物开发具有战略意义，多种组 蛋白修饰酶已成为相关疾病治疗的靶目标。比如，组蛋白去乙 酰酶（HDACs）抑制剂已应用于临床治疗多种肿瘤；2.深入探讨 遗传调控和表观遗传调控相互作用的网络与不同生物学表型之 间的关系；3.在控制真核基因选择性表达的网络体系内进一步 深入理解染色质结构、调控序列以及调控蛋白之间交互作用的 内在机制；4.建立基因表达的调控网络数据库及其分析系统。 总之，随着越来越多组蛋白核心结构区域和修饰方式的确定， 组蛋白密码在基因调控过程中的作用会越来越明确。 第三节 其它蛋白质合成系统 1. 原细菌 以上讨论了真核生物及一般原核生物（真细菌）的蛋 白质生物合成过程，事实上还有少数生物的蛋白质合成过程 与上述的不完全相同。原核生物有两类：真细菌（eub- bacteria）及原细菌（archaebacteria）。 原细菌的蛋白合成过程与真细菌及真核细胞的蛋白合成 过程均存在一些相同之处，但也有其独特的方面。主要区别 在于参与的大分子、合成过程都不同。 2.线粒体 线粒体的大多数蛋白质是由核染色体转录的mRNA在细胞浆 中翻译的，并且被转运至特定部位。然而，线粒体本身也有其 独立的基因组，它编码线粒体的rRNA和tRNA及电子传递氧化 磷酸化的某些蛋白质。 线粒体有它们自己特有的蛋白合成装置,而且以细菌合成 蛋白质的相似方式生产蛋白质。在线粒体中存在特异的fMet- tRNA用于蛋白质合成起始。起始因子(IFs)也和细菌中的十分 相似。在很多的情况下线粒体蛋白质合成体系的成分和细菌的 相关成分在体外可以互换。例如链孢霉的核糖体能识别、结合 和翻译E.coli的AUG，而且E.coli的 IFs来催化蛋白合成的起 始。 线粒体蛋白合成系统最引人注目的是其密码的独特性。 例如，AUA是Met的而不是Ile的密码子；UGA不是终止密码， 而成为Trp密码子；AGA和AGG不是Arg的密码，而变成终止密 码。起始密码除AUG外，尚可兼用AUA以及AUU。 3.叶绿体 叶绿体的蛋白质合成系统与细菌相近。叶绿体基因组除 编码其蛋白合成系统的蛋白外，还编码光合作用及能量转移 作用的蛋白质。 1962年从叶绿体中成功分离出核糖体，当时发现植物细 胞中有两类核糖体：70S与80S。70S核糖体位于叶绿体中； 80S核糖体位于细胞质中。在碱基成份方面，叶绿体核糖体 RNA与细胞质核糖体RNA也不同。对于抗生素的作用，两种核 糖体也表现出特异的反应。例如，氯霉素可抑止70S核糖体中 蛋白质的合成却无碍于80S核糖体。相反，环己胺抑止80S核 糖体蛋白质的合成却无妨于70S核糖体。 叶绿体核糖体RNA是由叶绿体DNA编码的；同一细胞的细胞 质核糖体RNA，则是由核DNA编码的。除rRNA以外，叶绿体也具 有自己的mRNA及tRNA，且各自具有转录、翻译功能。叶绿体 mRNA的功能可以通过离体叶绿体合成蛋白质来鉴定，已经证明 ，豌豆的离体叶绿体能将S35标记的放射性甲硫氨酸掺入到五个 不同的与膜结合的蛋白质中；菠菜离体叶绿体至少有九种与膜 结合的蛋白质被体外标记。 有充分的证据表明：叶绿体DNA是在叶绿体中翻译，而核 DNA则是在细胞质中翻译。叶绿体中含有tRNA，同细胞质中所含 的不同。除相应于普通氨基酸的tRNA分子外，已经在叶绿体中 发现有不同的、可以接受同一氨基酸的tRNA(称为同功tRNA)以 及叶绿体特异的氨酰-tRNA合成酶。 叶绿体编码的蛋白质，文献中报道的涉及若干种。但是，比 较肯定的只有两种：组分蛋白质大亚基及光系统叶绿素蛋 白质。 组分蛋白质又称双磷酸核酮糖羧化酶(简写作RuBPC酶)最 近几年利用烟草属的不同种进行了许多研究，采用等电聚焦电 泳可以把这种酶的大、小亚基分离：大亚基被分为分子量相同 等电点不同的三种多肽，小亚基被分为两种多肽。由于大亚基 多肽是叶绿体DNA编码的，小亚基是由核DNA编码的，种间杂交 的杂种F1永远具有母本种的大亚基并兼有父母本的小亚基。根 据这一原理，就可将任何叶绿体DNA控制的性状，通过杂交再用 F1同亲本之一回交的方法，重新创造出大亚基相同小亚基不同 或小亚基相同而大亚基不同的组分蛋白质，并通过等电聚焦 技术对所得结果进行鉴定比较。 光系统叶绿素蛋白质，又称P700-叶绿素a蛋白质。它是 研究质体基因突变的一个最常用的指标，是一种重要的色素-蛋 白质复合体。任何色素的突变，均常常在这里反应出来。 第四节 蛋白质合成的抑制剂 1.抗生素对蛋白质合成的抑制 嘌呤霉素能有效能抑制各种细胞的生长，因为它的结构很 象氨基酰-tRNA，故能进入核糖体的A位点，竞争性地抑制正常 氨基酰-tRNA进入A位点。 如果转肽酶将肽链转移到嘌呤霉素上，由于嘌呤霉素与A位 点结合力很弱，嘌呤霉素结尾的肽链从核糖体上脱落下来，肽 链就不能完全合成（见图2-2）。 图2-2 嘌呤霉素的结构与氨酰基tRNA结构相似 稀疏霉素和林可霉素可特异地结合到50S亚基，抑 制转肽酶。 呼霉素抑制EF-G的转位作用，链霉素则能结合30S 亚基，强烈地抑制肽链合成的起始（见表2-1）。 作用阶阶段抑制剂剂作用对对象抗性突变变的特点 起始春雷霉素 链链霉素 细细菌 细细菌 突变变体16SrRNA上缺少甲基 30S 蛋白中的 延长长黄色霉素 嘌呤霉素 细细菌 细细菌 EF-Tu/GDP不能被释释放 从肽酰肽酰 tRNA结结束肽链肽链 ，早熟终终 止 肽肽的转转移红红霉素 氯氯霉素 放线线菌酮酮 细细菌 线线粒体 细细菌 线线粒体 真核胞质质 突变变存在于23S rRNA的修饰饰 突变变存在于23S rRNA的顺顺序 突变变存在于 50S 蛋白 突变变存在于23S rRNA的顺顺序 抑制60S 上肽肽的转转移 移位梭链孢链孢 酸 硫链丝链丝 菌肽肽 EF-G/GDP不能被释释放 抑制GTPase活性 表2-1 抗生素对蛋白质合成的抑制作用 2.干扰素对病毒蛋白合成的干扰 干扰素能增强哺乳动物细胞抵抗许多病毒侵扰。 在细胞感染病毒后，感染病毒的细胞合成和分泌一类称之 为干扰素的小分子蛋白质，双链RNA（dsRNA）能促进干扰素的 生成。 干扰素结合到未感染病毒的细胞膜上，诱导这些细胞变成 抗病毒状态，从而获得了抗各种病毒感染的能力。 干扰素的作用很强，10-11mol/L就有显著的抗病毒作用。 干扰素抗病毒作用的机制是促进寡核苷酸合成酶、核酸内 切酶和蛋白激酶的合成。未被感染时，细胞不合成这三种酶 ；一旦细胞被病毒感染，在干扰素或dsRNA存在的条件下，这 些酶就被合成和激活，并以两种不同方式阻断病毒蛋白质的 合成。 干扰素和dsRNA激活蛋白激酶，蛋白激酶使蛋白质合成的 起始因子磷酸化，使之失活；另一种抗病毒的方式是促进 mRNA的降解：干扰素和dsRNA激活2,5A寡核苷酸合成酶的合成 ，后者激活核酸酶，核酸酶水解mRNA（见图2-3） 。 图2-3 干扰素的dsRNA促进mRNA的降解和抑制蛋白质合成的起始 第五节 蛋白质合成的调节 在高度进化的哺乳动物中，每一种类型的细胞中都合成 一些特异的蛋白质，各种蛋白质合成的速率受多种因素的调 节，在不同环境条件下其蛋白质合成速率是不一样的。 原核生物蛋白质合成的调节，主要是转录的调节。真核 生物的转录位于细胞核，而翻译在胞浆，其转录生成的各种 RNA前体，特别是mRNA的前体要经过十分复杂的加工修饰才能 成熟，故转录及转录后的修饰加工是真核基因表达的重要环 节。 一、原核生物翻译水平的调节 1.重叠核苷酸 在原核生物中常出现操纵子中相邻的基因有少量的DNA序 列发生重叠，这种重叠有时可以起到调控的作用。 如在色氨酸操纵子的5个基因中，E和D之间，B和A之间，存 在着翻译偶联效应，即trpE的终止密码子和trpD的起始密码子 相互重叠，trpB的终止密码子和trpA的起始密码子相互重叠。 当trpE或trpB翻译终止时，核糖体尚未解离就已处在 trpD或trpA的起始密码子上，使翻译偶联起来。 两个基因表达的彼此协调，使得蛋白的产量保持一致。 trpE-Thr-Phe-终止密码 trpB-Glu-Ile-终止密码 ACU UUC UGAUG GCU GAA AUC UGAUG GAA MetAla trpD MetGlutrpA 2.阻遏蛋白 某些操纵子编码的蛋白质与蛋白质生物合成有关，其特 征是利用阻遏蛋白在翻译水平上进行调节。阻遏蛋白结合 于mRNA的特定位点，阻止核糖体识别翻译起始区。 如RNA噬菌体R17的外壳蛋白兼任阻遏蛋白，能特异地结 合于噬菌体mRNA的发夹结构，其中包括核糖体结合位点。 3.mRNA的二级结构 mRNA的二级结构可以调节翻译能力。例如，某些RNA 噬菌体的顺反子总是按顺序翻译，因为只有第一个顺反子 的翻译起始位点可以利用，第二个顺反子的翻译起始区由 于和另一区域形成碱基配对而被封闭。 然而，第一个顺反子的翻译破坏了mRNA原来的二级结 构，使核糖体能够结合于第二个顺反子翻译的起始位点。 4.自我调节 在同一个操纵子内，一个基因表达产物（蛋白）的积累， 能够抑制另一个基因（或其本身）的进一步表达。这种翻译水 平上负的自我调节，经常出现于多顺反子mRNA的翻译过程。 str、spc、S10、rif和L11操纵子都能编码核糖体蛋白 ，它们的调节蛋白也都是核糖体蛋白，后者能结合于编码自己 的mRNA，其结合位点或与翻译起始区重叠，或者通过诱导构象 改变而影响核糖体接近翻译起始位点。 这种调节方式可以达到两个目的：（1）核糖体蛋白的表达 水平和细胞生长条件相适应；（2）这些操纵子编码的其它蛋白 质均以自己的速率合成，不受核糖体蛋白翻译的任何影响。 5.核糖体蛋白合成的自动调节 各种核糖体蛋白的合成彼此协调，它们和rRNA之间也相 互协调，这种调节发生在翻译水平，涉及蛋白质和mRNA间的 相互作用，也可能与mRNA的二级结构有关。 例如，若不供给细菌（如大肠杆菌）生长必需的氨基酸 ，则该细菌的蛋白质合成减少，RNA的合成也减少，这种现象 称为“紧急反应（stringent response）”。 在紧急反应时，RNA合成的减少是有选择性的，只有rRNA 和tRNA合成被抑制，而mRNA的合成一部分受抑制，另一部分 则反而增加。 该现象表明在“紧急反应”时，为节省宝贵的氨基酸原 料，细胞减少合成核糖体。 同样，为保证合成必需的蛋白质，也减少了其它蛋白质 的合成。 Cashel和Gallant观察到，不供给氨基酸时，细菌会产 生三种异常的核苷酸，即ppGpp、pppGpp及ppGp，这些核苷 酸（尤其是ppGpp）的出现正好与RNA合成的抑制相关，因 此认为这些核苷酸在紧急反应中起着关键的作用。 氨酰基tRNA合成酶的缺乏可以引起紧急反应，因为 去酰化的tRNA是紧急反应的诱导物。 编码核糖体蛋白的52个基因，分别处于25个转录单位（或 称操纵子）。一些转录单位中含有好几种核糖体蛋白基因，而 另一些仅含一种核糖体蛋白基因。 最初的体内实验证明了这些转录单位的翻译受到反馈调节 ，用专门的转导噬菌体将一些转录单位引进大肠杆菌，使一些 核糖体蛋白基因有多个拷贝，结果发现虽有相应的mRNA增加， 但无相应的蛋白增加。 后来有人用重组DNA技术表达多个的核糖体蛋白基因，证明 了在每个转录单位中只有一种蛋白能阻遏其它蛋白的合成。 必须指出的是，包含EF-Tu和RNA聚合酶及的转录单位 不受此反馈调节。 这类反馈调节的机制是蛋白质和mRNA相互作用。负责 反馈调节的蛋白质能和rRNA结合，以组装成核糖体大分子 。 这些蛋白也能识别那些多顺反子mRNA中的位点，这些 位点和rRNA相似。蛋白质和mRNA结合后导致翻译的阻断。 当然，蛋白质和mRNA的亲和力要比蛋白质和rRNA的亲 和力弱，这样就不会影响核糖体的组装。 6.密码子的利用与翻译调节 密码子有兼并性，但氨基酸的多种密码（即同义密码） 使用的频率并不一样。 大肠杆菌的一些高度表达基因中很少出现的密码子，在 另一些弱表达的基因中出现的频率却很高，提示了密码的使 用与翻译的调控有一定的关系。 解释密码子调控蛋白质翻译的作用有两种模式。 一是同义密码子被翻译的速度与相应的同工tRNA的富有 程度相关； 二是针对那些可被同一tRNA识别的同义密码子，这类同 义密码的前两个碱基相同，只是第三个碱基不一样。由于 tRNA中反密码子的碱基摇摆性，所以它们仍然能被相同的 tRNA识别。 在高度表达的基因中，很少出现密码子反密码子相互 作用的高能密码子（如CGC）和能量最低的密码子（如AUU） ，而更多是呈中间能量的密码子（如CGU,AUC）。 二.真核生物翻译水平的调节 1.mRNA运输控制 运输控制是对转录过程中从细胞核运送到细胞质中的数量 进行调节。mRNA都要通过核孔进行转运，因此真核生物的核膜 是基因表达的一个控制点。 关于mRNA运输控制的机制，有人提出了剪接体滞留模型： 剪接体的装配与mRNA的输出相竞争，当前体mRNA在剪接体加工 的过程中，RNA滞留在核中，不能与核孔相互作用。 当加工完成后，内含子被切除了，mRNA从剪接体上解离下 来，通过核孔进入细胞质。 2.mRNA的降解 mRNA的降解是翻译水平的一个重要控制点。通常核糖体内 rRNA和tRNA是很稳定的，mRNA的稳定性则差别很大，有的mRNA 的寿命可延续好几个月，有的只有几分钟。 mRNA降解的速率与其结构特点有关，特别是mRNA的选择性 降解在很大程度上是由于核酸酶和mRNA内部结构相互作用的结 果。 例如很多短寿命的mRNA 3端非翻译区中的一组富含AU的序 列（UUAAUUUAU）是和它们的不稳定性有关系的，可能和去除 poly(A)有关，也可能与80S复合物形成过程中某种因子的结合 有关。 3.mRNA的结构 mRNA 5端帽子结构是否存在和是否易于接近eIF-4F对翻 译有着明显的影响。 起始密码子AUG的位置和其侧翼的序列对翻译的效率也有 影响，这些因素主要是通过与调控蛋白、核糖体、RNA等的亲 和性改变影响到起始复合物的形成，并影响到翻译的效率。 翻译的效率还与5端非翻译区的长度有关，当此区的长度 在1780nt时，翻译的效率与长度成正比。此区的高级结构和 高G-C含量对翻译的起始有妨碍。 3端poly(A)的有无及长度对mRNA的稳定性和翻译效率也 有影响。有poly(A)的mRNA翻译效率明显高于无poly(A)的mRNA ，poly(A)越长，模板mRNA的半衰期越长。 4.起始因子的磷酸化和脱磷酸化 处于磷酸化状态的eIF没有活性，使翻译效率低下。多种原 核和真核细胞在热休克时选择性翻译休克蛋白，某些正常蛋白 的合成却受到抑制。 这可能是由于热刺激使eIF4b脱磷酸化造成的结果，但进一 步的作用机制尚不清楚。 干扰素能抑制RNA病毒颗粒的复制，其机制为干扰素能诱导 细胞产生依赖于双链RNA的蛋白激酶，而此蛋白激酶使部分eIF2 的亚基磷酸化而失去活性，从而抑制病毒蛋白质的合成，阻 断病毒颗粒的复制。 5.起始因子的降解 脊髓灰质炎病毒能使宿主细胞的起始因子eIF4f（又 称帽结合蛋白）中的一个亚基降解，从而抑制宿主细胞蛋 白质的生物合成。该病毒蛋白质的合成不需要eIF4f，因而 免受影响。这是脊髓灰质炎病毒杀灭宿主细胞，但又保持 自身繁殖的主要机制。 6.mRNA结合蛋白对翻译的作用 海胆、爪蟾等真核生物卵子内的mRNA多数都与蛋白 质结合，以mRNA蛋白体的形式存在，此时mRNA没有翻 译活性。 受精后，mRNA与其结合蛋白分离，mRNA即表现模板 活性，这是卵子是受精后蛋白质合成急剧增加的生化基 础，同时也表明了mRNA结合蛋白对翻译水平的控制起着 重要作用。 .mRNA 表达水平是否准确反映蛋白质丰度 在过去十多年中, 多数研究人员都以基因mRNA表达的丰度 代表其编码蛋白质的水平及其基因表型。但事实上并非如此。 研究表明, 在稳恒状态下mRNA的丰度与相应的蛋白质水平相差 极大, 这往往导致我们错误地了解mRNA 表达水平所得到的结 果。人们在研究酵母中发现, 某种基因mRNA 的丰度和相应翻 译的蛋白质水平可相差30 倍之多, 而且在低丰度蛋白质中更 加明显。直接比较哺乳动物1 种组织的数种基因或1 个基因在 不同组织中编码蛋白质和mRNA 水平发现, 在任意情况下, 相 关系数都小于0. 5, 而且在肿瘤细胞中更低。上述证据表明从 mRNA 推测其相应蛋白质丰度是不可靠的。同样, 以mRNA 水平 来解释细胞的基因表型也是不可行的。 mRNA 和蛋白质无论在单个基因还是在整个细胞系中相关 系数一般小于0. 5, 它们之间的差别最高可达30倍。 mRNA量只有在转录物全都被翻译时,才成为表达分布图中有 意义的蛋白。这些参与翻译的mRNA可以通过蔗糖密度梯度离心 分离胞浆提取物得到。并且,由于翻译过程的限速步骤是翻译起 始阶段, 所以,与核糖体相连接的mRNA分子数目可以准确地表示 出相应蛋白质的合成率。 众所周知,mRNA须与胞浆中核糖体组成复合物后才能进行翻 译, 而用蔗糖密度梯度离心技术可将游离的未翻译mRNA与前者 分离。将与核糖体结合成复合物的mRNA制备成探针,用于基因芯 片进行杂交。用这种方法分析发现,小鼠和人的成纤维细胞在血 清诱导的分裂过程中约有10% 基因是在翻译水平调控的。同时 还发现含有核糖体结合位点的mRNA占全部转录产物的3% , 这一 技术的关键是确定其可靠性和重复性。由同一种细胞分别分离 出总mRNA、游离mRNA和与核糖体结合的mRNA,反转录成cDNA后分 别与基因芯片杂交。结果发现, 后两者相加的阳性信号与总 mRNA的阳性信号完全呈正相关。从而表明: 利用核糖体结合 的mRNA可以产生可重复的定量结果; 总mRNA不能代表可翻译 的mRNA种类和水平; 通过比较总mRNA和核糖体结合mRNA的阳 性信号,可区分基因在转录水平和翻译水平调节。 应用此种方法分析发现, 虽然多数基因是在转录水平调节 的, 但也有10% 20% 的基因是通过翻译过程改变的。因此, 若仅仅应用常规的基因表达研究方法, 将不能观察到这部分基 因表达的变化。应用蛋白质印记杂交的方法观察相应蛋白质水 平的变化进一步证实上述10% 20% 基因确实是在翻译水平调 节的。显而易见, 在分布图的分析中, 结合核糖体mRNA 将比总 mRNA 更紧密的与蛋白质合成相关。 综上所述,分析核糖体结合的mRNA在基因芯片上的阳性信号 ,比使用总mRNA更能充分地反映基因转录。mRNA成熟、出核、稳 定性和翻译等一系列过程都影响了最终蛋白质合成速率。利用 蔗糖密度梯度离心分离出核糖体结合mRNA 可以应用于在mRNA 分布图中作定量分析。这种理论结合了基因组技术的高产量、 可行性、可重复性、敏感性、对新细胞系统的适应性和蛋白质 组分析技术。与此同时, 也应当看到分析核糖体结合的mRNA 尚 不能用于研究蛋白质的水解、翻译后修饰, 但至少部分的弥补 了基因组学和蛋白质组学的空间。而数量众多的基因表达通过 翻译过程也将极大地促进对其机理进一步阐明。 .反义RNA 1984年，Adelman等发现大鼠的促性腺激素释放激素（ GnRH）基因的两条链都能转录，首次在真核生物中发现了反 义RNA。1986年Green等发现来自骨髓细胞瘤病毒的癌基因myc 三个外显子中的第1，2两个外显之间有部分互补。在有的细 胞中，当失去