胶回收QC操作标准.docx

琼脂糖凝胶dna回收试剂盒（离心柱型）qc标准操作流程1. 实验试剂和耗材1.2 实验试剂1.3 耗材2. 实验操作流程胶回收试剂盒的检测须进行两个实验验证，第一个实验为gelred染色法，第二个实验为eb染色法。2.1 gelred染色法2.1.1 1.5%琼脂糖凝胶的制备 （1）准确称取1.5g琼脂糖置于250ml三角锥形瓶中，添加125ml 1tae溶液。（2）轻微混匀后将其置于微波炉中，高火加热6min至溶液沸腾，取出锥形瓶放置室温2min。（3）添加1tae溶液至110ml，再次于微波炉中高火加热3min至溶液沸腾。（4）室温放置10min后将溶液倒入插有梳子的胶槽内，待胶块凝固后使用。2.1.2 胶回收实验（1）取6个2ml离心管，依次编号为1-6号，使用分析天平准确称取空离心管的重量。（2）用干净锋利的手术刀片切下不含核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶胶块，放入已称重的2ml离心管中，称取胶块与离心管总重，计算凝胶块的重量。要求胶块重量不超过200mg为宜。（3）添加溶胶液binding solution b，要求1、2号管中每100mg琼脂糖凝胶加入200ul binding solution b，3、4号管中每100mg琼脂糖凝胶加入300ul binding solution b，5、6号管中每100mg琼脂糖凝胶加入400ul binding solution b.（4）每管中添加50ul dl2502，混匀后置于60水浴5min，期间间断混合，直至凝胶块完全融化。【注意事项】观察各管内溶胶液溶解胶块的快慢程度。（5）将上述混合液转移至套放于2ml收集管的genclean柱中，室温放置2min，10000rpm室温离心1min，取出genclean 柱，并倒掉收集管中废液。（6）将genclean 柱重新放回收集管中，加入500ul wash solution，于12000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。（7）重复步骤（6）依次。（8）将genclean 柱重新放回收集管中，12,000 rpm，室温离心1min，以彻底去除wash solution。（9）将genclean 柱放入干净的1.5ml离心管中，在genclean柱膜中央加入30ul elution buffer，37放置2min。12,000rpm离心1min。（10）第一个孔道为4ul 的dl2502，后面6个孔道为对应编号2ul dna溶液，各孔道溶液均与1ul预染loading buffer gr0205混合后进行电泳检测，保存胶图。【注意事项】要求dl2502的9条条带全部回收成功，并且回收率达到80%以上。如下图所示：2.2 eb染色法 本操作涉及使用eb溶液，对人体有一定的危害作用，整个实验过程须佩戴手套，并将使用过的手套、枪头等弃于eb污染废弃物专用区域，禁止佩戴被污染的手套触碰非污染区域的物品。2.2.1 1.5%回收胶的制备 （1）准确称取1.5g琼脂糖置于250ml三角锥形瓶中，添加125ml 1tae溶液。（2）轻微混匀后将其置于微波炉中，高火加热6min至溶液沸腾，取出锥形瓶放置室温2min。（3）添加1tae溶液至110ml，再次于微波炉中高火加热3min至溶液沸腾。（4）室温放置10min后添加10ul eb溶液，摇匀后将溶液倒入插有1.0cm梳子的胶槽内，待胶块凝固后使用。2.2.2 电泳用移液器吸取50ul dl2502 dna marker点样于1.5%回收胶胶孔中，点2孔，两孔中间隔一个空白胶孔。180v电泳20min，使9条dna条带完全分离开。2.2.3 胶回收（1）取18个2ml离心管，分别编号为a1-a9号，b1-b9号，使用分析天平准确称取空离心管的重量。（2）在紫外灯下用干净锋利的手术刀片切下含有目的dna片段的凝胶块，按dna片段大小依次放入编好号的2ml离心管中，a号管放1号孔道的胶块，b号管放2号孔道的胶块。称取胶块与离心管总重，计算凝胶块的重量。（3）每100mg琼脂糖凝胶加入300ul binding solution b，于60放置5min，期间间断混合，直至凝胶块完全融化。【注意事项】观察溶胶液溶解胶块的快慢程度，观察溶胶液是否会从橙色变成粉红色。（4）将上述混合液转移至套放于2ml收集管的genclean柱中，室温放置2min，10000rpm室温离心1min，取出genclean 柱，并倒掉收集管中废液。（5）将genclean 柱重新放回收集管中，加入500ul wash solution，于12000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。（6）重复步骤（5）依次。（7）将genclean 柱重新放回收集管中，12,000 rpm，室温离心1min，以彻底去除wash solution。（8）将genclean 柱放入干净的1.5ml离心管中，在genclean柱膜中央加入30ul elution buffer，37放置2min。12,000rpm离心1min。（9）每管取3ul溶液进行电泳检测，dl2502取5ul电泳检测作为原始量对照。保存胶图。【注意事项】要求dl2502的9条条带全部回收成功，并且回收率达到80%以上。如下图所示：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上图1% agarose 凝胶电泳lane1 dna marker dl2502lane2 切胶回收的5000bp dna片段lane3 切胶回收的3000bp dna片段lane4 切胶回收的2000bp dna片段lane5 切胶回收的1500bp dna片段lane6 切胶回收的1000bp dna片段lane7 切胶回收的750bp dna片段lane8 切胶回收的500bp dna片段lane9 切胶回收的250bp dna片段lane10 切胶回收的100bp dna片段2.3 完成qc表格 完成实验后，将qc 表格填写完成，qc报告表格见附录。附录：date: _version no.: _qc operator:_quality certificate产品信息:产品名称: genclean dna gel extraction kit产品编号: 产品批次: 产品成分: storage: rt质检内容:dna 片断长度:_回收前dna 质量:_回收后dna质量:_电泳胶图：要求结果实际