leture基因表达与蛋白质纯化.ppt

复旦大学生物化学系复旦大学生物化学系 黄伟达黄伟达 whuangwhuang fudanfudan. .eduedu. .cn cn 20042004年年5 5月月1818日日 基因表达基因表达与与蛋白质纯化蛋白质纯化 技术探讨技术探讨 内内 容容 基因表达体系及优劣基因表达体系及优劣 势势 大肠杆菌中表达蛋白大肠杆菌中表达蛋白 质质 可能碰到的问题可能碰到的问题 基因工程的应用领域基因工程的应用领域 1. 1. 蛋白质功能研究蛋白质功能研究 2. 2. 生物制药和疫苗生产生物制药和疫苗生产 3. 3. 疾病的基因治疗疾病的基因治疗 4. 4. 食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂 5. 5. 抗虫、抗逆植物改良抗虫、抗逆植物改良 6. 6. 细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集 基因表达体系基因表达体系 1. 1. 原核体系原核体系 2. 2. 真核体系真核体系 大肠杆菌大肠杆菌 ( (Escherichia coliEscherichia coli ) ) 遗传背景清楚，基因工程 操作方便，商品化表达载体种 类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包含 体(无正确折叠的立体结构)， 无加糖等修饰 枯草杆菌枯草杆菌 ( (Bacillus Bacillus subtilissubtilis) ) 分泌蛋白质能力强，一般有天 然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋 白酶活性高，重组蛋白易受蛋白 酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的表 达载体 其其 他他 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 真核细胞表达体系真核细胞表达体系 酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞 哺乳动物细胞哺乳动物细胞/ /组织组织 植物细胞植物细胞/ /组织组织 酵母细胞酵母细胞 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构 ，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型 基因表达; 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养 上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe） 昆虫细胞昆虫细胞 可以病毒感染的型式在成虫中生 产，也可在体外培养细胞中生产蛋白; 适合分泌型和膜蛋白的表达，有 加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限； 作为药物宿主细胞未被FDA认可 CHOCHO细胞细胞 可进行分泌表达，有天 然立体结构，加糖方式与人 体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成 本较高 植物组织植物组织 植物可大面积种植，可以 廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表 达的组织特异性较难控制； 表达量较难提高，分离纯 化不方便 动物乳腺组织动物乳腺组织 分泌生产有天然立体结构 和活性的蛋白质至乳汁，产量 高，分离纯化方便，特别适合 药用蛋白的生产； 转基因动物制作花费巨大 ，实验周期长 鸟类输卵管组织鸟类输卵管组织 分泌生产有天然立体结构 的蛋白质到蛋清，产量高，容 易贮存和运输，分离纯化方便 ； 实验成本低，饲养费用低 ； 加糖方式可能与人有所不 同 体系选择体系选择 研究基因功能研究基因功能: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 裂殖酵母裂殖酵母, ,昆虫细胞昆虫细胞, , CHOCHO 细胞细胞 多肽药物生产多肽药物生产: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 毕氏酵母毕氏酵母, , CHOCHO细胞细胞, , 乳乳 腺组织腺组织 疫苗疫苗: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 酵母酵母, , 大多数沿用细胞培养产物进行大多数沿用细胞培养产物进行 灭毒灭毒 单抗生产单抗生产: : 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 工业酶生产工业酶生产: : 各种微生物各种微生物 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素 在大肠杆菌中生产人凝血在大肠杆菌中生产人凝血IXIX因子因子 在大肠杆菌生产在大肠杆菌生产CalcitoninCalcitonin类类C C端酰胺化短肽端酰胺化短肽 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表达的提高乳腺分泌表达的Factor IXFactor IX类因子的活性类因子的活性 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化 有可能以后做到的事有可能以后做到的事 在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达 外源基因外源基因 按蛋白质类型分按蛋白质类型分 单纯表达单纯表达: : pJLApJLA系列系列, , 用用NcoINcoI/ /NdeINdeI导入导入AUGAUG的载体的载体 融合表达融合表达: : 融合各种融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etctag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达分泌表达: : pelpel/ /ompTompT分泌肽分泌肽 按启动子分按启动子分 laclac及衍生的及衍生的tactac , , trctrc, , pacpac, , racrac等启动子等启动子 IPTGIPTG诱导诱导 lamdalamda phage P phage P L L 和和P P R R 启动子启动子 热诱导热诱导 T7 T7 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 T5 T5 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 araara启动子启动子 阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导 大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类 pJLA50XpJLA50X系列系列; ; pcDNAIIpcDNAII; etc; etc pETpET系列系列 ( (T7 promoter, T7 promoter, Novagen Novagen公司公司) ) pQEpQE系列系列 ( (T5 promoter, T5 promoter, QiagenQiagen公司公司) ) pMALpMAL系列系列 ( (周质表达周质表达, , BioLabsBioLabs公司公司) ) pGEXpGEX系列系列 ( (GSTGST融合表达融合表达, , PharmaciaPharmacia公司公司) ) pBADpBAD系列系列 ( (ArabinoseArabinose诱导型诱导型) ) 常用表达载体常用表达载体 pTYBpTYB系列系列 ( (CBDCBD融合融合, , 可以自我切割可以自我切割, , BioLabsBioLabs) ) Protein A Protein A GSTGST（glutathioneglutathione S- S-transferasetransferase） CBD (chitin-binding domain, CBD (chitin-binding domain, BioLabsBioLabs; ; cellulose-binding domain, cellulose-binding domain, NovagenNovagen) ) calmodulincalmodulin-binding domain, -binding domain, StratageneStratagene) ) MBP (maltose-binding protein)MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein)GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin Thioredoxin *帮助二硫键形成帮助二硫键形成 DsbDsb ( (periplasmaperiplasma enzyme enzyme DsbA DsbA, , DsbCDsbC) ) * * 二硫键的形成与二硫键的形成与 SUMO (small SUMO (small ubiquitinubiquitin-related modifier) -related modifier) KSI (KSI (ketosteroid isomeraseketosteroid isomerase) ) 基本上全部沉淀基本上全部沉淀 各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体 帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化 His-tag (His-tag (6-8 Histidine6-8 Histidine) ) T7-tag (T7-tag (MASMTGGQQMGMASMTGGQQMG) ) HSV-tag (HSV-tag (QPELAPEDPEDQPELAPEDPED) ) S-tag (S-tag (KETAAKFERQHMDSKETAAKFERQHMDS) ) VSV-G-tag (VSV-G-tag (TTDIEMNRLGKTTDIEMNRLGK) ) HA-tag (HA-tag (YPYDVPDYAYPYDVPDYA) ) Flag-tagFlag-tag ( (DYKDDDDKDYKDDDDK) ) MycMyc-tag (-tag (EQKLISEEDLEQKLISEEDL) ) 各种用于抗体识别的标记各种用于抗体识别的标记 BiotinylationBiotinylation-tag-tag 100100多多AAAA的结构域的结构域, , 在大肠杆菌中被识别为生在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点物素化的位点. . PromegaPromega的的PinPointPinPointTM TM Xa Xa-1; -1; InvitrogenInvitrogen的的pET104-DEST.pET104-DEST. 未未命名命名 DVEAWLGAR, DVEAWLGAR, 被用来和被用来和streptoavidinstreptoavidin结合结合 ( (个人通讯个人通讯) ) 未未命名命名 一些病毒外壳蛋白的片段一些病毒外壳蛋白的片段, , 破坏细胞膜的结构导破坏细胞膜的结构导 致容易进入细胞致容易进入细胞 有前景的特殊用途的有前景的特殊用途的tagtag DTT: DTT: inteinintein的的 CysCys 溴化溴化氰氰: : MetMet Thrombin: Thrombin: LVPRLVPR GS GS FactorFactor Xa Xa: : IEGRIEGR EnterokinaseEnterokinase: : DDDDKDDDDK PreScissionPreScissionTM TM protease: protease: LEVLFQ LEVLFQ GPGP Genenase Genenase I I TM TM PGAAHY PGAAHY TEV protease:TEV protease: ENLYFQENLYFQ G G 融合蛋白的专一性切割融合蛋白的专一性切割 BL21(DE3)/BL21(DE3)/pLysSpLysS : : 自身表达自身表达T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase 适用适用pETpET系列等带系列等带T7T7启动子的载体启动子的载体 M15/SG13009 : M15/SG13009 : 自身表达自身表达T5 RNA polymeraseT5 RNA polymerase 适用适用pQEpQE系列等带系列等带T5T5启动子的载体启动子的载体 BL21BL21TrxBTrxB(DE3) : (DE3) : thioredoxin reductase thioredoxin reductase 突变突变 Origami : Origami : thioredoxin reductasethioredoxin reductase/ /glutathione glutathione reductase reductase 双突变双突变 适合带适合带thioredoxin reductasethioredoxin reductase的的 融合表达载体融合表达载体, , 帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL: BR21CodonPlusRIL: 富含富含ATAT的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: BR21CodonPlusRP: 富含富含GCGC的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 特殊的表达用菌株特殊的表达用菌株 NovagenNovagen StratageneStratagene InvitrogenInvitrogen BioLabsBioLabs QiagenQiagen PharmaciaPharmacia PromegaPromega ClontechClontech RocheRoche GibcoGibco/BRL/BRL 重要的原核表达质粒提供商重要的原核表达质粒提供商 如果所表达的蛋白质有二硫键并如果所表达的蛋白质有二硫键并 需要正确的立体结构需要正确的立体结构, , 尽可能进行尽可能进行 可溶性表达可溶性表达; ; 如果所表达的蛋白质没有二硫键如果所表达的蛋白质没有二硫键 或只用来制备抗血清或只用来制备抗血清, , 采用包含体采用包含体 表达比较好表达比较好; ; 如果希望表达的多肽的分子量小如果希望表达的多肽的分子量小 于于10 10 kDa, kDa, 一定要进行融合表达一定要进行融合表达 采用采用MBDMBD融合融合 采用采用GSTGST融合融合 采用采用CBDCBD融合融合 采用采用thioredoxinthioredoxin融合融合 采用采用OrigamiOrigami等宿主菌等宿主菌 降低菌体培养的速度降低菌体培养的速度 温度温度 (15-30 (15-30), ), 降低转速降低转速 让表达产物可溶化让表达产物可溶化 采用采用CBDCBD融合融合 ( (pET36/37)pET36/37) 采用采用DsbDsb融合融合 ( (pET39/40)pET39/40) 采用带采用带pelBpelB/ /ompTompT引导肽的载体引导肽的载体 ( (pET12/20/22)pET12/20/22) 采用带采用带MBDMBD融合融合 ( (pMALpMAL载体载体, , BiolabsBiolabs) ) 采用带采用带SUMOSUMO融合融合 ( (pET SUMO, Invitrogen)pET SUMO, Invitrogen) 让让蛋白质分泌到间质去蛋白质分泌到间质去 纯化方便: 先用 EDTA/EDTA/蔗糖蔗糖 溶液处理, 然后 5 5 mM MgSO4 mM MgSO4 洗出 透析法透析法: : 简单简单; ; 但费时但费时, , 费缓冲液费缓冲液, , 蛋白质蛋白质 浓度不能过高浓度不能过高( (容易产生沉淀容易产生沉淀) ) 快速稀释法快速稀释法: : 最常用的小规模复性方法最常用的小规模复性方法; ; 但比较费时但比较费时, ,费缓冲液费缓冲液, , 蛋白质的浓度不能蛋白质的浓度不能 高高( (容易产生沉淀容易产生沉淀) ) 超滤透析法超滤透析法: : 比较省缓冲液比较省缓冲液, , 处理量大处理量大; ; 但费时但费时, , 要控制好蛋白质浓度要控制好蛋白质浓度 凝胶过滤法凝胶过滤法: : 快速快速, , 可重复性高可重复性高, , 不会产生不会产生 沉淀沉淀, , 操作复杂一点操作复杂一点 亲和层析复性法亲和层析复性法, , 水相二相法水相二相法, , etcetc 包含体来源蛋白质的复性包含体来源蛋白质的复性 表达量不够高；表达量不够高； 包含体在包含体在8 8MM尿素中不能溶解；尿素中不能溶解； 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小； 带带His-tagHis-tag重组蛋白不吸附到重组蛋白不吸附到Ni-chelatingNi-chelating树脂上；树脂上； Ni-chelatingNi-chelating分离纯化的效果不好；分离纯化的效果不好； GSTGST融合蛋白不吸附到融合蛋白不吸附到glutathioneglutathione- -SepharoseSepharose上；上； 包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀； Ni-chelatingNi-chelating错用错用DTTDTT后发生黑色沉淀该怎么办？后发生黑色沉淀该怎么办？ 贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？ 某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高 经常碰到的问题经常碰到的问题 尝试不同表达载体尝试不同表达载体 ， 特别是特别是NN端有融合端有融合 蛋白的载体蛋白的载体 是不是忘了加还原剂（是不是忘了加还原剂（DTTDTT 或巯基乙醇）？或巯基乙醇）？ 是不是在是不是在2020冻存过？冻存过？ 用用4 4MM盐酸胍试试盐酸胍试试 是不是酸性蛋白质？是不是酸性蛋白质？ 是不是蛋白质的合成提前中止了？是不是蛋白质的合成提前中止了？ （富（富 含含Arg, Arg, IleIle, , LeuLeu, Pro, Pro这几种氨基酸）这几种氨基酸）