紫外可见分光光度计基本知识.ppt

紫外可见分光光度 计基本知识 一、紫外-可见分光光度法 按所吸收光的波长区域不同，分为紫 外分光光度法和可见分光光度法，合称为 紫外-可见分光光度法。 它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用，对物质进行定性 分析、定量分析及结构分析, 所依据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 二、紫外-可见分光光度法的特点： 1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和 操作都比较简单，费用少，分析速度快; 2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度和准确度较高; 5 用途广泛。 三、紫外-可见吸收光谱 1. 物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收是选择性的，利用 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础。 通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长 max进行物质含量的测定。 四、影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的 关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH 等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位 置、吸收强度等都可能发生变化。 1.温度 在室温范围内，温度对吸收光谱 的影响不大。 2. 溶剂 注意如下几点： （1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶 液具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收 。 3. pH值 五、基本原理（朗伯五、基本原理（朗伯- -比尔定律）比尔定律） 设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透 射光强度为 It，反射光强度为Ir，则 I0= Ia+ It+ Ir 由于反射光强度很弱，其影响很小，上式 可简化为： I0= Ia+ It 1、吸光度和透光度 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即 A=lg1/T=lgI0/It 透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0 2、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含 有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与 吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= cl 式中比例常数与吸光物质的本性，入射 光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓 度 ，l为透光液层厚度。 3、吸光系数 当l以cm，c以g/L为单位，称为吸光 系数，用 a表示。 A= a cl a的单位为L/(g.cm) 当l以cm，c以mol/L为单位，称为 摩尔吸光系数，用 表示。 的单位为L/mol.cm，它表示物质的 浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液 的吸光度。 摩尔吸光系数 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm 时的吸光度值，用 表示。 4、偏离朗伯-比耳定律的因素 （1）入射光为非单色光 （3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。 （2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体， 蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发 射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。 光源吸收池 光检测器 谱图 Abs 单色器 六、紫外-可见分光光度计结构 线号显示 系统 主要部件的性能与作用 在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 1 光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。 可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320 2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱 。 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭 缝、色散元件和准直镜等部分。 2 单色器 单色器质量的优 劣，主要决定于色 散元件的质量。色 散元件常用棱镜和 光栅。 吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 3 吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在 0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。 4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将 光信号转变为电信号。现今使用的分光 光度计大多采用光电管或光电倍增管作 为检测器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读 检流计，电位调节指零装置，以 及自动记录和数字显示装置等。 七、紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光 度计和双波长分光光度计。 1.单波长单光束分光光度计 特点： 使用时来回拉 动吸收池 移动误差 对光源要求高 比色池配对 2.单波长双光束分光光度计 特点： 不用拉动吸 收池，可以 减小移动误 差 对光源要求 不高 可以自动扫 描吸收光谱 3.双波长分光光度计 特点： 利用吸光度差 值定量 消除干扰和吸 收池不匹配引 起的误差 八.分析条件的选择 1、 仪器测量条件的选择 1.1 适宜的吸光度范围 实验证明： 吸光度最适宜的测量范围为0.20.8之间 通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸 收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的 峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦 的次强峰或肩峰进行测定。 1.2 入射光波长的选择 光的互补：蓝 黄 1.3狭缝宽度的选择 为了选择合适的狭缝宽度，应以减少 狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准 。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收 峰半宽度的十分之一。 对多种物质进行测定，常利用显色反 应将被测组分转变为在一定波长范围有吸 收的物质。常见的显色反应有配位反应、 氧化还原反应等。 2 2、显色反应条件的选择、显色反应条件的选择 这些显色反应，必须满足以下条件： 4.反应生成物的组成恒定。 3. 反应生成的产物有足够的稳定性，以保 证测量过程中溶液的吸光度不变； 2反应有较高的选择性，即被测组分生成 的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光 谱有明显的差别； 1反应的生成物必须在紫外-可见光区有较 强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大； 测定试样溶液的吸光度，需先用 参比溶液调节透光度（吸光度为0）为 100%，以消除其它成分及吸光池和溶 剂等对光的反射和吸收带来的测定误 差。 3 3、参比溶液的选择、参比溶液的选择 参比溶液的选择视分析体系而定，具体有 ： 3.1 溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸 收池等因素； 3.2 试样参比 如果试样基体溶液在测 定波长有吸收，而显色剂不与试样基体 显色时，可按与显色反应相同的条件处 理试样，只是不加入显色剂。 3.3 试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收，按显色反应相同的条 件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂 作为参比溶液。 3.4 平行操作参比 用不含被测组分的 试样，在相同的条件下与被测试样同时 进行处理，由此得到平行操作参比溶液 。 九、测定方法九、测定方法 1、 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组 分，或者是在混合物溶液中待测组分的 吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠 。 其定量方法包括校准曲线法、标准对 比法和吸收系数法。 1 校准曲线法 方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选 用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列 标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲 线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方 程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度， 从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试 样的浓度。 2 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液，在相 同的条件下，测定各自的吸光度，建立 朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度 与含量。 As=Kcs Ax=Kcx 紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于 物质的定量分析外，还可以用于物质 的定性分析、纯度鉴定、结构分析。 1.1.定性分析定性分析 先用标准样品扫描谱图，在扫待测样品 的谱图。拿两者进行比较，可进行定性。但 此方法误差 比较大。 2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方 便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260或A230/A260的比值，鉴定其纯度。 蛋白质浓度 1552A280757.3A260 (ug/ml) DNA浓度 62.9A26036.0A280 (ug/ml) 蛋白质浓度 183.0A23075.8A260 (ug/ml) DNA浓度 49.1A2603.48A230 (ug/ml) 3.