《生物学讲稿》PPT课件.ppt

第五章：转基因体的鉴定验证 外源基因是否进入受体细胞？ 进入受体细胞的外源基因是否整合到染 色体上？ 整合的方式如何？ 整合到染色体上的外源基因是否表达？ 这一系列的问题仍需回答，只有获得充分 的证据后才可队定被检的材料是转基因的。 外源基因整合的分子生物学鉴定主要 有PCR扩增、PCR-Southern杂交、 Southern杂交以及Southern原位杂交和 FISH等。 一、外源基因整合分子生物学鉴定 1 利用PCR扩增检测外源基因整合 以被检植株DNA为模板，以外源基因序列设计 引物进行扩增。 琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，若被检植株基 因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物， 琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。反之， 非转化植株无特异性扩增条带出现。 通过特异性扩增条带的有无及其分子量的大小 可对外源基因是否整合做一初步判断。 斑点杂交可以快速粗略地检测一下植物基因 组内是否含有外源基因。 2 Southern斑点杂交 操作过程：植物总DNA或基因组DNA不经限制性 内切酶酶切，直接点在固相膜上。点样前DNA样 品需经变性处理，一般做法是采用NaOH碱变性 ，也可以通过煮沸变性。轻微洗膜除去盐后进 行固定，以后的操作与印迹杂交相同。 斑点杂交的主要问题是假阳性率较高。 斑点杂交虽可以简便快速地检测植物染色体 DNA中是否含有目的基因及大致的量，但不能 反映外源基因整合的更多信息。 3 Southern印迹杂交 Southern印迹杂交由Southern于1975年建立 ，用来检测经限制性内切酶切割的植物DNA片 段中是否存在与探针同源的序列，并可分析外 源基因在植物染色体上的整合情况，如拷贝数 、插入方式以及外源基因在转化植株Fl代中的 稳定性等问题。 将被检植株的基因组DNA提取出来，用限制性 内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有外源基因 片段或含外源基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电 泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝 胶上。 1）Southern印迹杂交原理 用碱处理凝胶，使各酶切片段在凝胶上原位变 性，利用印迹技术将变性的各酶切片段由凝胶转 移到固相膜上，各片段在固相膜上的相互位置与 在凝胶上相同，实现所谓的原位印迹。 经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与 固相膜牢固结合。 经预杂交处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点 后，将膜放入含有单链或经变性处理成为单链探 针的杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。 膜上与探针同源的单链序列，可通过碱基互补 作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应 位置上。外源基因与探针同源，凡含有外源基因 序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异 性杂交体。 漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离 的探针。 最后根据探针的标记性质进行检出，特异 性杂交体的数量及位置将清晰而准确地显示 出来。 实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA 样品及待检转化植株总DNA样品。 2）Southern印迹杂交的实验样品 阳性对照样品：含被检的外源基因的中间载体质粒 DNA；或农杆菌共整合载体的Ti质粒DNA；或农杆菌 双元载体小质粒DNA。 阴性对照样品：用相同方法提取的非转化植株总DNA。 分子量标准DNA样品：DNAHind、或DNA HindIII+EcoR I。 被检样品：各转化克隆植株总DNA。 3）Southern印迹杂交的实验程序 Southern印迹杂交需要依次完成如下8个实验步 骤：植物总DNA的限制性酶切；凝胶电泳 分离各酶切片段；各酶切片段于凝胶中原位 变性；将凝胶中变性的DNA片段转移到固相 膜上；预杂交，掩盖非特异性位点；探针 与膜上同源DNA片段杂交；漂洗去除未结合 的及非特异性结合的探针；杂交体检出。 各程序中有关问题阐述如下： 植物总DNA的限制性酶切 * 限制性内切酶的选择 多数情况是对植物基因组DNA进行单酶切， 也可进行双酶切。酶的选用原则是消化后生成 的DNA片段可提供出与探针杂交所需的足够信 息，即限制片段中必须含有整个探针序列。 酶切反应体系 * 植物DNA的用量一般在515g； * 酶切体积为20一50l； * 酶的用量要比消化质粒DNA时高一些，一般 为510U/g DNA。 Notice: 限制性内切酶是保存在50的甘油中， 如果酶切反应体系中甘油浓度超过5，则会引 起限制性内切酶专一性改变，产生星活性。 酶切效果检验 酶切体系及条件是否合适，需通过检测酶切效 果来确定。 酶切充分的植物DNA产生若干大小不同的片段 。将酶切样品用0.7或0.8的琼脂糖凝胶分 离，电泳后在紫外灯下观察，酶切效果好的样 品应呈现出一条连续的，荧光由深至浅的均匀 条带(高分子量区深，低分子量区浅) 。 凝胶中的DNA变性 Southern杂交必须是单链探针与单链同源DNA 片段结合，因而凝胶上的双链DNA片段必需经 变性处理，使之成为单链。通常采用碱变性，将 凝胶浸泡在0.5molL NaOH、1.5mol/L NaCl溶 液中，室温下于脱色摇床上轻摇，其间可更换一 次变性液以使DNA充分变性，注意胶不要浮在 液面上。 印迹 Southern杂交是杂交液中的探针与固定在固相 支特物上的同源序列进行的固液杂交。固相支 持物也称固相膜或简称为膜。将凝胶上的变性 DNA片段原位转移到固相支持物上的过程称为 印迹。为满足印迹及杂交操作的要求，固相膜必 需具有如下特点： 能很好地与DNA分子结合，要求每平方厘米 能结合10g以上的DNA，同时又不影响DNA片 段与探针杂交，对探针及其它物质的非特异性 吸附小，具良好的机械性能。 印迹方法 第一、毛细转移法：该方法是利用干燥吸水纸 的毛细作用进行转移。 第二、电转移法：电转移法是利用电泳的原理 ，凝胶上的DNA片段在电场作用下脱离凝胶， 原位转至固相支持物上。 第三、真空转移法：真空转移原理是利用真空 作用造成流经凝胶的液流，使凝胶中的DNA片 段洗脱出来而沉积在凝胶下面的固相支持物上 。 预杂交 *预杂交：预杂交是在加入探针前用封闭剂封闭 膜上的非特异性位点。由于固相膜对单链DNA 有很强的结合力，所以膜不仅能与印迹过去的样 品DNA结合，而且也能与探针结合。在印迹后 的膜上，除样品占据的位置外还有空余，如不将 这些空余部位封闭，探针就会被结合，掩盖了特 异性杂交。 常用的封闭剂有两类，一类是变性的非特异性 DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA等。另 一类是高分子化合物，如聚蔗糖400(菲可尔)、聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、小牛血清白蛋白(BSA)，这 三种试剂按一定比例配比，就构成Denhardts封 闭试剂。此外，脱脂奶粉也可使用，还有使用肝 素的报道。 预杂交操作是将印迹后的固相膜放在含有封闭 剂的预杂交液中，于3742温育312小时。 杂交与洗膜 Southern杂交是液相中的探针与固定在膜上的 同源序列碱基配对形成异源双链的过程，杂交是 以DNA的复性为理论基础。 杂交效果的好坏主要取决于杂交的特异性、灵 敏性及杂交反应速度。它们受杂交体系中的探针 浓度、样品浓度、温度、离子强度等多种因素的 影响并与非特异性位点的封闭、非特异性杂交的 消除直接相关。 *洗膜：洗膜是除去游离的及在非特异性位点上 结合的探针。洗膜液的温度、离子强度及洗膜时 间是影响洗膜效果的三要素。 通常采用低于特异杂交体Tm值1220的温 度洗膜。 一般采用2XSSC0.1XSSC溶液洗膜，洗膜液 中还经常加入5的SDS以促进非特异性杂交链 的解离。降低洗膜液的离子强度可提高洗膜效 果。 杂交信号的检出 放射性标记的探针通过放射自显影检出。非同 位素标记的探针根据标记物的特有性质检出。 放射自显影 包括压片、显影、定影和水洗四步。 非放射性标记探针的检出 目前大多数非放射性探针的制备都是采用分 子杂交与酶反应相结合的策略。杂交后杂交信 号的检出依赖于酶反应。但除酶直接标记的探 针可直接通过酶反应检测外，其它的非放射性 标记物，如生物素、地高辛等标记探针的杂交 信号均不能直接检出，要先使杂交体与酶标记 的检出系统特异结合后，再通过酶反应间接检 出。 Southern 印迹杂交结果分析 利用Southern印迹不仅可以分析出外源基 因是否整合到植物染色体上，而且还可以对 外源基因的整合情况进行分析，如整合的外 源基因是单拷贝还是多拷贝，多拷贝的插入 方式如何，是串联插入还是分散插入，串联 的方式是同向还是反向等。 对于农杆菌介导的转化体，分析的基本方法是用 重叠探针杂交，并以转化的外源基因不同拷贝数 为对照。其原理是转化植株基因组DNA用限制性 内切酶消化时，外源DNA序列会产生四种片段 。 内部片段：由外源DNA内的切点产生。 边界片段：是外源DNA插入的末端片段。 复合片段：这种片段与TDNA的左边界及右边 界表现同源。 重新编排的序列：这种限制性片段可能来自T DNA的重新编排或异常整合。也可能是正常整合 后发生。 通过对转基因植物Southern印迹杂交的分析， 可获得外源基因是否整合到植物基因组中、整合 方式及拷贝数的信息。但对于外源基因在植物染 色体上整合位点，即整合在哪条染色体的哪个位 置上，印迹杂交就难以提供可靠的根据。 因此要想了解外源基因在植物染色体上的整合位 置，就需要利用原位杂交技术了。 4 Southern原位杂交 原位杂交即是通过杂交确定杂交体在样本中 的原本位置。这里说的Southern原位杂交是确 定外源基因在染色体上的位置，它基于处于分 裂过程中的植物细胞染色体可以用光学显微镜 观察到，并可以通过染色体的形状以及经不同 染色后形成的条带分布来对各染色体进行鉴别 及分析。原位杂交以标记的外源基因为探针， 在适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞 内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体， 然后根据探针的标记性质进行检测，在显微镜 下观察。 原位杂交包括取材及材料预处理、固定细胞、细 胞的RNase酶解及染色体变性、杂交、检出五个程 序。探针的制备与印迹杂交相同。在取材及材料 处理上，因要观察的是细胞内的染色体，有丝分 裂中期的染色体。取材时应取便于观察染色体的 材料，如植物的根尖、茎尖、幼叶、幼小的子叶 、茎形成层、居间分生组织、愈伤组织、花蕾、 花粉、胚乳等，还要用化学或物理的方法对材料 进行预处理，阻断纺锤体微管的形成，使有丝分 裂停滞于中期，这样可以得到大量的供实验用的 染色体。 目前原位杂交技术存在两个问题： 一是灵敏性不高。 二是有时会出现非特异性杂交。 PCR-Southern杂交是一种近年来开始使 用的检测外源基因整合的方法。该方法 先对被检材料进行外源基因的PCR扩增 ，然后再用目的基因的同源探针与扩增 的特异性条带进行杂交。 5 PCR-Southern杂交检测 1）转基因植株PCRSouthern杂交检测 （1）样品设置 为确保检测的真实性，除被检样品外，实验中应设置三个 对照： 空白对照：无任何DNA模板(反应体系中不加入任何模 板DNA，其它试剂相同，主要检测反应体系中有无DNA 污染)。 阳性对照：以外源基因的质粒载体DNA为模板。 阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。 被检样品：以不同克隆系的基因组DNA为模板。 （3）印迹及杂交 将扩增产物电泳后的凝胶碱变性处理后 转移到固相膜上，以目的基因为探针进 行杂交。操作程序和方法与Southern杂 交相同。 （2）PCR扩增及产物电泳 （4）杂交结果 凝胶中的特异性扩增条带能发生杂交。非特 异性扩增条带不发生杂交，所以阳性对照应 产生杂交带，非转化植株无杂交带。各被检 植株样品中出现杂交带的可被确定为转基因 的。 （5）PCRSouthern检测中应注意的问题 初次进行PCR扩增时易出现如下问题： 没有得到特异性扩增产物。可能的原因有酶变 性失活、模板变性不充分、引物不正确或试剂失 效。出现这种情况时，可先增加预变性时间，若 仍无效，则应换用新试剂。 电泳谱上无清晰的扩增条带出现，而是呈降解 片状。出现此种现象主要原因是模板过量，应减 少模板及酶用量。 产物特异性不强。应减少引物量及提高退火 温度、减少Mg2+浓度。 出现引物二聚体条带。首先检查引物是否存 在3端互补的问题，如果无此问题，应减少引 物量及循环次数。增加原始模板量及退火温度 。 实验操作中要注意防止DNA污染，那怕是痕量 的也要防止。操作时要戴一次性的手套。所用的 器皿，离心管、吸头等均应使用新的，并要经过 高压灭菌。盛有PCR试剂的小离心管打开前应用 离心机轻离一下，使试剂沉到管底，这样做可防 止取液时手套、移液器对试剂的污染。如有条件 ，整个操作都应在超净工作台中进行。 实验结果的分析要慎重，由于PCR的灵敏度极 高，同时植物基因组又大又复杂，对扩增出的条 带要进行认真的分析，以区分出特异性扩增及非 特异性扩增。 （二）外源基因表达的检测 基因表达检测分为两个水平： 一是在转录水平上对特异mRNA的检测。主要方法 是Northern杂交，其中包括斑点杂交及印迹杂交； 二是在翻译水平上对特异蛋白质的检测。检测方法 有三种：生化反应检测法：主要通过酶反应来检 测；免疫学检测法：通过目的蛋白(抗原)与其抗体 的特异性结合进行检测，具体方法有免疫沉淀法、 酶联免疫吸咐法(ELISA)及Western杂交；生物学 活性的检测。上述方法中Northern杂交及Western杂 交又属于分子杂交检测。 1 Northern杂交 同Southern杂交一样，Northern杂交又分为斑点杂 交及印迹杂交，斑点杂交只需将RNA样品点样在 固相膜上直接与探针杂交，而Northern印迹杂交 则需先将从试材中提取的总RNA或mRNA样品进 行电泳分离然后转移到固相膜上，再与探针杂交 。斑点杂交只能鉴定外源基因是否转录，而印迹 杂交可对外源基因的转录情况进行较详细的分析 ，如RNA转录体的大小及丰度等。 Northern杂交程序也分为三大部分： 植物细胞总RNA的提取， 探针的制备, 印迹及杂交。 （1）植物RNA的提取 植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细 胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、 tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及 小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质 RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA 及叶绿体RNA。这些RNA统称细胞总RNA，其中 大量的是rRNA，占80左右。基因转录产物 mRNA在总RNA中只占15。对于Northren 杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总 RNA中分离出的mRNA。 （2）探针制备 杂交探针选定：检测外源基因转录的mRNA，应 使用同源DNA探针，杂交后形成DNA探针mRNA杂 交体。检测目的基因表达情况时以目的基因为探 针，也可使用cDNA探针。研究基因表达调控时常 以报告基因表达为对象，这时可将报告基因标记 成探针，如Npt-基因、胭脂碱合成酶基因等。 探针来源：与Southern杂交的探针制备大体相 同，除可人工合成外，探针序列主要从质粒上 切取。 探针标记物及标记方法与Southern杂交相同， （3）Northern斑点杂交 Northern斑点杂交是检测植物基因转录本稳定 表达量的有效方法，可用于外源基因表达及表达 调控的研究。由于斑点杂交不能检测出转录的 mRNA的分子量，因而只在外源基因与植物本身基 因无同源性时才可明确地检测出外源基因是否表 达。当外源基因与植物本身基因有一定的同源性 时，如果使用的探针能够分出内源基因及外源基 因的区别，或通过控制杂交条件可以使内、外源 基因与探针杂交情况产生差异，采用斑点杂交进 行检测还是可行的。 Northern斑点杂交大致过程是：预处理材料 。试材总RNA提取。按实验要求稀释样品、 将样品点在固相膜上。同时要点上阳性对照样品 及阴性对照样品。在点样前各样品均要进行变性 处理，RNA样品于65水浴中保温1015分钟， DNA样品要经煮沸25分钟，加热及煮沸后立即 置冰中速冷。点样后膜烘干或经紫外线照射固定 样品。膜与不含探针的杂交液温育，以封闭非 特异性位点。加入经变性处理过的探针，进行 杂交。根据标记物性质进行检出。分析杂交 结果，通过与阳性对照比较来估计外源基因表达 量。 （4）Northern 印迹杂交 1)原理 整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达 ，在转化植株细胞内将有其转录产物特异mRNA 生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分 离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶 上，将它们原位转移到固相膜上，在适宜的离子强 度及温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA DNA杂交双链。通过探针的标记性质可以检出杂交体 。根据杂交体在膜上的位置可分析出杂交RNA的大小 。若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源 基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部 位及生理状态下该基因并未有效表达。 2)杂交程序 Northern杂交程序中除第一步总RNA或 mRNA变性凝胶电泳分离与Southern有着较大不 同外，其它步骤与之相同。 RNA电泳时必须解决两个问题：一是防止单链 RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶；二是 电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用。 常用的变性凝胶电泳 变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲 酰胺。尿素和甲酰胺会引起琼脂糖固化， 甲 醛使RNA变性的原理是它能与碱基结合形成具 有一定稳定性的加合物，阻止碱基配对。同时 甲醛对蛋白质分子中的亲核基团如e胺基、 胍基、巯基等具一定反应性，可使酶分子失活 。 电泳时各样品的量大致如下： 标准RNA：12g 植物总RNA：1020g 植物poly(A)RNA 0.53.0g 阳性对照0.55.0g 电泳条件：RNA变性胶电泳时一般要求较低电压， 34Vcm。电泳至胶34处，约需几小时。RNA电 泳过程中要注意监测电极液的pH值，电泳时整个电 路的电流是由两个浸泡在缓冲液中的电极的电解作 用来维持，负极产生氢气及氢氧根(e+H2OH2+OH-) ；正极产生氧气及质子(H202H+1/202+ 2e)，由于 电极缓冲液的缓冲容量有限，因而电泳一段时间后 电极槽中缓冲液的pH值会发生变化，而pH超过8时， 会引起甲醛RNA、乙二醛RNA复合物解离，因此 在RNA变性电泳过程中，缓冲液要不断循环，无循环 设备时，每隔30分钟左右更换一次缓冲液，或将两 槽的缓冲液混合后再分配到两槽中。 染色：甲醛变性凝胶电泳时上样缓冲液中可加 入1g的EB，电泳后胶可以直接放紫外光下观察 、照相。如果条带不清晰，可先将胶浸泡在 0.1XSSC溶液中约20分钟，以除去甲醛，然后再将 胶置含0.5gmlEB的0.01XSSC溶液中染色20分 钟。对于丰度低的RNA及乙二醛变性时，采用电泳 后染色。 1992年Larrick报道了用RT-PCR(reverse transcribed PCR)方法检测外源基因在植物细胞 内的表达。其原理是以植物总RNA或mRNA为模板 进行反转录，然后再经PCR扩增，如果从细胞总 RNA提取物中得到特异的cDNA扩增条带，则表明 外源基因实现了转录。 2 RTPCR检测 反转录时有两种作法，一种是