分析化学 第 二 十 章 高 效 液 相 色 谱 法.ppt

第 二 十 章 高 效 液 相 色 谱 法 l高效液相色谱法的特点 一、概述 液相色谱法是指流动相为液体的技术。 早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体 积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液 （流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相 依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相 颗粒不能太小)，分离时间很长。 70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服 了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成 为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在 经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技 术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达 4.9107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米 塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度 的检测器，可对流出物进行连续检测。 二、特点 1高压： 液相色谱法以液体为流动相（称为载液）， 液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通 过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150 350105Pa。 2. 高速： 流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般 可达110ml/min。高效液相色谱法所需的分析时 间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效： 近来研究出许多新型固定相，使分离效率大 大提高。 4.高灵敏度： 高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器， 进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度 可达10-12g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽： GC与HPLC的比较：GC虽具有分离能力好，灵敏 度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术 条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质 都难于应用气相色谱法进行分析。而HPLC，只要求 试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥 发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子 量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占 有机物总数的 75% 80% ）原则上都可应用高效 液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化 合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相 色谱分析的约占7080%。 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 一、高效液相色谱法的主要类型 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种 主要类型： 1 液 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) a. 正相液 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c.液液分配色谱法的缺点： 尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但 固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱 柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70 年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上 述缺点。现在应用很广泛（7080%）。 2液固色谱法 3离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography) 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换 色谱法来进行分离。 4 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子 电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动 相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离 子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原 理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 = X+Y-有机相 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以 分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非 离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、 生物碱以及药物等分离。 5 .离子色谱法(Ion Chromatography) 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动 相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中 强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑 制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与 离子交换色谱法相同。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。 也可用于阳离子分析。 6 .空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography) 空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子 筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米 到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来 进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径 分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱 柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中 一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过 柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有 胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色 谱图上最后出现。 二、液相色谱法固定相 液-液色谱法及离子对色谱法固定相 与GLC类似，LLC的固定相也是在担体上涂渍一层 固定液构成，或使用化学键合相。 1.担体 所用的担体可分为如下几类： 1.全多孔型担体： 2.表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 2固定液 液液色谱流动相和固定相都是液体，因此 要求两相要互不相溶。在液-液色谱中常用的固定 也只有极性不同的几种，如，-氧二丙腈、聚 已二醇-400和角鲨烷等。 3化学键合固定相 将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种 固定相，在实际使用时存在不少缺点，20世纪60 年末发展起来了一种新型的固定相-化学键合固 定相。 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结 合到担体表面。根据在硅胶表面 (具有SiOH基 团) 的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳 键型 ( SiOC ) ；硅氧硅碳键型 (SiO SiC ) 硅碳键型（SiC）和硅氮键型（Si N）四种类型。 化学键合固定相具有如下一些特点： . 表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多 . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应 用于多种色谱类型及样品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和 馏分的收集。 液固吸附色谱法固定相 采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰 胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如 前所述。 离子交换色谱法固定相 1.薄膜型离子交换树脂:即以薄壳玻璃珠为担体，在 它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相:用化学反应将离子交换基团 键合在惰性担体（如微粒硅胶）表面。 树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）； （2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。 排阻色谱法固定相 1. 软质凝胶：如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水 为流动相，在常压下使用。 2. 半硬质凝胶：如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联 聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性 有机溶剂。 3. 硬质凝胶：如多孔硅胶、多孔玻璃等，多孔硅胶是用得较 多的无机凝胶。 l化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用。 l近年来发展起来的可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄 粒度分布。用它固定相，色谱柱易填充均匀；柱压、流动 相流速、pH值或离子强度对分离的影响小，适用于较高 流速下操作。 三、液相色谱法流动相 在气相色谱中，载气是惰性的（与组分分子之 间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他 们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性， 只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当 固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响 分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。 l选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注 意下列几个因素 (1) 流动相纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱 和使检测器噪声增加。 (2) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损 坏柱子。如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不 相溶，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏 氧化铝固定相等。 (3) 对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应 有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 (4) 溶剂的粘度小些为好：否则，会降低试样组分的 扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。 (5) 应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器 时，流动相不应有紫外吸收。 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依 据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中 等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极 性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其 中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙 酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。 l除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是 最重要的依据，有时还需要采用二元或多元 组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的 极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰 时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验 确定。 四、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 液相色谱速率理论影响色谱峰扩展因素 1. 涡流扩散项A = 2dp 其含义与气相色谱法相同。 2.纵向扩散项 由于分子在液相中扩散系数比气相中要小得多，一般小 45个数量级。故在液相色谱中，此项可以忽略不计。 3传质阻力项 可分为固定相传质阻力项和流动相传质阻力项。 提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速 率；提高柱内填料装填的均匀性。 影响分离的因素流速 液相色谱H-u曲线与其气相色谱不同，是一