菊花的组织培养技术.pptx

第六节 主要经济植物组织培养技术 一、菊花的组织培养技术 二、蝴蝶兰的组织培养技术 三、大花蕙兰的组织培养技术 四、美国红栌的组织培养技术 五、马铃薯的脱毒与快繁技术 蔡艳丽 菊花的组织培养技术 （一）培养意义 菊花的繁殖可以用播种法、扦插法、 分株法、组织培养法。在种苗生产上运用最 为广泛的方法是扦插和组培。由于菊花的病 毒病种类比较多，而且危害也较为严重。使 用扦插繁殖苗，容易引起病毒病的扩张和蔓 延，因此茎尖脱毒培养和组培快繁生产母株 植株，再生产扦插苗的技术，对优良品种的 脱毒和复壮有重要意义。 1.外植体的选择与处理 2.外植体的清洗、消毒与接种 3.初代培养 4.增殖与继代培养 5.生根和移栽 二、培养程序 1.外植体的选择与处理 以花序轴为外植体时，选取具有该品种典型 特征的，饱满壮实的花蕾，最好是将要开放而没有 开放的花蕾，这时花瓣外好象有一层薄膜包围着， 里面仍是无菌的，采回实验室后做表面消毒，便于 无菌条件下剥离出花序轴。 2.外植体的清洗、消毒与接种 材料初步切割后，用洗衣粉水漂洗，再用自来 水冲净后，在超净工作台上将其放入70%75%的酒 精中浸润30 s，转入2%次氯酸钠溶液中消毒815 min，并不时摇动，最后于无菌水中漂洗35次后 待用。 茎段从两端切去一小段；花蕾须剥去花被， 用中部花瓣或花序轴接种。 3.初代培养 在2426，每天1216 h，光强 1 0004 000 Lx条件下 ，外植体经培养后，一般1020 d茎尖处可分生出新芽，茎 段的叶腋处也会萌发出新芽。而花蕾外植体经过1520 d的 培养，会形成愈伤组织；再经过2030 d的培养，愈伤组织 就会分化出较多的丛生芽 。 4.增殖与继代培养 将从以上外植体诱导分 化出的单芽或丛生芽，分切 成数段或数块放入增殖培养 基中继代培养。开始分化率 和分化苗的数量都较小，随 继代次数增加，分生苗很快 就能够增多起来。 增殖方法还有：用产 生的嫩茎为材料，培养其长 到一定高度时，将嫩梢剪成 一节带一叶的茎段，然后插 入MS或MS+NAA0.1 mg/L的 培养基中培养，45周后， 腋芽即生长成小植株，再照 上述方法切剪茎段，重复培 养，从而达到快繁的目的。 5.生根和移栽 菊花无根苗生根一般较容易， 通常在增殖培养时久不转瓶， 即可生根，但这种根的根毛较 少或无，不利于将来移栽和生 长，所以常用下列方法处理： （1）无根苗的试管生根 ，切取3 cm左右无根嫩茎，转 插到12MS+NAA(或IBA)0.05 mg/L的培养基中，经10 d左右 即可生根，然后移栽驯化。 （2）无根嫩茎直接插植 到基质中生根。剪取23 cm无 根苗，插植到珍珠岩或蛭石的 基质中，基质事先用生根激素 溶液浸透，l0d后生根率可达95 100。 6.出瓶苗的过渡管理 菊花的有根苗移栽成 活容易，将有根的植株从 瓶中用镊子轻轻夹出，洗 净根部黏附的琼脂，栽入 蛭石基质中。然后加设小 拱棚以保湿，随着幼苗的 生长，逐渐降低空气湿度 和基质含水量，转为正常 苗的管理阶段。移栽前期 将空气湿度保持在75% 85%之间，遮光率为40% ，环境温度控制在20 26，就可使试管苗在 20d左右移栽成活，并长 出新根新叶。 分化芽 二、蝴蝶兰的组织培养技术 （一）培养意义 蝴蝶兰属于兰科、蝴蝶兰属，为多年生热带花卉 ，是世界上栽培最广泛、最受喜爱的洋兰之一。 蝴蝶兰的繁殖大多采用分株的方法，得到种 苗量少，不能满足栽培的需求。通过组织培养技术繁 育蝴蝶兰种苗，实现“兰花工业”是目前繁殖率最 高、种苗质量最优秀的方法。 （二）培养程序 1.外植体的选择 2.外植体的处理、接种与初代培养 3.增殖与继代培养 4.壮苗与生根培养 5.驯化移植 二、培养程序 1.外植体选择 蝴蝶兰的组织培养外植体有茎尖、茎段、叶片、花 梗腋芽、花梗节间、根尖等，各部位都能诱导成功， 只是难易程度不一。 用花梗腋芽或花梗节间作外植体，容易诱导，外 植体表面灭菌成功率高，是最合适的外植体取样部 位。 2.外植体的处理、接种与初代培养 花梗腋芽的培养：剪取整枝花梗，清水冲洗30 min ，将花梗剪成长约23 cm带腋芽的切段，用无菌吸水 纸或纱布吸干水分，带入无菌操作室按无菌操作程序 进行接种。先用70%的酒精溶液浸泡30 s，再用0.1%的升 汞溶液浸泡810 min，用无菌水反复冲洗58次，接 种在MS+BA 3 mg/L的培养基上，可使腋芽萌发为丛生 芽。 取生长期在45 d以内的蝴蝶兰花梗，经无菌操作消 毒后，（消毒方法同花梗腋芽）斜切成11.5 mm厚的薄 片，平放在固体培养基上。培养温度2428，光照强 度500 Lx，每天光照16 h培养。培养基用1.2倍的V&W无 机盐配方，加肌醇100 mg/L，维生素B1、B6和烟酸各0.5 mg/L，BA1 mg/L，蔗糖2%。形成原球茎快而多。 花梗节间的培养： 3.增殖与继代培养 原球茎的增殖培养基以MS+BA 5 mg/L +NAA 0.1 mg/L的增殖效果最好。在不含或只含低浓度BA 0.10.5 mg/L的KC或MS培养基上培养约40 d后，原 球茎表面分化一些绒毛状物，进而分化出芽。大约3 个月就可以发育形成完整小植株。 花梗腋芽诱导出丛生芽后，接种于继代培养基 13MS+NAA 0.5 mg/L+ BA110 mg/L (pH5.6左右)，每4050 d继代1次，增殖倍数23 倍。 4.壮苗与生根培养 将分化形成的完整小植株移入壮苗培养基 MS(KC)+NAA 0.1 mg/L+10%香蕉汁中。培养1个月后， 平均每株有4条根、4片叶片，植株生长健壮。当小苗 高达34 cm时，转接到1/2MS+IBA0.5 mg/L的培养基 上进行生根培养，约3个月转移一次新鲜的培养基，生 根率可达100%。当试管苗具有34条粗壮的根、株高 达到78 cm时，可以移栽。 将试管苗带瓶移出培养间，放置于温室中炼苗， 15 d后打开瓶盖，每天早、中、晚各喷水一次，保证 足够的湿度。3 d以后，用镊子将小苗轻轻夹出培养 瓶，洗净根部培养基。可先用1 500倍的多菌灵药液 浸泡510 min，然后以水草包裹蝴蝶兰根部，将其 定植于穴盘中。 定植前依叶子长度及根的生长状况进行分级， 将大小近似的苗栽植在同一规格的穴盘中，以便日后 管理。环境温度保持2528，保持湿度85%左右， 防止阳光直射。当新叶长出、新根伸长时，每周1次 叶面喷施0.3%0.5%KH2PO4溶液追肥，成苗率可达 95%以上。 5.驯化移植 三、大花蕙兰的组织培养技术 大花蕙兰常规的繁殖方法有分株繁殖、播种繁殖。 分株繁殖系数低且速度很慢；大花蕙兰结实极少，只 有在母株周围播种才可自然萌发，而且发芽率及成活 率极小，故用常规的繁殖方法不能满足栽培的需求。 通过组织培养技术繁育大花蕙兰种苗，是目前生产中 最常用、最有效的方法。 （二）培养程序 1.外植体的选择与接种 2.初代培养 3.增殖与继代培养 4.壮苗与生根培养 1.外植体的选择与接种 用于大花蕙兰组织培养的外植体有茎 尖、茎段、芽体等。芽体经过消毒后，在无 菌条件下剥出茎尖，接种于启动培养基上。 2.初代培养 将茎尖接种在MS+BA 1.0mg/L+NAA0.5mg/L 的诱导培养基上，25d左右外植体周围开始出现 许多白色、大小不一的颗粒状愈伤组织，继续 培养则由白色逐渐转为绿色，即为原球茎。 3.增殖与继代培养 将原球茎转至12MS+BA2.05.0mg/L+NAA0.5 1.0mgL+活性炭0.5%的增殖培养基中进行继代培 养，在几种培养基上都能快速增殖，同时分化出丛 芽，形成原球茎与丛生芽同时存在的现象。 4.壮苗与生根培养 将2cm左右高的茎芽从原球茎团块上切下， 接种到1/2MS+ BA1.02.0mg/L +NAA0.1 1.0mg/L的生根壮苗培养基上培养，茎芽2周后开 始生根，叶片伸长、植株增高；1个月后可长成 高5cm以上的完整植株。 当瓶苗有34条根，且根长达23cm时，将培 养瓶放置于有明亮散射光的温室进行炼苗，15d后 即可打开瓶盖再放置23d。移栽前洗净苗根部的 培养基，移栽于预先消毒过的基质中。大花蕙兰 对基质的要求不太严格，泥炭土与蛭石的混合 物、碎陶粒、水苔都可作为基质，小苗移栽后， 只要注意保湿、通风，就能正常生长，1个月后每 周浇一次稀释的营养液，移栽成活率可达95%。 5.驯化移植 准备移栽兰花苗 （一）培养意义 美国红栌为漆树科黄栌属植物，是美国黄栌 的变种类型。该植物属珍稀种类，数量甚微，目 前，全世界主要采用嫁接的传统方法进行繁殖， 或者用扦插、根插、分株和埋干出苗等繁殖，但 这些都不能满足市场需求，并且容易传播病虫 害。 四、美国红栌的组织培养技术 1.外植体的选择与接种 2.初代培养 3.增殖与继代培养 4.壮苗与生根培养 5.驯化移植 （二）培养程序 以幼枝切段为外植体：取直径为 5 15mm的当年枝条，整理成长度为22.5cm左右 的小段。表面消毒后接种到诱导培养基上。 1.外植体的选择与接种 外植体接种到诱MS+BA0.5mL+NAA0.1mg L上，置252培养间进行培养。15d左 右即可萌发出嫩芽。 2.初代培养 将长出的嫩芽剪取下来，转接到增殖培 MS+BA1.0mgL+NAA0.1mgL上进行继代 培养，增殖系数可达到4以上。 3.增殖与继代培养 壮苗培养基为MS+BA0.25 mgL +NAA0.2 mg L上，在壮苗培养基上培养了3周4周的无根 苗的茎切割成长度为0.5cm1.0cm的切段。 壮苗培养基上小苗生长至23cm高时，转接 到生根培养基1/2MS+NAA0.2mgL上，经10d左右 茎基部切口附近即开始陆续长出不定根。再经10 15d培养，即可成为根系发育良好的完整试管 小植株。 4.壮苗与生根培养 移栽前洗净苗根部的培养基，移栽于装 有蛭石的营养钵中，然后加设小拱棚以保 湿。移栽前期将空气湿度保持在75%85%之 间，温度控制在2025，试管苗大约在1个 月左右可长出新根新叶，移栽成活率可达90% 。 5.驯化移植 我是马铃薯 （一）培养意义 马铃薯为茄科茄属，一年生喜冷凉草本块 茎植物，是世界第四大作物。由于长期的块茎 繁殖，使马铃薯的病毒危害特别严重，直接影 响其产量和品质。目前国内外脱毒种薯产量还 远远不能满足种植脱毒马铃薯的要求，在国内 脱毒薯的种植面积一般仅有当地马铃薯的10 50%，因此脱毒马铃薯的培育与繁育仍有着广阔 的市场空间。 五、马铃薯的脱毒与快繁技术 1.获取外植体材料 2.外植体消毒与接种 3.初代培养 4.无病毒苗的鉴定 （二）脱毒技术 直接从田间采下68cm的顶芽或腋芽，置实验 室的营养液中生长，23周后除去顶芽，以促使 腋芽生长，当腋芽长至12cm时，切取腋生枝作 为外植体。 可选择具有品种典型性状的薯块，在室内播于 土箱、沙箱中进行无菌发芽，叶未充分展开时就 可剪取粗壮顶芽为外植体。 1.获取外植体材料 剪取12cm长的芽，剥去易除叶片，在自来水 下冲洗1h左右，于超净工作台上进行消毒灭菌。 把消毒好的芽放在解剖镜下进行仔细剥离，剥去 幼叶和叶原基，露出圆滑的半球形生长点，用解 剖刀仔细切取带有12个叶原基的茎尖（0.2 0.3mm)，迅速接种到培养基上。 2.外植体消毒与接种 茎尖在MS+BA0.5mgL+NAA0.1mgL+2%糖（ pH5.8）的培养基、温度2125、光强2000 3000 Lx、光照时间12h/d的条件下，接种后23 周形成愈伤组织，45周出现绿色芽点，36月 长成23cm小芽。 3.初代培养 指示植物汁液鉴定 在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常用 的方法，病毒、病毒和纺锤块状病毒很容易 通过汁液来接种。 指示植物嫁接鉴定法 嫁接方法有枝条嫁接和块茎嫁接两种。 4.无病毒苗的鉴定 1.直接移栽利用块茎繁殖 把少量无病毒小苗直 接移入无虫网室的土壤中，利用产生的块茎继续繁 殖。将经过56次繁殖的无病毒块茎作一级原种供给 大田繁育体系进一步扩大繁殖。 2.扦插繁殖 把无病毒植株栽于无虫网室中，1 2月以后切顶芽作插枝。将插枝的最下面1片叶除去 ，插入经过消毒的沙壤土中，插入深度为两个节间。 维持土壤湿润，1周左右，插枝就能产生新根。 3.组织培养切段繁殖 将无病毒植株切段，每段 带一个叶片，将切段放在培养基上，在培养间里继续 培