实验九用正交法测定几种因素对蔗糖.ppt

用正交法测定几种因素对 蔗糖酶活力的影响 目的要求 1.初步掌握正交实验设计方法的使用 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值 实验原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受 多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液 的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都 能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定 的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的 酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是 单因素的简单比较法。 本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度 和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多 因素（3）的实验方法。 正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据 分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信 息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤： （1）确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳 组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度， 提高酶的活力。 （2）选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对 于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。 （3）选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的 那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有 相互独立性。 （4）确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施 ，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时 ，应考虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择 20、30 、50 三个水平。 （5）选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察 等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3 系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如有 重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。 （6）配列因素水平，制定实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的 正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。 （7）实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实 验数据。 （8）实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直 接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析 方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法 ，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。 操作方法 1.实验设计： 1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标 是酶活力。这里，用A520值表示。 2）制定因素水平表：考察四个因素（温度、 pH值、底物浓度和酶浓度），每个因素取三个 水平（如温度选择20、35 和50 三个 水平）。水平是因素变化的范围（通常是根据 专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范 围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如 表1。 表1 因素水平表 因素 水平 A 温度 （） B pH值值 C 底物浓浓度 （ml） D 酶浓浓度 （ml） 1202.50.100.02 2354.50.30.06 3506.50.60.1 Note: 各组可根据自己的设计选择相应因素的水平变化范围 如：温度的选择可为25 、35 、55 。 3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、 L27（313）、L18（366）和L27（389）。本实验不考察各 因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3 的的四个因素，故选用L9（34）表，见表2。 分析： A. 判断各因素的水平范围是否选偏； B. 判断各因素显著性大小的顺序； C. 判断实验结果的置信度。 4）实验安排:根据因素和各因素的水平条件设计实验。 （见表3） 表2 正交表L9（34）（举例） 列号 试验 号 1 （温度） 2 （pH） 3 （底物浓度） 4 （酶浓度） 11111 21222 31333 42123 52231 62312 73132 83213 93321 表3、实验安排（举例） 管号 试剂试剂 168249357 蔗糖溶液 Ml 0.10.30.60.10.30.60.10.30.6 缓缓冲液pH 体积积？ 4.0 1.88 6.0 1.64 5.0 ？ 5.0 ？ 4.0 ？ 6.0 ？ 6.0 ？ 5.0 ？ 4.0 ？ 温度 （预热预热 ） 252525353535505050 酶液 Ml 0.020.060.10.060.10.020.10.020.06 温度 5min 252525353535505050 准确反应5分钟,加0.5ml二硝基水杨酸,2.5mlNaOH,沸水浴5分钟,冷水冲3 分钟,以“0”管520nm调“0”测A值.进行极差分析，找出何种条件下酶活 力最高，影响最大的因素和最小的因素。 具体操作步骤： 1、将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于试管中。 2、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10-30ml不等），离心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4。 3、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的 倍数来确定酶的稀释倍数）A520在0.4-2.0之间即可。 4、准备10支试管。其中一支为“0”号管，作为测量时的参 比溶液。其他九支试管根据前面的图表3加入相关的溶 液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸 的方法测定不同管在A520下的光密度值。 5、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小， 表示该水平为酶反应的最适条件。 1）数据记录：将上述两组平行实验的结果取平均值后的9个 数据，填入表4中的Yi项内。 2）数据整理及分析：对于一般的实验，可用极差分析，该 分析方法简单、直观。对要求精细的实验，则要用方差分 析，该方法可给出误差的大小估计，但有一定的计算量。 对于有混合水平的正交实验，只能用方差分析。 本实验，只使用极差分析： A. 计算出各水平实验结果总和，即第1、2、3、4列上的k1 、k2、k3，并求出k1、k2、k3和k的R值（极差）。 B. 选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的顺序 ，并比较k值选出优水平组合（即好的实验条件）。 由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温 度、pH值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗 糖酶的最适温度和最适pH值。 数据记录和分析 因素 水平 A 温度 （） B pH值 C 底物浓度 （ml） D 酶浓度 （ml） 120 K1 和 R 2.5 K1 和 R 0.10 K1 和 R 0.02 K1 和 R 235 K2 和 R 4.5 K2 和 R 0.3 K2 和 R 0.06 K2 和 R 350 K3 和 R 6.5 K3 和 R 0.6 K3 和 R 0.1 K3 和 R k1、k2、k3代表各水平测量结果的总和，R代表各水平测量结果的级差。 数据的计算整理（举例） 讨 论 A.根据上述的计算结果，画出各因素的趋势图以判断各因 素的水平范围是否选偏； B.对从9次实验结果中选出的较好实验条件、根据计算比较 选出的优水平组合和综合比较后设计