医学]07 生化技术ta.ppt

生物大分子的分离、纯化、鉴定、定量技术 总 论 常用生物大分子的分离纯化技术 特殊要求的分离纯化方法 生化与分子生物学 生化与分子生物学的研究对象：生物内的分子 生 化： 所有生物体内的分子，包括糖类、脂类、蛋白质、 核酸、有机小分子等 代谢与调控 分子生物学： 最初是生物大分子，即蛋白质、核酸, 现也是所有细胞内的分子,是生物化学的高级阶段, 基因水平 分 子 医 学 分子遗传学 分子免疫学 分子病理学 分子药理学 分子毒理学 分子检验学 分子肿瘤学 分子生物学已成为工具性学科，已渗透到生命 科学领域包括医学的每一分支学科中,从这点讲 它已不是独立的学科. l诺贝尔奖近百年的历史，在91项生理学 或医学奖中有31项与生化与分子生物学 有较密切的关系，而化学奖中则有34项 相关；尤其是20世纪五十年代以来，52 的生理或医学奖和40的化学奖属于 生化与分子生物学领域，二者之和相当 于另外设立了一个生化与分子生物学诺 贝尔奖。 生物化学技术与分子生物学技术 l生物化学技术-分子的分离纯化鉴定定量 包括分光、层析、电泳、离心、超滤等 l分子生物学技术-基因、分子水平的系列操作， 把生化、微生物免疫等技术相结合形成系统， 包括PCR技术、基因克隆表达技术、分子杂 交印迹、单克隆抗体技术、RNAi技术、基因 敲除、基因诊断与基因治疗、芯片技术、 mRNA差异显示技术等 得到高质量的符合要求的研究材料是进行分子 生物学研究面临的首要问题，也是关键性的第 一步 对特定生物分子进行定性定量分析是最常用的 研究策略 .层析技术 .电泳技术 . 分光技术 .离心技术 一、常用生化分离纯化技术 1、层析技术 l基本原理 层析系统都由互不相溶的两相溶剂（固定相和流 动相）组成，利用样品各组分的物理化学性质的差异 ，使待分离的各组分以不同程度分布在两相中，以不 同速度随流动相移动，最终达到分离目的。 在一定温度下达到平衡后，某种溶质在两相中的 浓度比是个常数，称分配系数（KD），它是物种的 特征常数之一。 l 溶质在固定相中浓度 lKD= l 溶质在流动相中浓度 系统组成 l固定相（介质） l惰性支持物 l流动相（展层剂） 常见层析技术类型 l按 原 理 分 l吸附层析 l分配层析 l吸附分配层析 l离子交换层析 l分子筛层析（凝 胶层析） l亲和层析 l共价层析 按 装 置 分 柱层析 薄层层析 纸层析 液相层析 高效液相层析/色 谱（HPLC） 气相色谱 l通常把原理、装置和固定相结合起来命名： DEAE纤维素柱层析 活性碳吸附柱层析 琼脂糖凝胶层析 分辨率与分离效率 分辨率 l以层析系统的溶剂体积相对溶质浓度 作图，相邻两峰的分开程度称为分辨 率。分辨率反映了分离的效果。 l装置的形状尺寸（例如柱层析中柱的 长度、直径），以及物质的分配系数 均影响分辨率。分配系数差异越大， 则分离峰相距愈远，分辨率越高；对 柱层析而言，柱越长越细，分辨率越 高。 l 分离效率 l单位时间内分离溶质的量称分离效率 ，对柱层析来说称柱效率。分配系数 差异越大，柱越短越粗，分辨率越高 柱层析 梯度混合器 固定相不同原理不同 l吸附层析：吸附力差异 活性炭、硅藻土、纤维素、氧化铝 l分配层析：分配系数（溶解度）差异 滤纸 l离子交换层析：极性差异 离子交换树脂、羧甲基纤维素CM、DEAE l分子筛层析（凝胶层析）：分子大小 葡聚糖Sephadex和琼脂糖凝胶 Sepharose l亲和层析：专一吸附力（配基或配体、受体） 薄层层析与纸层析 l展层时分配系数不同的溶质在薄层板上 移动速率不同而得到分离 l用于小分子分离分析 原点到层析点中心的距离 迁移率Rf=- 原点到溶剂前沿的距离 萃取与分配层析不同 l甲乙物质在固定相A 、流动相B中 分配 系数不同：2、0.5 A60 B30 A40 B20 A20 B10 A26.7 B13.3 A26.7 B13.3 A6.7 B3.3 A17.8 B8.9 A13.3 B6.7 A26.7 B13.3 A2.2 B1.1 A11.9 B5.9 A24 B12 A6.0 B3.0 A0.73 B0.37 A17.8 B8.9 17.8 36 26.7 9 1.1 A30 B60 A20 B40 A10 B20 A13.3 B26.7 A3.3 B6.7 A1.1 B2.2 A6.7 B13.3 A8.9 B17.8 A0.37 B0.73 A3.0 B6.0 A12 B24 A5.9 B11.9 1.1 9.0 26.7 36 17.8 A13.3 B26.7 A13.3 B26.7 A8.9 B17.8 甲 乙 高效液相层析 lHPLC利用高压泵产生的高压力驱动流动 相流过色谱柱 l很高的柱效率（分辨率），有高压、高 速、高灵敏度、易自动化等特点，灵敏 度高达109g（紫外检测），甚至1011g （荧光检测） 梯度洗脱 装 置 高 压 输液泵 进样装置 样品 色 谱 柱 馏分装置 流动相 贮液器 数据处理系统检测 图9 HPLC的装置和操作 2、电泳技术 l带电颗粒在电场作用下向着与其电性相 反的电极移动，称为电泳。电泳技术依 据生物分子在溶液中带电性质及分子大 小、形状有差别，从而在电场中的迁移 率不同而将其分离纯化 分类 按支持介质的不同可分为 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel electrophoresis ）（PAGE） 等电聚焦电泳 按支持介质形状不同可分为： 薄层电泳 ； 板电泳（水平、垂直） ； 柱电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳（PAGE） l聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰 胺在加速剂和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作 用下交联成三维网状结构的凝胶。具有如下优点： l1、一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好 l 2、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应 l 3、对pH和温度变化较稳定 l 4、几乎无电渗作用，样品分离重复性较好 l 5、样品不易扩散，用量少，灵敏度可达106 g l 6、凝胶孔径可调节 l 7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中 等 电 聚 焦 电 泳 不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电 场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分 离。 蛋白质具有许多可解离的酸性基团（COOH ）和碱性基团（NH2）及其它基团,在一定溶 液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基 团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成 正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电 位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 NH3+ + OH NH3+ + OH NH2 P P P COOH H COO H COO 蛋白质的阳离子 蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子 l以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，两性电解质（ Ampholine）在支持物内形成稳定的pH梯度， 当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中 运动到相当于自身pH梯度中聚合成一狭窄的 区带而停留。因为Ampholine形成的pH梯度是 一较平滑的稳定的pH梯度，从理论上讲，只 要蛋白质的pI相差0.01就可分离。 l血红蛋白的pI约在6.9，细胞色素C的pI为10.5 ，两者的pI相差较大，可以得到较好的分离。 特点：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制 备有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极 易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物 大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度 、pH值、离子强度等各种影响参数对溶液中各种组成 的综合影响，很难准确估计和判断。 二、生物大分子分离纯化的操作 （ 一）破碎、裂解细胞 1、动物组织： 新鲜组织直接在冰上研磨，较坚韧的组织匀浆，冻 存组织和对核酸完整性要求高的组织用液氮研磨，加 入细胞裂解液（含蛋白酶K或胍盐、去垢剂SDS或 TWEEN、EDTA、Tris缓冲液、二巯基乙醇等) 2、动物培养细胞、动物血细胞： 离心收集、PBS洗涤，加入细胞裂解液 3、植物组织、霉菌、真菌： 石英玻璃砂或氧化铝研磨，对完整性要求高的材料 要加入液氮研磨，再加入裂解液 4、细菌： 溶菌酶、超声波、去垢剂（SDS）等 （二）基因组DNA制备 1、破碎、裂解细胞（胍、SDS等） 2、除蛋白、组织碎片：离心、酚氯仿抽提 3、除RNA： RNase（不含DNase或50C处理） 4、除盐等小分子： 乙醇沉淀，12000rpm以上离 心 5、进一步纯化，除痕量蛋白等杂质：蛋白酶K、酚氯 仿抽提、柱层析，密度梯度超离心 注意：防DNase的破坏-温度控制,冰浴或500C EDTA螯合二价离子 防机械剪切力 （三）总RNA 1、破碎细胞：胍、酚等变性剂，注意缩短组织匀浆时间 2、除核蛋白：低盐、离心 3、除少量DNA：不含RNase的 DNase 4、除多糖：12000rpm以上离心 5、除盐等小分子：乙醇沉淀 6、进一步纯化，除痕量蛋白等杂质：蛋白酶K、酚氯仿抽提、 柱层析 注意： 防RNase-RNasin，专一抑制剂（蛋白） DEPC处理水、浸泡 /1200C消毒，1800C烤 器皿胍盐中储存 氧钒核苷复合物（较难除去） 紫外分光法原理： 在260nm下，核酸（DNA、RNA）有最大吸收，这是由它们含有 的嘌呤环和嘧啶环的共扼双键系统的特性所决定的。通常每毫升1 微克的DNA钠盐溶液的光密度为0.020，每毫升1微克的RNA钠盐溶 液的光密度为0.025，所以核酸浓度与光密度值有以下关系： dsDNA（ug/ml）= OD260 * 50 ssDNA（ug/ml）= OD260 * 37 RNA（ug/ml） = OD260 * 40 OD260、/ OD280 在1 .82.2内核酸样品比较纯。 总量定量 、鉴别方法 DNA RNA PROTEIN 化学法 二苯胺法 苔黑酚法 双缩脲、Folin酚、 染色、凯氏定氮 （不需纯化） 物理法 UV260 UV260 UV280 电泳法 电泳法 电泳法 （四）质粒载体 l1、破碎细胞：NaOH、 SDS 等变性剂 l2、除核蛋白：低盐、离心 l3、除少量RNA：不含DNase 的 RNase l4、除多糖：12000rpm以上 离心 l5、除盐等小分子：乙醇沉淀 l6、进一步纯化，除痕量蛋白 等杂质：酚氯仿抽提、柱层 析、旋转柱层析、梯度离心 l注意：防开环、断开 污染核DNA片段 1 2 3 4 5 2为质粒，可见2 种构型，3为单酶切质粒 1、5为MARKER 构型：超螺旋 线状 开环 （五）特殊要求的核酸分子分离纯化方法 分离特定长度的DNA如获得目的基因、探针、PCR产物回收、酶切 后的克隆载体 1、电泳洗脱法 高分辨，普通琼脂糖有杂质，用高纯度或低熔点 电泳挖孔法 琼脂糖，或胶回收试剂盒 2、密度梯度离心法：常用介质有甘油、蔗糖、氯化铯（昂贵） 密度梯度仪 不同长度DNA停留在离心管不同高度 经密度梯度离心，样品纯度极高 3、柱层析与旋转柱层析： Sephadex-G50：去除很短核酸片段和dNTP, 纯化探针 各种提取、浓缩、分子量截留试剂盒 五、总蛋白质的分离纯化方法 1、破细胞 SDS等，超声波、低温研磨或匀浆、酶法 2、利用溶解度的特点，调节 pH、离子浓度等使蛋白质 溶解。离心 3、分级盐析 常用（NH4）2SO4 4、相分配法使蛋白与核酸分开，低盐条件下蛋白与核蛋白分 开，再调到到4M NaCl，则蛋白质在上相，核酸在下相。 5、柱层析进一步纯化 6、透析除盐、小分子 试剂盒 生化分子生物学技术在医药学中应用举例 一、PCR技术DNA片段扩增技术 1.基因诊断、分子病理（医） 临床用于检测传染病的病染体、遗传病的变异基因 、肿瘤的癌基因与抗癌基因、测定某疾病相关基因 表达水平等 2.物种鉴定、分子药理（药） 中药学上应用随机引物PCR（DNA指纹法、DNA多 态性分析） rRNA间隔区长度法分析进行昂贵地道 药材的鉴定 研究药物对疾病相关基因表达的影响 PCRPCR扩增原理扩增原理 5 5 5 5 3 33 3 变性、退火、延伸变性、退火、延伸 变性、退火、延伸变性、退火、延伸 变性、退火、延伸变性、退火、延伸 RT-PCR lmRNA逆转录为cDNA l以cDNA为模板进行目标片段的扩增 l第一步，获得模板待检测对象的细 胞内核酸（DNA、RNA） 二、基因克隆技术（重组DNA技术） 医药领域的应用： 1、基因工程制药（干扰素、胰岛素、免疫 因子、生长因子 抗菌肽、凝血因子、乙 肝疫苗、秋水仙酰胺、蛇毒等） 2、基因治疗 肿瘤：抗癌基因、自杀基因、免疫因子 、血管生长抑制因子等 逆转录 酶切 酶切 加接头 酶切 酶切 切 连接 接 转化、转导或转染 转 筛选选 （1）基因组 DNA/RNA （2）载体DNA （3）合成或 PCR 扩增 载体DNA 提 第一步，分离提纯带有目的基因的基因组 DNA、RNA或重组载体，以及提纯表达 目的基因所需要的载体 克隆的载体 l一）质粒/粘粒（COS） 质粒染色体外共价闭环双链 小分子DNA 特点：1.自我复制能力 2.松弛型高拷贝 严谨型低拷贝 3、抗性标记 4、插入失活 二）噬菌体、 三）病毒 三、分子杂交与印迹技术 （一）分子杂交 DNA或RNA的单链分子之间如果存在一 定程度的碱基互补配对关系，一定条件 下就可以在不同的分子间形成杂化双链 变性 退火 杂化双链 杂化双链 变性 退火 （二）杂交印渍技术 Dot/slot blotting Southern blotting Northern blotting Western blotting 电泳分离+特异分子显示（杂交探针、 Ag-Ab反应） 可用于特异DNA、RNA、蛋白质的定性定量检测 凝胶电泳 使核酸单链转 移到硝酸纤维 素膜（NC） 毛细管作用 电转移 真空吸引 与标记探 针进行杂 交或抗原 抗体反应 显色或 暴光 目标显出 区带，定 量 提纯 1.Dot/slot blotting l特异DNA、RNA分子通过与标记探针杂 交而显示出来，再定量 2.Southern blotting 1.基因组DNA的结构分析; 2.特异基因的突变分析 应用： 探针标记技术 用同位素、 生物素、地高 辛或荧光染料 标记末端或全 链。 3.RNA印渍技术 （Northern blotting) 原理同Southern blotting，但不需要 酶切可直接进行变性电泳、转移。 可用RT- Southern blotting取代 应用：检测特异基因表达水平。 Northern blotting RNA变性 凝胶电泳 使RNA转移到 硝酸纤维素膜 （NC） 毛细管作用 电转移 真空吸引 与探针进 行杂交 放射自 显影 显出杂 交区带 RNA 提纯 （4）蛋白质的印渍分析 蛋白质 变性 电泳 转移到 NC膜上 加入 抗体 加入标记 的二抗 显示 区带 检测 分析 免疫印迹（Western blotting) 提取总 蛋白质 SOUTHERN BLOT DNA电泳与DOT BLOT结合 NORTHERN BLOT RNA电泳与DOT BLOT结合 WESTERN BLOT 蛋白质电泳与免疫组化结合 特异mRNA、蛋白质定量方法 研究信号传递、基因表达调控、基因表达谱需要对重要的功能 蛋白或受体及其mRNA进行分离、纯化、定量。 对特异mRNA进行定量方法 1）mRNA原位杂交 2） RT-PCR 3） northern blot 、dot blot、slot blot 对特异蛋白或受体进行定量方法： 1)免疫组化 2)生物活性检测 3） western blot 生物大分子分离纯化鉴定定量技术路线的选择 高质量的原则 经济的原则 应用举例： 1、PCR检测 PCR定性：纯度要求低，允许部分降解 PCR指数放大极灵敏，要严防样品交叉污染， 裂解、离心，简单的纯化（胍酚或酚氯仿一步法） PCR定量： 灵敏度高 严防污染、降解、严防试管效应 模板要求较纯，较完整 需纯化： SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT （DOT BLOT） WESTERN BLOT 防降解 纯度、完整性要求低于RT-PCR， 灵敏度低，可靠性高 RT-PCR定量特定mRNA： 灵敏度高，可靠性低 严防污染、降解、试管效应 RNA要求较纯，较完整 不需纯化： DNA原位杂交 RNA原位杂交 免疫组化、测生物活性 防降解 不能定量（除活性测定 ） 可靠性高 2、特定分子的定量 四 、基因表达干预 l1.反义核酸技术 l用反义DNA、反义脱氧寡核苷酸、反义RNA ，与相应DNA有意义链、mRNA结合，阻抑 从DNA到mRNA到蛋白质整个表达过程。反 义寡核苷酸可与相应DNA高嘌呤区域的双螺 旋结合，形成三链，封闭RNA聚合酶而抑制 转录，被称为三链技术。 l2.核酶技术 l是一种特殊的反义RNA，但它除了封闭基 因表达外还有催化作用，可与互补的 mRNA结合然后把它切割，切割不断反复 进行，从而破坏翻译的模板，抑制靶基因 表达。 l3.RNA i（RNA interference）技术 l一般是指利用与靶基因互补的双链RNA片 段抑制阻断靶基因表达。 RNA i（RNA interference）技术产生 l1998年，Fire等发现双链RNA对同源靶基因表 达的特异阻抑效应比单链反义RNA、单链有 意义RNA强得多，把这种作用的双链RNA片 段命名为RNAi。较长的RNAi可诱发干扰素系 统和非特异阻抑效应，造成广泛的转录后基因 沉默效应（PTGS），对哺乳动物来说，大于 30bp RNAi就可产生非特异效应。所以用于人 类基因治疗的RNAi小于30bp。 RNAi诱导PTGS的原理 l小分子量的RNA片段 lds RNA（小于30 bp） l 转染细胞 l 特异核酸酶Dicer切割， ATP l22nt siRNA l 与核酸酶复合物结合