微生物的分类和鉴定.ppt

第十章 微生物的分类和鉴定 1 什么是微生物分类学 (microbialtaxonomy): 按照微生物的亲缘关系将 其安排成条理清楚的各种 分类单元和分类群的科学 微生物分类的目的 把各种微生物按照它 们的亲缘关系分群归 类，排成系统，以便 于人们对微生物进行 鉴定和交流 2 生物界的分类 地球上的物种估计大约有150万，其中微生物 超过10万种，而且其数目还在不断增加。 在生物进化历史过程中演化形 成生物种类和种群的多样性。 生物分类就是通过研究生物的系统发育及其进化 历史，揭示各类生物的多样性及其系统关系，编 制分类系统，还原生物的自然历史位置。 3 微生物分类学的三个任务：分类、鉴定及命名 分类是根据微生物的相似性和亲缘关系，将微生物归入不同的分类类群。 鉴定是确定一个新的分离物属于已经确认的分类单元的过程。 命名是根据国际命名法规给微生物分类单元以科学的名称。 4 第一节：通用分类单元 一、种以上的系统分类单元 界、门、纲、目、科、属、种 种是最基本的分类单位 每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目 、亚科. 5 界 门 纲 目 科 属 种 6 种（species）：是一个基本分类单位；是一大群表型特征高度 相似、亲缘关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株 的总称。 菌株（strain）: 表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的 纯种群体及其一切后代（起源于共同祖先并保持祖先特性的一组 纯种后代菌群）。因此，一种微生物的不同来源的纯培养物均可 称为该菌种的一个菌株。菌株强调的是遗传型纯的谱系。 例如：大肠埃希氏杆菌的两个菌株： Escherichia coli B 和Escherichia coli K12 菌株的表示法： 种是分类学上的基本单位，菌株是实际上应用的基本单位，因为同一菌 种的不同菌株在产酶上种类或代谢物产量上会有很大的不同和差别！ 7 新种（species nova，sp.nov或nov sp.）是指权威 性的分类、鉴定手册中从未记载过的一种新分离 并鉴定过的微生物。当发现在按国际命名法规 对它命名并在规定的学术刊物上发表时，应在 其学名后附上“sp.nov”符号。在新种发表前，其模 式菌株的培养物就应存放在一个永久性的可靠的 菌种保藏机构中，并允许研究人员取得该菌种。 中国希瓦氏菌Shewanel lacinica sp.nov. （许玫 英等，微生物学报，2004，44(5):561-566） 8 以啤酒酵母为例，它在分类学上的地位是： 界(Kindom)：真菌界 门(Phyllum)：真菌门 纲(Class)：子囊菌纲 目(Order)：内孢霉目 科(Family)：内孢霉科 属(Genus)：酵母属 种(Species)：啤酒酵母 9 学名是微生物的科学名称，它是按照有关微生物分类国际委员 会拟定的法则命名的。学名由拉丁词、或拉丁化的外来词组成。 学名的命名有双名法和三名法两种。 双名法： 学名=属名+种名加词+（首次定名人）+现定名人+定名年份 属名：拉丁文的名词或用作名词的形容词，单数，首字母大写 ，表示微生物的主要特征，由微生物构造，形状或由科学家命 名。 种名：拉丁文形容词，字首小写，为微生物次要特征， 如微生物色素、形状、来源或科学家姓名等。 二、微生物的命名 必要，用斜 体表示 可省略，用 正体字 微生物的名字有俗名和学名两种。如 ： 红色面包霉粗糙脉孢霉 绿脓杆菌铜绿假单胞菌 10 例：大肠埃希氏杆菌 Escherichia coli （Migula）Castellani et Chalmers 1919 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus Rosenbach 1884 当泛指某一属微生物，而不特指该属中某一种（或未 定种名）时，可在属名后加sp.或ssp.（分别代表 species 缩写的单数和复数形式） 例如：Saccharomyces sp. 表示酵母菌属中的一个种。 华癸根瘤菌 Rhizobium huakuii Rhizobium huakuii，Chen 1991 11 菌株名称在种名后面自行加上数字、地名或符号等，如： Bacillus subtilis AS1.389 AS=Academia Sinica Bacillus subtilis BF7658 Clostridium acetobutylicum ATCC824 丙酮丁醇梭菌 ATCCAmerican Type Culture Collection美国模式菌种保藏中心 当文章中前面已出现过某学名时，后面的可将其属名缩写成13 个字母。 如：Escherichia coli 可缩写成 E.coli Staphylococcus aureus可缩写成 S. aureus 三名法：用于对亚种的命名，这时在属和种名后加写一个 subsp.，然后再附上亚种名称（斜排体）。 如： Bacillus thuringiensis subsp. galleria 苏云金芽孢杆菌腊螟亚种 12 第二节 微生物在生物界的地位 在人类发现微生物并对它们进行较深入的研 究之前，只能把一切生物简单地分成似乎 截然不同的两大界动物界和植物界； 从19世纪中期起，随着人们对微生物认识 的逐步深化，生物的分界就历经三界、四 界、五界甚至六界等过程，最后又提出了 一个崭新的“三域”学说。 13 从两界系统经历过三界系统、四 界系统、五界系统甚至六界系统 ，最后又有了三原界（或三总界 ）系统。 传统的、为多数学者所接受的是 1969年魏塔克（R.H.Whittaker） 在Science上提出的五界学说 ，它以纵向显示从原核生物到真 核单细胞生物再到真核多细胞生 物的三大进化过程。 生物的界级分类学说 14 三域学说: 细菌域、古生菌域、真核生物域 。主要特点比较见表10-3。 15 1 Bergey氏原核生物分类系统纲要 伯杰氏系统细菌学手册 (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology) 伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特 点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定 所需做的实验的具体方法。2001年分5卷陆续发行。 （1994第9版） 2 真菌分类系统 真菌界分类系统很多，各国采用不同的系统，比较混 乱。近年来为较多人接受的是Ainsworth的纲要（ P343）。 第三节 各大类微生物的分类系统纲要 16 第四节：微生物分类鉴定的方法 5个水平： 细胞的形态与习性水平。 细胞组分化学水平。 蛋白水平。 核酸水平。 数学统计学或计算生物学水平。 17 一、微生物分类鉴定中的经典方法 生物分类的传统指标：形态学特征、生理、生化特征、 生态学特征、生活史、血清学反应、对噬菌体的敏感性， 其它。它们从不同层次(细胞的、分子的)，用不同学科(化 学、物理学、遗传学、免疫学、分子生物学等)的技术方 法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物 ，从中发现的反映微生物类群特征的资料。在现代微生物 分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有 分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。 18 形态学特征、生理学特征、 生态学特征 生物分类的传统指标： 1、形态学特征培养特征、 运动性、特殊的细胞结构、 细胞形态及其染色特性、 等等 微生物分类和鉴定的重要依据之一： a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 形态结构的细菌； b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对 的稳定性； 19 2、生理生化特征 与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关； 代谢产物等 营养类型；与氧的关系；对温度的适应性； 对pH的适应性； 对渗透压的适应性； 酶及蛋白质都是基因产物； 对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较； 测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多； 20 常借助特异性的血清学反应来确定未知菌种、亚种 或菌株。 生态特性 包括在自然界的分布情况，与其他生物有否寄生或共生关 系, 宿主种类及与宿主关系, 有性生殖情况, 生活史等。 生活史 对噬菌体敏感性 血清学反应 21 3、微生物的快速鉴定和自动化分析 技术 微量多项试验鉴定系统（简易诊检技术，数码分类 鉴定法）： 针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反 应底物、试剂等，分别微量(约0.1ml)加入各个分 隔室中(或用小圆纸片吸收)，冷冻干燥脱水或不 干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检 测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养2- 48小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定 试验结果，用此结果编码，查检索表(根据数码分 类鉴定的原理编制成)，得到鉴定结果，或将编码 输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软 件鉴定，打印出结果。 22 API细菌数值鉴定系统 Enterotube系统 Biolog全自动和手动细 菌鉴定系统 23 微生物鉴定系统及其反应原理 系统反应分析阳性结果显示系统例子 pH基础反应 （多为15 24hr） 碳源利用 pH指示剂颜 色变化；碳 源产酸、氮源产碱 API;Crystal;VIT EK;Micro Scan 酶谱（多为2 4hr） 微生物已 有的酶 无色复合物被适当酶水解 时，色源/荧光源释放引 起颜色变化 Micro Scan; IDS(Remel) 碳源利用有机产物因转移电子至无色四氮唑 标记 碳源使染料变为 紫色 Biolog 挥发 或非挥 发酸检测 细胞脂肪 酸 以检测 代谢产 物为基础 的层析技术，与数据库中 的资料相比较 MIDI 生长可见检 测 不同底物 微生物利用某一底物产生 浊度 酵母样菌鉴定 24 核酸的碱基组成和分子杂交 特点：与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基 组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微 生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。 （1） DNA的碱基组成(G+Cmol%) DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突 变，碱基组成也不会发生明显变化。 分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表 示各类生物的DNA碱基因组成特征。 二、微生物分类鉴定中的现代方法 25 每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴 定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大，因此更 适合于细菌的分类鉴定。 26 GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检 验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。 使用原则： G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定 每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物， 它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含 量差别大表明它们关系远。 但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有 近的亲缘关系。 27 同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下；同属不同 种的差别应低于1015%；G+C含量已经作为建立新的微生物分 类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重 要意义。 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果 其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15% 则肯定不是同一个属。 在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C 含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。 其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特 征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。 G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定 28 (2) 核酸的分子杂交 不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的 远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反 之亦然。 核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA碱 基排列顺序的相似性 a）DNA-DNA杂交； （亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较） b）DNA-rRNA杂交； （亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较） c）核酸探针； （利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定） 29 2. 核酸分子杂交法 遗传分类法 30 4.rRNA寡核苷酸编目分析 遗传分类法 一种通过分析原核或真核细胞中最稳定的rRNA 寡核苷酸序列同源行程度,乙确定不同生物间的亲 缘关系和进化谱系的方法 31 RNA作为进化的指征 16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”： 1）rRNA具有重要且恒定的生理功能； 2）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度 保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各 类生物亲缘关系的研究； 3）16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析； 4）rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)，也易于提取； 5）16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同 源分子是18SrRNA)。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。 (3) 16SrRNA或18SrRNA的核酸序列分析 32 33 细胞化学